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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流script稿子.精品文档.天津农学院课 程 论 文产锰过氧化物酶菌株的筛选,诱变选育及固体发酵条件优化Studies on Screening with Laser mutagenesis and OPtimi2ayion of Solid Fermentation of Conditions of Manganese Peroxidase High Producing Fungi 学生姓名 陈虹宇 二级学院 农学与资源环境学院 系 别 生物技术系 专业班级 2014级生物技术专业1班 指导教师 黄亮 成绩评定 2014年11月目 录中文摘
2、要1英文摘要21 绪论1.1 木质素的生物降解1.2 黄抱原毛平革菌简介1.3 锰过氧化物酶(MnP)的基本特性及作用机理1.4 微生物原生质体技术2 材料与方法2.1 实验材料与仪器2.1.1 实验材料2.1.2 培养基2.1.3 试剂与药品2.1.4 主要仪器2.2 菌种的筛选及鉴定2.3 菌株诱变选育2.3.1 原生质体的制备2.3.2 原生质体的再生2.4 He-Ne激光对原生质体诱变作用2.4.1 激光诱变2.4.2 诱变效果分析2.4.3 酯酶同工酶分析2.5 固态发酵条件优化2.5.1 菌种的活化与驯化2.5.2 固态发酵培养基的优化2.5.3 固态发酵条件的优化3 结果与讨论3
3、.1 高产MnP菌株的筛选及菌种鉴定3.2 菌株的诱变选育3.2.1 原生质体的制备和再生3.2.2 激光辐照原生质体3.2.3变异株的选育及鉴定3.3发酵条件的优化4 实验结论5 本文进一步需解决的问题参考文献摘 要木质素是地球上廉价、丰富的可再生资源,其生物降解是自然界碳素循环关键的-步,但由于它是-种高度复杂的、不定型的芳香环聚合物,很难被降解,因此给全球造成了严重的环境污染。由于传统的物理和化学方法并不能从根本上解决这-问题,生物技术便成为环境界和生物界愈发关注的新生力量。如何利用微生物产生的木质素降解酶系来分解和转化木质素成了新的研究课题,并引发了-轮又-轮的研究热潮。由于从自然界筛
4、选出的黄抱原毛平革菌其产锰过氧化物酶(Manganese Peroxidase, MnP)较低,无法直接应用于生产实践,故对黄抱原毛平革菌进行改良,使其获得更高的酶活是广泛应用的前提。同时,迄今为止,大多关于黄抱原毛平革菌发酵的研究多为液体发酵,成本较高且对环境条件有-定要求,无法有效应用在大规模生产中。因此,对黄抱原毛平革菌的固体发酵条件进行研究更具有重要的现实意义。本文通过筛选高产菌株，通过激光诱变等多次实验探寻出了固体发酵优化最佳方案。关键词: 高产锰过氧化物酶菌株；筛选；激光诱变；固体发酵ABSTRACT Lignin is a kind of inexpensive and affl
5、uent renewable on the earth. The biodegradation of lignin is the pivotal step in the circulation of carbon in nature. However, due to it extremely complicated and indefinite structure, such polymer is hard to be degraded. Consequently, serious environment pollution has been resulted in around the wo
6、rld. Traditional ways, both physical and chemical, can not resolve this problem effectively and thoroughly. In such conditions, biotechnology is an optimum choice for scientists. In recent years, most studies related to lignins catabolic en2ymes have been focused on white-rot fungi and Phanerochaete
7、 chrysosporium has been regarded as mode fungus. Yet, the MnP Produced by natural strains exhibit low activity, while has been restrict its practical use in production. In such a case, finding a new way to improve strains MnP activity is in urgent demand and its the base of widely application. Whats
8、 more, so far, most studies on fermentation of Phanerochaete chrysosporium have been concentrated on fluid fermentation, which is highly cost and has strict requirements of circumstances. Thus, making studies on Phanerochaete chrysosporium solid fermentation is of practical importance.Key words: hig
9、h producing MnP fungi; screen;laser mutagenesis;solid-fermentation产锰过氧化物酶菌株的筛选,诱变选育及固体发酵条件优化陈虹宇（天津农学院 生物技术系）1 绪论1.1 木质素的生物降解作为绿色植物细胞的胞间层和次生壁之间的主要填充物,木质素在木材中的含量仅次于纤维素,约为25%-30%,是自然界中唯-能提供可再生芳基化合物的非石油资源。它在植物体中起着结构支持、水分疏导以及增强抗病虫害能力等作用。从结构上看,木质素是由苯基丙烷单元通过醚键和C-C键连结聚合而成的近似球状的芳香簇高聚体,-般含有松柏醇、芥子醇和对香豆醇三种不同类型的
10、苯基丙烷单体，但不同的植物在不同的生长时期以及在不同的部位上含有的木质素结构也会另有差异。由于这三类醇的共聚化产生了不均匀的、无旋光性的、交叉键合的、高度分散性及高度抗生物降解性的芳香高聚物,木质素对绝大多数微生物的攻击均有抗性。此外,由于其不含易水解的重复单元,亦不受水解酶的控制。因此,木质素的分解相对较慢，在植物完整的木质组织中,以物理屏障的形式存在的木质素包围着纤维素,保护纤维素免遭微生物和降解酶的破坏，故而纤维素的降解也必须以木质素降解为基础。这-特点使得木质素降解成为地球上碳素循环的限速过程,在碳素循环及植物纤维素材料有效利用中占有非常重要的地位1。自然界中,木质素的有效降解依赖于很
11、多真菌、细菌以及相应微生物群落的共同作用。其中,细菌的作用是使木质素在-定程度上发生变性,成为水溶性聚合物,却无法将木质素矿化为CO22。相对细菌,真菌的降解作用则更为明显,主要包括:白腐菌(white-rot fungi)、褐腐菌(brown-rot fungi)、软腐菌(soft-rot fungi)。木质素降解酶系主要由三部分组成:锰过氧化物酶(MnP)、木质素过氧化物酶(LIP)和细胞外酚氧化酶)漆酶(lac case)3。大多数白腐菌仅产生2种甚至1种分解木质素的酶,如黄饱原毛平革菌只分泌LIP和MnP，因此这3种酶在分解木质素的过程中并不是全都必需的。MnP是血红素过氧化物酶,能够
12、氧化各种酚型化合物。LIP是-系列含Fe3+、吡琳环和血红素附基的同工酶,能以H2O2为电子受体氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物4。漆酶则是以O2为电子受体的含铜单电子氧化酶,其作用是使固体木质素的竣基增加而成为水溶性的状态,易于接受后续酶的催化。1.2 黄抱原毛平革菌简介黄抱原毛平革菌(Phanerochoetochrys chrysossporium)属于白腐担子真菌,是用于研究植物生物质利用和有机污染生物治理的模式生物之-。其菌丝体为多核,少有隔膜,无锁状联合6。多核的分生抱子常为异核,担抱子却是同核体。存在同宗配合和异宗配合两类交配系统,容易在水面上伸展并产生大量无性分生抱子。这种
13、特性为其之后的菌种保存，接种量化和遗传操作等提供了便利条件。黄抱原毛平革菌的生长分为营养期(初生生长)和繁殖期(次生生长)两个阶段,与细菌生长的对数期和静止期相对应。在其初生时期,生长表现为线性,生物量大幅增加;在次生期,其生长则基本停止,甚至发生生物量的下降。次生代谢由碳、氮等营养因素的限制而启动,从而进入木质素降解阶段。黄饱原毛平革菌在较高的温度下生长旺盛,这-特点使它可以轻易在木屑堆肥中生长。目前已经有越来越多的研究集中于黄抱原毛平革菌在这-方面的应用7。1.3 锰过氧化物酶(MnP)的基本特性及作用机理大约20多年以前由M.Golds group和R.Crowfords group两家
14、国际研究小组3从黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的发酵液中发现的锰过氧化物酶(Manganese peroxidase; EC 1.11.1.13)是唯-的-个中-旬过氧化物酶,分子量约为38-62.5kDa,大多数情况下纯化后的分子量都在45kDa左右。该酶的主要底物为有机酸,其活性中心由-个铁血红素基和-个Mn2+构成,另外还有两个起稳定结构作用的Ca2+。该酶的最佳稳定pH值是4.8,“惰性”蛋白质(如牛血清蛋白)和Mn2+均可提高其稳定性8。另外,Mn2+、蛋白质(如凝胶、牛血清蛋白、蛋清蛋白)和a-轻基酸(如苹果酸、柠檬酸)也都能促进其酶活的提
15、高。研究表明,当H2O2和Mn2+二者都存在时,MnP能够高效氧化分解芳香环多聚体。该酶的催化循环由H2O:结合到MnP本体上时开始启动,即含三价铁的MnP经H2O2作用,被双电子氧化产生化合物I。随后，化合物I的O-O键在Mn2+的作用下断裂,被从亚铁血红素上转移的双电子氧化形成化合物H。此时,若底物含有Mn2+,则化合物H经单电子转移被还原成含三价铁。过剩的H2O2将与自然状态的MnP作用产生化合物。虽然MnP和多种酚或芳香胺都能把化合物I还原为化合物,但只有Mn2+能有效地把化合物H还原成MnP,从而完成整个催化循环。1.4 微生物原生质体技术目前,原生质体诱变技术在实际生产中产生的效益
16、,已是举世瞩目,并且已经成为高新技术研究开发的重要手段。该技术在酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素等的菌种选育中都具有广泛的应用价值。陈丽萍等采用原生质体融合技术实现了植物内生放线菌之间以及植物内生放线菌和土壤中生防放线菌之间的融合,证明原生质体技术是改良放线菌特性的有效手段9。杨谦等用紫外线、硫酸二乙酷、氯化铿复合诱变黄绿木霉(Triclloderma aureoviride)的原生质体,筛选到了-株酶活力显著提高。遗传性能稳定的突变株,其EG酶活力与BG酶活力分别提高了58.43%、44.48%。杜海英等采用紫外线和60Co-线对黑曲霉(AsPergillus.ger)UCO-3的原生质体进行
17、协同诱变,获得了-株产高温乳糖酶的突变株,其产乳糖酶能力显著提高,是出发菌株的2.73倍11。秀珍等对产植酸酶的黑曲霉的原生质体进行处理,筛选到-株植酸酶活力比出发菌株高10,35倍且遗传性状稳定的突变株12。胡杰等对沪酿(AsPergillus oryea)3.042米曲霉的原生质体进行复合诱变,筛选到8株高产中性蛋白酶突变株群,为以后的细胞融合。基因组改组等提供了优良的候选文库。彭益强等将2株黑曲霉菌株(I、)在诱导产植酸酶的条件下分别制备成原生质体,并考察其原生质体形成及再生,经紫外诱变后,发现涂平板的黑曲霉(I0原生质体在再生过程中菌落形态发生明显变化14。考查突变菌种的植酸酶酶活,筛
18、选到其中1个变异株比原始黑曲霉()亲本株的植酸酶酶活提高了2.2倍。陈志高等对核糖普链霉菌(StrePtomyces ribosidificus)的原生质体进行紫外-LiCl复合处理,筛选出的突变株产核糖霉素能力比出发菌株提高了17%15。朱林东等通过紫外线诱变始旋链霉菌（Streptomyces prlstinaesPiralis)的原生质体,得到了产普那霉素为1.59g/L的高产突变株,较出发菌株提高了101.3%16。1.4 激光诱变育种当前,发酵工业中使用的高产菌株几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株,故至今仍是菌种改良的主要方法之-。近年来,激光育种已被人们广泛重视,在作物
19、育种方面的研究进展比较顺利并且取得了可喜的成果。总的来讲,激光生物学效应总的可以分为光效应、电磁场效应、热效应、压力效应等四个方面18。光效应:激光照射生物体后,由于其内部大分子吸收了-定波长的光子而被激活,产生受激原子、分子和自由基等,引起生物组织内产生-系列化学反应,从而产生相应的生物效应。其作用机理主要表现在七个方面:共振吸收、非线性吸收、光致异构化作用,包含分子氧的光敏华作用、光解离作用、断裂氢键、激发电子、光诱导以及光复活作用等。 电磁场效应:激光作为电磁波,当作用于生物体时,会对生物体组织内的细胞造成不同程度的影响。其电磁波特性主要表现为非电离辐射、电离辐射、共振作用及磁场反应等四
20、个方面。经激光照射的生物体内会产生-定数量的自由基,由此对染色体、DNA及蛋白质造成刺激或损伤,相继产生相应的生物学效应。热效应:通过使生物组织温度升高,引起酶失活和蛋白质变性,从而导致生物的生理及遗传变异。压力效应:光的粒子性会对生物体产生光压,即所谓的压力作用。通常的自然光源光强有限,光压微弱,对生物体的影响并不明显。但激光作为高强度光源,其光压作用不容忽视。它对生物体可产生-次压力(辐照压强)和二次压力(热膨胀压缩、声波和蒸汽压强、电致伸缩压强),从而使生物组织变形、破裂,导致生理及遗传变异。-般而言,若激光能量不够高,则无法直接破坏和损伤生物细胞和组织。此时,激光的光效应和电磁场效应即
21、便成为引起生物学效应的主要因素,而热效应和压力效应可被忽略。使用较多的激光器有氮分子激光器、二氧化碳激光器和He-Ne激光器。其中He-Ne激光器的使用频率约为40%,二氧化碳激光器的使用频率约为30%,氮分子激光器的使用频率约为15%19。2 材料与方法2.1 实验材料与仪器2.1.1 实验材料 从长有褐色或者乳白色锈斑的树皮上采集样品。2.1.2 培养基斜面保存培养基PDA平板培养基脱色培养基液体菌丝培养基优化前固体发酵培养基原生质体再生培养基2.1.3 试剂与药品渗透压稳定剂:0.6mol/LMgSO4。偶氮染料分散深蓝HGL：用去离子水配制成初始浓度10g/L的母液待用。主要酶液:蜗牛
22、酶（S）、纤维素酶（C）聚乙二醇(PEG)溶液:PEG分子量6000,溶液浓度40%,渗透压稳定剂配制。各种凝胶储备液酯酶染液2.1.4 主要仪器He-Ne激光器(T3型激光器,枪长l m,外腔式准单模激光,波长632.8nm,照射时使用功率12mW,光斑直径1.5mm) 西北大学光电厂SXK-103型净化工作台 上海志诚机械厂显微镜 OLMPUS恒温培养箱 上海虹浦仅器厂721型可见光分光光度计 上海第三分析仪器厂78HW-1恒温加热磁力搅拌器 杭州仪表电机有限公司80-2离心沉淀机 姜堰市新康医疗器械有限公司电子天平 北京赛多利斯天平有限公司恒温摇床 上海智诚分析仪器制造有限公司医用恒温水
23、浴箱 北京长安科学仪器厂电热恒温干燥箱 上海市跃进医疗器械-厂LD2X-40BI型立式 自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂DYY-6B型稳压稳流电泳仪 北京市六-仪器厂PHS-3B精密PH计 上海雷磁仪器厂2.2 菌种的筛选及鉴定称取采集的样品19用无菌水稀释后涂布于PDA培养基,30恒温培养。挑取长出的不同菌落再分别接入PDA培养基进行富集培养。经连续3代富集培养后,在脱色培养基上进行菌种纯化。生活力高的菌种具有较快生长速度,能在较短时间内获得大量菌丝体生物量,而大量的菌丝体生物量是产生大量酶的物质基础。因此,选择生活力高的菌种也是筛选。高效菌种的必要条件之-。生活力的高低用菌种在PD
24、A固体培养基上的生长速度来衡量,菌丝生长速度的测定采用菌落直径测定法20。用镊子从斜面上挑取纯化后的菌落接种于脱色培养基平板中央,30恒温培养,观察菌落周围形成的脱色圈,以脱色圈的大小及菌株的生长速度为筛选标准,即用游标卡尺测量菌落直径与变色圈直径,计算二者比值,初步比较菌株产MnP能力的大小,筛选出具备产MnP能力且产酶能力较好的菌株。初筛后挑选变色圈较大的菌株,待培养5-7d长满抱子后,刮取抱子制成浓度为2.0xl0-6个/ml,的抱子悬液,以5%接种量接入固体发酵培养基,发酵后测定MnP活力,选育出具有优良哇状的菌株。2.3 菌株诱变选育2.3.1 原生质体的制备取斜面培养基上4保藏的菌
25、种接种于PDA培养基,于30下恒温培养进行菌种活化,再挑取生长旺盛的抱子接种于液体菌丝培养基于30振荡培养2-4d后离心收集菌丝体(2000rpm20min),用渗透压稳定剂洗涤3次,离心2遍,弃上清液,按每300mg湿菌丝加1mL酶液计算加入灭过菌并经4层高级擦镜纸过滤的酶液,混合均匀,置于水浴中保温酶解,隔时摇动使菌体悬浮。每隔3h取样镜检-次,至大部分菌丝裂解即终止水浴。低速离心(500rpm10min)去除细胞壁及菌丝片段,将原生质体悬浮液吸出,再高速离心(3000rpm10min)弃去酶液,用渗透压稳定剂洗涤2次即获得纯化原生质体。2.3.2 原生质体的再生将纯化后的原生质体用渗透压
26、稳定剂进行梯度稀释,取悬液0.lmL注于再生培养基平板上,30恒温培养,观察原生质体再生情况。同时将原生质体用无菌蒸馏水进行稀释,倒于再生培养基平板作为对照。2.4 He-Ne激光对原生质体诱变作用2.4.1 激光诱变将新鲜制备的浓度为107个/ml的原生质体悬液装入7个玻璃小试管中,每管用He-Ne激光(632.8nm,输出功率12mW)进行辐照,照射光斑直径1.5mm,照射距离30cm,照射时间分别为O、1、2、4、6、8、10min。对经过各照射时间的原生质体悬液进行系列稀释并取o.lml涂布单位/ml青霉素(抑制细菌生长)的再生培养基上,30培养3-7天,计数再生菌落,计算再生率。2.
27、4.2 诱变效果分析从经过不同时间激光照射的原生质体的再生菌落中挑取单菌落接种于斜面培养基上进行冷藏保存,活化后进行固体发酵,测定酶活,计算正变率。正变率二每组平板中较对照组酶活力提高10%以上者的菌落数/每组挑取转接进行酶活力测定的单菌落数100%。2.4.3 酯酶同工酶分析随机挑取几株经激光照射后酶活力有改变的再生株,提取酶样进行酷酶同工酶谱分析。染色后扫描,计算酶带数目以及各个酶带的相对迁移率。2.5 固态发酵条件优化2.5.1 菌种的活化与驯化实验室中保藏的菌种长期处于干燥、低温的环境,活性降低,所以在后续试验前需要对菌种进行复壮,从而恢复菌株的活性。将保存于冰箱中的菌种取出,每次由-
28、个试管中的斜面转接到另两个斜面上,如此转接2-3次,选出其中生长较好的菌种转接于PDA平板上进行培养。待培养5-7d长满抱子后,刮取抱子制成浓度为2.010-6个/ml的抱子悬液。取5%的抱子悬液接种于灭菌固体发酵料中,30驯化培养。2.5.2 固态发酵培养基的优化Mn2+浓度对MnP活力的影响：在优化前的固体发酵培养基中添加不同浓度的Mn2+,以测定不同浓度的Mn2+对MnP形成的影响。Mn2+浓度对MnP活力的影响：在优化前的固体发酵培养基中添加不同浓度的Mn2+,以测定不同浓度的Mn2+对MnP形成的影响。TWeen-20和TWeen-80对产酶的影响,浓度均为0.1%。2.5.3 固态
29、发酵条件的优化按L,6(44)正交实验分配表做四因素四水平正交综合试验,各因素水平依次为:菌种驯化时间为3d、4d、5d、6d;菌悬液接种量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%;温度为30、34、37、39;发酵基质含水率为50%、60%、75%、85%,由此, 可得出16组实验方案。各实验组将菌种按正交实验设计的不同驯化时间驯化后,制成浓度为2.010-6个/ml的菌悬液,再按实验要求的不同接种量(质量比)接种于灭菌固体发酵培养基中,在正交实验设计的发酵条件下进行发酵,各做3个重复样,4d后测酶活。3 结果与讨论3.1 高产MnP菌株的筛选及菌种鉴定 从原始材料中,初筛得到4株待测菌株,
30、分别命名为W1、W2、W3和W4。从实验结果中可以看到变色圈和菌丝圈尺寸的变化并不为-恒定值。在8天的培养时间内,有时前者较大,有时后者较大,有时-样大。但同时观察到变色圈长到第7天时均不再扩展,而菌丝圈则可根据培养器皿的大小任意蔓延生长。通过酶活测定筛选出1株产MnP高的菌株W3。实验证明变色圈尺寸越大,颜色越深,产MnP越多。 该菌生长速度较慢菌落呈白色绒状且正反面颜色-致,菌丝稀薄,菌丝体为多核,少有隔膜,无锁状联合。在合适的培养条件下,菌丝生长旺盛,能够产生大量的无性分生抱子,即直径5-7mm的卵形颗粒,表面带有小杆状结构。经鉴定属于担子菌纲,同担子菌亚纲,非褶菌目,丝核菌科的黄抱原毛
31、平革菌。3.2 菌株的诱变选育3.2.1 原生质体的制备和再生细胞壁中蛋白质的二硫键能被尽琉基乙醇还原,从而使分子链断开,接受酶分子的作用。因此尽琉基乙醇被认为能够促进细胞壁的水解以及原生质体的释放。用0.3-琉基乙醇预先浸泡菌丝1h后离心除去尽琉基乙醇,用渗透压稳定剂洗涤,再将0.3%-琉基乙醇按0.05mL-琉基乙醇/lmL酶液的量加入。脱壁采用混合酶,即将蜗牛酶(S)(5mg/mL)、纤维素酶(C)(4mg/mL)用PH5.O的0.4mol/L NH4Cl-0.3%-琉基乙醇0.2mol/L磷酸缓冲液溶解,经0.45娜微孔滤膜过滤除菌后使用,混合酶液配比为S:C5:4。在对黄抱原毛平革菌
32、原生质体制备过程酶解条件的初步认识的基础上,确定采用三因素三水平正交表L9(33)进行试验。由实验结果知：影响原生质体再生率的主次因素为:酶解时间酶液浓度酶解温度。当酶浓度达到1.5mol/mL,酶解时间为2h,酶解温度为30时原生质体形成量最大。酶在作用细胞壁的同时会对细胞自身造成-定的伤害,因此过高的酶浓度会使释放出来的原生质体不易存活。这种负作用的结果随着酶解时间的延长而愈加明显,从而使原生质体的形成率明显降低。对于再生率而言,酶浓度越高,酶解时间越长,再生率越小。原因同上述。由于酶解温度对再生率影响较小,故先不做考虑。考虑到酶解时间对再生率的影响最大,并且酶解时间为2h时原生质体释放量
33、最高,再生率也相对较高,故选择原生质体制备的酶解时间为2h。酶浓度是影响原生质体释放量的主要因素,要保证较高的原生质体释放量则选择酶浓度为1.5mol/mL,酶解温度为次要因素可选择为30。综上所述,原生质体制备与再生的最佳条件为:酶浓度为1.5mol/mL,酶解时间为2h,酶解温度为30。3.2.2 激光辐照原生质体在最佳酶解条件下制备原生质体,将纯化后浓度为107个/mL的原生质体悬液分别装入7只小试管中,每管0.5mL,由He-Ne激光(波长632.8nm,输出功率12mW)辐照,照射光斑直径1.5mm,照射距离30Cm,分别照射不同的时间,然后适量稀释并涂布在再生培养基上,以照射时间计
34、量,计算再生率。而由实验数据得出，原生质体再生率随着激光辐照时间的延长而逐渐降低。这是因为没有了细胞壁的保护,原生质体变得对外界刺激十分敏感21。同时可以看出,小剂量的He-Ne激光照射对该菌原生质体有明显的致死作用。从该菌原生质体经不同辐照时间后长出的再生菌落中随机挑取单菌落,纯化后接种于斜面培养基上富集保存。分别挑取再生菌株,用三点法点接于脱色培养基平板上,30培养24h,测量变色圈大小,与原始菌株的变色圈大小进行比较,计算D值。每株菌取3组平行样,计算D值的平均值,D值平均值大于1则为正突变株,计算突变率。通过这种方法考察不同辐照时间下的正突变率从试验结果可以看出,在0-6min阶段,正
35、变率随着激光辐照时间的延长而提高,当照射时间为6min时达到最高35.2%。但当辐照时间超过6min后,正变率开始下降。实验结果表明,小剂量的激光能够诱导产酶功能基因的活跃,表现为菌体的产酶能力增强;但过量的激光辐照则会导致细胞基因畸变,蛋白质变性,阻碍菌体正常的代谢活动,降低其产生次级代谢产物的能力。此外,激光的过度辐照会对细胞膜造成不可恢复的损伤,导致细胞内容物外漏,引起细胞死亡。第-,原生质体的再生率随着激光辐照时间的延长而降低,这是因为激光照射对失去细胞壁保护的原生质体而言具有-定的杀伤作用。第二,适量的激光照射可以引发原生质体发生正变,对后续的条件优化起到非常重要的作用。结果显示,经
36、辐照6min的原生质体既保证了较高的正变率,又保证了-定的原生质体再生率。考虑到菌种选育工作的目的和意义,激光的最佳辐照时间应为6min。3.2.3变异株的选育及鉴定从经过激光照射6min后的原生质体再生菌落上随机挑取若干株进行固体发酵和MnP活力的测定,将酶活力有明显变化的再生株(以2#、5#、9#为例)通过聚丙烯酞胺凝胶电泳进行醋酶同工酶谱分析。从凝胶板上酶带可以看出诱变后的再生株比亲本的酶带数量及迁移率未发生变化,但其各酶带的染色深浅差异较大,表现为酶峰面积有所变化,同时各菌株的相对酶活变化也较为明显。可以看出,这三株再生菌株的MnP活力较亲本都有明显提高,并且酶峰面积也比亲本大。由此可
37、以得出:该菌的酷酶同功酶活性与MnP活力之间有-定的相关性。并且5#和9#突变株还出现了亲本没有的酶带Ea,应该是激光诱变的效果。通常,酶活的变化反应的是生物体-系列生理代谢状况,因此,同工酶技术在诱变育种中经常作为主要的生化指标以检测变异株的遗传物质、酶活等较亲本是否发生变化。3.3发酵条件的优化本实验得出，添加浓度为o.015mmol/g的Mn2+和1%TWeen-20可显著提高菌株产MnP能力。使MnP酶活最高的综合水平为:菌种驯化时间5d,接种量0.5%,发酵温度37,发酵基质含水率85%。在该条件下,MnP活力可达到20.71U/g。在菌株固体发酵过程中,发酵基质含水率对固体培养下M
38、nP活力影响最大,其次是温度、菌种驯化时间和接种量。因此,从节能和经济方面考虑,在实际工艺中可优先考虑含水率与温度这两个影响该菌固体发酵最显著的因素。实验证明,亲本菌株经过激光诱变和固体发酵条件优化;其MnP活力提高了141.1%。4 实验结论通过平板培养观察脱色圈变化和酶活力检测相结合的方法从Wl、W2、W3、W4中筛选出1株产MnP活力(8.59U/g)较高的菌株W3作为出发菌株,并通过菌落形态鉴定为黄抱原毛平革菌。通过正交试验确定黄抱原毛平革菌原生质体制备和再生的最佳酶解条件为:酶浓度为1.5mol/mL,酶解时间为2h,酶解温度为30。其中所采用的酶液是将蜗牛酶(S)(5mol/mL)
39、、纤维素酶(C)(4mg/mL)用PH5.0的0.4mol/L NH4Cl-0.3-琉基乙醇0.2mol磷酸缓冲液溶解,按S:C=5:4配比而成。用波长为632.8nm,输出功率为12mW,光斑直径为1.Smm的He-Ne激光在照射距离30Cm辐照黄抱原毛平革菌的原生质体悬液6min,MnP活力正突变率最高达到35.2%。通过对突变株的醋酶同功酶谱、产酶能力及遗传稳定性进行分析,.选育出产酶能力较强、遗传稳定性良好的7#菌株作为工业发酵的新出发菌株,其MnP活力为14.28U/g。分别对菌株的固体发酵培养基和发酵条件进行优化,确定固体发酵培养基优化方案为:添加浓度为0.015mmol/g的Mn
40、2+和浓度为0.1%的TWeen-20;通过四因素四水平的正交试验确定菌体的固体发酵条件为:菌种驯化时间5d,接种量0.5%,发酵温度37,发酵基质含水率85%。在该条件下对黄抱原毛平革菌进行固体发酵,其MnP活力达到20.7lU/g。实验证明,亲本菌株经过激光诱变和固体发酵条件优化,其MnP活力提高了141.1%。5 本文进一步需解决的问题本实验只是将激光作为-种新型诱变手段对微生物原生质体进行诱变,但并未对其作用机理进行深入研究和探讨,若能研究清楚诱变作用的分子机制,无疑会对激光的广泛应用有重要影响。经激光照射后的突变株产酶能力有所提高,但其原理和机制并不明了,应该进-步明确以便开发出其他
41、有效途径提高菌株的产酶能力。应该对诱变后的突变株进行DNA分析,以便从基因型上对其进行鉴定。MnP的用途十分广泛,对农业和工业的生产实践都具有重要意义,因此有必要进-步对筛选出的高产MnP黄抱原毛平革菌的应用进行探讨。参 考 文 献1 岑沛霖,蔡谨.工业微生物学M.北京:化学工业出版社,2000.2 吴坤,张世敏,朱显峰.木质素生物降解研究进展J.河南农业大学学,2000.34(4):349一354.3 吴坤,张世敏,朱显峰.木质素生物降解研究进展J.河南农业大学学,2000.34(4):349一354.4 陶用珍,管映亭.木质素的化学结构及其应用J.纤维素科学与技术,2003.H(1):42
42、一55.5 黄峰,方靖.纤维二糖脱氢酶对锰过氧化物酶降解木素的促进作用J.科学通报,2001.18(46):523一528.6 池玉杰,伊洪伟.木材白腐菌分解木质素的酶系统一锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶催化分解木质素的机制J.菌物学报,2007.16(1):153一60.7 周金燕,张发群,桑原正章.真菌产生的锰过氧化物酶和漆酶研究n一株产锰过氧化物酶的担子菌一血红密孔菌K一2352J.微生物学通报,1994.21(3):252一256.8 王业耀,袁彦肖,田仁生.白腐真菌降解焦化废水的试验研究J.工业水处理,2004,24(2):26一28.9 吴涓,肖亚中,王怡平.挂膜生长的白腐真
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