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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流中国农业大学博士研究生学术新人奖.精品文档.中国农业大学博士研究生学术新人奖申 请 表院系名称 资源与环境学院 申请人 王兴 指导教师 孙振钧 联系电话 62732942 电子信箱 swangxing 填表时间 2010-7-8 中国农业大学研究生院制表2010年7月指导教师简况姓名孙振钧出生年月1956.10最高学位博士职称教授职称评定时间1997学位授予学校及国别南斯拉夫Novi Sad大学一级学科生物学二级学科生态学研究方向蚯蚓抗病机理与生态免疫是否院士 是 否指导的博士生是否得过国家优博是 否指导的博士生是否获得过北京市优博 是 否学
2、术兼职（限填三项）中国蚯蚓产业技术创新战略联盟秘书长美国俄亥俄州立大学客座教授美国应用土壤生态学杂志编委代表性学术成果（限填五项）1.主持完成的蚯蚓抗菌肽研究于2005年5月通过教育部专家组的鉴定2.主持完成蚯蚓生物反应器研制与多功能生物有机肥料和菌肽饲料添加剂生产于2005年通过教育部专家组鉴定3.一种蚯蚓抗菌肽的生产方法（专利号：ZL00136778.1）4.一种蛋白质酶解生物反应器（专利号：ZL002375362）5.一种蚯蚓生物反应器（专利号：ZL02208871.7）在研科研项目国家自然科学基金基于免疫组学的蚯蚓抗菌免疫蛋白质应激机理与系统进化（编号：30770275）“十一五”86
3、3计划蚯蚓及活性蚓粪对污染土壤重金属原位钝化修复（编号：2007AA10Z407）申请人简况姓名王兴学号B08020134专业生态学民族汉出生年月198410入学时间2008.9本科毕业学校淮北师范大学毕业时间20057本科专业生物科学硕士毕业学校安徽大学毕业时间2008.7一级学科二级学科研究方向生物学生态学生理生态博士学位考生类别硕博连读 提前攻博 直 博 统一考试 攻读博士学位方式脱产攻读 在职攻读 博士学位论文情况博士学位论文开题题目，选题、学术意义、创新性、预期的研究成果作简要说明（表格空间不够，可加页）镉与E.Coli O157:H7诱导蚯蚓差异蛋白质组学及差异表达基因研究1. 选
4、题背景随着工业的发展，土壤生态系统已受到严重的污染，主要有化学污染（重金属）和致病性微生物（致病菌）的污染。蚯蚓作为土壤系统中生物量最大的物种。蚯蚓长期生活在重金属和病原菌丛生的环境，缺极少得病，其体内必然有独特的抗菌与免疫系统。本课题组的前期工作：中国农业大学的孙振钧教授自1986年进行蚯蚓生物学和生态学及应用的研究。先后承担国家和省部级与蚯蚓有关的课题研究12项。两项成果获得省部级科技进步二等奖。获得国家发明专利5项。1999年以来，主持的与蚯蚓抗菌肽与免疫诱导有关的课题就有5项：蚯蚓生态免疫系统与功能分工（国家自然科学基金项目，30470220）；蚯蚓抗菌肽的定向诱导与生态调控机理（国家
5、自然科学基金, No 30270195，20032005）；饵料诱导下蚯蚓择食行为与蚯蚓活性蛋白关系与机理 （国家自然科学基金；No 39770105，19982000）；应激蚯蚓抗菌肽的产生、特性及蚯蚓的生态适应性机理（博士点专项基金，20022004）；蚯蚓抗菌肽的饵料诱导与调控机理（博士点专项基金，19992001）。蚯蚓抗菌肽的主要研究成果：孙振钧（1995）首先通过超滤分离-分子筛柱层析-离子交换柱层析-脱盐等步骤，从蚯蚓匀浆液中初步分离纯化出一种抗菌四十肽，证明了蚯蚓抗菌肽的存在，并对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）的抗菌机制做了一些研究。这种蚯蚓抗菌肽的理化性质比较稳定
6、，pH为3，5，7，9，11时对抗菌物质的活性影响很小，热稳定性较高，且在室温下放置180天仍具有抑菌活性。根据蚯蚓抗菌肽的理化性质和生物学特性，孙振钧创立了简便高效的蚯蚓抗菌肽制取方法，获得国家发明专利（ZL00136778.1）。本课题组自1995年首次从蚯蚓(Eisenia fetida)体中证实蚯蚓抗菌肽的存在并分离出一种具有广谱抗菌作用的酸性四十肽后，利用本实验室创立的蚯蚓抗菌肽制取专利技术，相继从蚯蚓的组织、体腔液和体表粘液中分离纯化出另外6种抗菌肽。本实验室根据已经发现的几种抗菌寡肽的结构特点，首次提出了蚯蚓抗菌肽的一个新家族- vermipeptides family。该抗菌肽
7、族具有Ala-Met-Val-Ser-Gly 的5-7个氨基酸组成，以抗细菌为主。张希春等（2002）从蚯蚓 Eisenia fetida 匀浆液中得到了两种新的抗菌肽F-1与F-2。F-1与F-2的精确分子量分别为535.27 Da和519.27 Da，具有较高的同源性，N端均被乙酰基所封闭，N端的3个氨基酸残基相同。虽然F-1的C端是两个丝氨酸残基，而F-2是甘氨酸和苏氨酸残基，但丝氨酸、甘氨酸和苏氨酸都是不带电荷的极性R基氨基酸。F-1与F-2有高效广谱的抗菌活性，并且对胃癌细胞MGC803都有杀伤作用（P0.05）。研究结果表明蚯蚓（Eisenia fetida）拥有多种抗菌成分，分布
8、于不同的分子量范围，这有利于蚯蚓对抗各种外来微生物的侵袭。刘艳琴（2003）利用改进的诱导提取法从蚯蚓体腔液中分离纯化出一种全新的抗菌寡肽ECP5-1。利用C18 HPLC测定了ECP5-1的纯度，结果其峰面积达90.27%，ECP5-1已经达到了高压液相级纯度。MALDI法测定ECP5-1的分子量为510.8Da；MS/MS分析ECP5-1的氨基酸序列为Ala-Cys-Ser-Ala-Gly。ECP5-1对绿脓杆菌的MIC为16.5mg/L，无溶血特性。研究还发现抗菌寡肽ECP5-1中含有一个半胱氨酸。初步证明了抗菌机理可能有两种解释，一种是寡肽直接进入细菌内，影响其复制合成，另一种是多个寡
9、肽通过半胱氨酸间形成二硫键，从而以多聚体形式与细菌膜结构相互作用形成穿孔，使细菌内溶物外流而导致细菌死亡。王冲（2005）探讨了体表粘液在蚯蚓抗菌生态免疫系统中的作用，经过Sephadex G-75，G-50，G-25三步层析从蚯蚓的体表粘液中分离到抗菌肽粗品ESP，再经过反相高效液相色谱纯化后，得到了一种由16种氨基酸的50个残基组成、分子量为5814.32的全新的蚯蚓抗菌肽ESP-1。ESP-1对大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为：6.25mg/mL，12.5mg/mL；50mg/mL。并探讨了体腔液中不同组分的抗菌蛋白在蚯蚓抗菌生态免疫系统中的协同作用，证明分子量在4
10、000-1000时，对大肠杆菌的抗菌活力最强，分子量大于10000时，对绿脓杆菌的抗菌活力最强，在10000-4000时，对金黄色葡萄球菌的抑菌活力最强，而分子量小于1000时，对三种细菌都有抑菌活力。而分子量在10000-4000溶菌活力最强，并且分子量在4000-1000时，都没有溶菌活力。刘雪连（2008）以赤子爱胜蚓为研究对象，从个体、组织、细胞、基因水平研究蚯蚓对E.coli O157:H7的作出的生理生态反应，揭示蚯蚓应对E.coli O157:H7的生态防御效应与分子机制，为E.coli O157:H7污染的防治提供一条新的途径。研究了蚯蚓对人工土壤中E.coli O157:H7
11、的数量的影响。结果表明在不影响自身存活率的情况下，蚯蚓可以有效的降低E.coli O157:H7的数量。探讨了皮肤和肠道免疫屏障在抵御E.coli O157:H7污染中的作用。皮肤作为蚯蚓防御病原菌侵袭的第一道屏障，通过角质层的加厚，环肌层厚度的减少，分泌细胞的增多与排空，溶酶体和过氧化物酶体的产生抵御E.coli O157:H7的侵袭。研究了Hsp90、识别因子CCF和抗菌蛋白Lumbricin 编码基因的表达水平的变化情况，结果表明赤子爱胜蚓通过CCF识别E. coli O157:H7的表面抗原，启动体内的抗氧化防御系统、酚氧化酶原激活系统、抗菌免疫系统共同抵御E. coli O157:H
12、7污染。证实了蚯蚓体内存在可以抑制E.coli O157:H7生长的抗菌肽，并对抗菌肽的作用机理进行了初步的研究。结合抗菌肽的分子量特点，利用盐析、透析和超滤技术分离纯化蚯蚓匀浆液中的抗菌蛋白，结果表明30%60%饱和度分子量小于4 KDa的组分可以有效抑制E.coli O157:H7的生长；通过反向高效液相色谱制备技术获得ELP1、ELP2两个抗菌肽组分。研究结果初步表明ELP1、ELP2通过增加细胞壁的通透性，在细胞膜上打孔使内容物渗漏达到抑制E.coli O157:H7生长的作用。证实了蚯蚓对粪便资源化利用的产物-蚯蚓粪中存在可以抑制E.coli O157:H7生长的益生菌株。利用选择性
13、培养的方法分离得到对E.coli O157:H7生长具有抑制作用的LS-2、LS-3、LS-4，并初步鉴定为短乳杆菌属（Lactobacillus brevis）、魏氏利斯特菌属（Listeria welshimeri ）、乳酸片球菌属（Pediococcus acidilactici），并证实培养温度和初始pH对抑菌效果具有显著影响。LS-2作用于E.coli O157:H7的最佳温度为40，起始pH偏酸情况下抑菌效果显著； LS-3 与LS-4作用E.coli O157:H7的最佳温度为30，最佳起始pH为 7.5。学术意义：在农业生态系统和生态毒理学中，蚯蚓正被作为环境污染的指示生物（P
14、irooznia, 2007）。重金属对蚯蚓的生长、生殖、生理、代谢、染色体等影响已有大量研究。但从分子水平研究重金属对蚯蚓的影响报道较少（Brulle F., 2008），致病菌E.Coli O157:H7对蚯蚓分子水平相关研究甚少。在几亿年的进化过程中，蚯蚓为了适应不利环境，其体内必然有独特的抗菌与免疫系统。自然选择发生在生命系统的不同层次，促进了蛋白质水平的结构和功能分化，基因是生态进化的分子基础，蛋白质是生命活动的主要执行者，只有透彻分析免疫相关基因和蛋白质的整合作用，才能深入研讨蚯蚓生态适应的分子机理。蚯蚓免疫的分子机理还不清楚，目前研究重点主要集中在少数几个基因和蛋白（肽）的研究上
15、，未能从基因和蛋白表达的整体水平研究蚯蚓免疫机制。本研究旨在通过分离鉴定蚯蚓免疫相关基因和蛋白，初步揭示蚯蚓免疫相关基因和蛋白的种类数量，为进一步开展蚯蚓免疫基因的表达调控提供理论基础和技术体系，为通过基因工程生产抗菌肽提供候选基因。本研究确立以“重金属、细菌诱导蚯蚓差异蛋白组学与抗菌蛋白基因克隆表达研究”为实验内容，集差异蛋白质组学、mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）和抑制消减杂交技术（SSH）等研究方法，从而建立高通量、较为完整的蚯蚓蛋白质组学研究平台，为今后开展大规模的蚯蚓蛋白质组学研究工作奠定了良好的基础。随着后基因组学时代的到来，研究细胞内全部蛋白质的动态表达及其相互关系的蛋白
16、质组学成为后基因组学时代的热点。蛋白质组学技术给蚯蚓抗菌免疫蛋白的研究带来了新的方法和机遇。蚯蚓蛋白质组学的研究成为深入阐明蚯蚓适应于病原菌丛生环境机制的重要途径。而且在不同环境和不同组织，生物体所表达的蛋白质是不同的，特殊基因的表达决定了差异蛋白质的功能。对这些差异蛋白质进行鉴定，可以确定与生理活动相关的基因，从而阐明基因的功能。本项目无疑对蚯蚓免疫蛋白的深入研究具有重要的理论和实际意义。创新性：利用经典差异蛋白质组学技术（2-DE+MS/MS）结合最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）和抑制消减杂交技术（SSH）分离抗菌免疫相关蛋白基因并利用分子
17、生物学方法对相关基因进行鉴定、克隆；利用Northern杂交、定量PCR和Western Blot相结合的方法对抗菌免疫相关基因蛋白表达量变化进行定量分析，RNAi技术先封闭候选基因的表达，然后再激活，通过前后蚯蚓表型的变化，鉴定候选基因的功能，RNAi将大大促进蚯蚓基因功能的研究。预期研究结果：（1）确立蚯蚓应对重金属Cd和致病菌E.coli O157:H7免疫相关蛋白质和基因的表达谱，筛选鉴定相关蛋白质点100150个；鉴定Cd和致病菌E.coli O157:H7诱导蚯蚓的免疫相关差异表达基因，为开发抗菌肽产品用于防治E.coli O157:H7引起的疾病；（2）成果在整体上达到国际先进的
18、水平，某些方面国际领先。力争在蚯蚓应对Cd和致病菌E.coli O157:H7的防御效应与分子机制方面有新的突破；（3）SCI收录的文章不少于3篇，累计影响影子大于10。已取得的科研成果（含本科、硕士、博士期间）成果或专利名称刊物、出版社或授权单位发表、出版或授权时间作者排名（如导师是第一作者请注明）刊物级别影响因子Protein extraction from the earthworm Eisenia fetida for 2-DE.PROTEOMICS2010第一SCI5.041Characterization of genes expressed in response to cadm
19、ium exposure in the earthworm Eisenia fetida using DDRT-PCREcotoxicology and Environmental Safety2010Accept第一SCI2.674Analysis of the earthworm Eisenia fetida proteomes during cadmium exposure: An ecotoxicoproteomics approachPROTEOMICS2010Revision第一SCI5.041安徽省第六届自然科学优秀学术论文二等奖安徽省科学技术协会安徽省科学技术厅安徽省人力资源和
20、社会保障厅2010第二导师第一遮荫对半夏块茎鲜重及其内源激素的影响核农学报2008第一核心期刊水杨酸对高温胁迫下半夏叶片光合作用及叶绿素荧光的影响中国药学杂志2008第二导师第一核心期刊聚乙二醇对望江南种子萌发的影响中草药2009第二导师第一核心期刊水杨酸对高温胁迫下半夏抗氧化系统的影响中国中药杂志2008第二导师第一核心期刊水杨酸对高温胁迫下半夏幼苗内源激素含量的影响西北植物学报2009第二导师第一核心期刊遮荫对半夏光合特性的影响中国中药杂志2008第二导师第一MEDLINE收录地黄光合特性研究中国中药杂志2008第二导师第一核心期刊说明：一、刊物级别请注明是否为核心期刊。同时请申请人准备好
21、以上成果的刊物封面、目录及论文摘要及首页复印件；专著封面和版权页复印件；获奖证书及专利证书复印件。以上各科研成果复印件请按序装订。二、申请人还需提交本科阶段成绩单、硕士阶段成绩单及博士在学成绩单。三、以上复印件均以A4页面复印。申请人主持或者参加过的科研项目情况项目名称项目编号项目来源项目起止年月项目主持人蚯蚓抵御土壤不同大肠杆菌的免疫基因差异与分子适应机理kycx09068中国农业大学研究生科研创新专项2009-2010王兴基于免疫组学的蚯蚓抗菌免疫蛋白质应激机理与系统进化30770275国家自然科学基金2008-2010孙振钧蚯蚓及活性蚓粪对污染土壤重金属原位钝化修复（编号：）2007AA
22、10Z407“十一五”863计划2007-2010孙振钧获得资助后研究计划及预期成果（如表格空间不够，可加页）研究计划1研究内容（1）重金属Cd应激条件下蚯蚓差异基因表达的比较应用mRNA差异显示（DDRT-PCR），研究重金属Cd诱导蚯蚓差异表达基因。该部分研究结果已投稿Ecotoxicology and Environmental Safty，目前在进行接收前的最后小的修改。（2）不同大肠杆菌应激条件下蚯蚓差异基因表达的比较应用抑制消减杂交技术（SSH），比较研究蚯蚓抵御致病菌E.coli O157:H7基因差异表达；结合Northern杂交和荧光定量PCR对差异基因的表达水平进行分析。数
23、据整理中。（3）应激条件下蚯蚓差异蛋白质组学研究利用双向电泳和质谱技术研究人工土壤Cd和致病菌E.coli O157:H7诱导蚯蚓前后进行比较蛋白质组学研究，揭示蚯蚓应激的蛋白质表达谱，以期获得与抗菌免疫相关的较为重要的应答蛋白，结合Western Blot对蛋白表达水平进行分析，从蛋白水平上验证蚯蚓应激机制。已完成，数据整理中。相关结果已投稿Proteomics，第二轮的审稿中。（4）RNAi对相关差异表达基因进行功能初步研究RNAi技术先封闭候选基因的表达，然后再激活，通过前后蚯蚓表型的变化，鉴定候选基因的功能。2 研究目标寻找蚯蚓抗菌免疫相关基因和蛋白，从基因和蛋白水平阐明蚯蚓抵御土壤重
24、金属Cd和致病菌E.coli O157:H7的分子适应机理。建立适合于蚯蚓的RNAi技术。3 进度安排2010.07-2010.09 整理前期试验结果，撰写文章。2010.09-2010.10 RNAi目标序列的选取和siRNA的制备；2010.10-2011.01 siRNA筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子；2010.01-2010.03 siRNA的转染，转染条件的优化；饲喂不同剂量siRNA对蚯蚓表型的影响；2010.03-2010.05数据整理，撰写文章；提交总结报告。预期研究结果（1）从基因和蛋白水平阐明蚯蚓抵御Cd和致病菌E.coli O157:H7的生态适应机理，
25、筛选出蚯蚓免疫相关基因和蛋白。（2）RNAi验证候选基因功能。（3）在SCI期刊上发表文章3篇以上，累计IF10以上。申请人承诺我保证本申请表内容的真实性。如果获得教育部博士研究生学术新人奖资助，我将严格遵守教育部、国务院学位委员会及学校的相关管理规定；发奋学习，刻苦钻研，积极投身于高水平科学研究和创新研究，努力完成研究计划。若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 申请人（签名）： 2010年 月 日导师推荐意见(包括对博士生思想品德、学风、业务能力、学习成绩、外语水平和科研潜力的总体评价)王兴同学一贯忠实于科学事业，热爱祖国，热爱人民，关注百姓疾苦，关注社会进步，具备优良的思想品德，团结友善，尊敬师长，乐于助人，学习勤奋，工作认真，吃苦耐劳等特点体现该同学具有良好的道德修养。该同学以极大的热情投身于科学研究的事业，治学严谨，努力扎实。在过去的学习与科研中体现出刻苦、忘我的精神。学习成绩优秀，外语水平扎实，具有超常的科研创新能力，博士论文已取得令人鼓舞的进展，目前已发表1篇IF超过5的文章。其它2篇待发表。预计年底前发表。总IF达12.75。 导师签字： 2010年 月 日学院推荐意见学院主管院长签字：学院盖章： 2010年 月 日 学校审定意见负责人签字： 2010年 月 日