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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流颅脑疾病重点实验室开放课题目项目申请化脓脑膜脑炎脑脊液细菌16SrRNA检测和功能分析.精品文档.编号：宁夏颅脑疾病重点实验室省部共建国家级重点实验室培育基地开放课题申请书项目名称：化脓性脑膜脑炎脑脊液细菌16S rRNA检测和功能分析研究方向：中枢神经系统感染的基础和临床研究项目类型：重点项目面上项目申请经费：10万元项目负责人：王振海所属部门：宁夏医科大学总医院神经内科专业技术职务：主任医师、副教授联系电话：13995089189Email 地址：wangzhenhai1968项目起止时间：2011年5月2013年5月宁夏颅脑疾病重点实验
2、室省部共建国家级重点实验室培育基地填 写 说 明 一、填写本申请书前，请先查阅宁夏回族自治区颅脑疾病重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地开放课题申请指南（以下简称指南）。申请书所列内容必须实事求是，逐项认真填写，表达要明确严谨。二、申请书一式三份，A4纸打印，左侧装定，连同电子版按通知要求如期递交实验室办公室，逾期不予受理。三、研究项目名称要确切反映研究项目的内容，字数最多不超过26个汉字。四、申请书中有关栏目（简表除外）填写不下时可另加附页。五、项目研究时间为2年，资助额度参见指南。从申请当年5月1日起执行。一、基本信息项目基本信息项 目 名 称化脓性脑膜脑炎脑脊液细菌16S rRNA检
3、测和功能分析主题词宏基因组学，化脓性脑膜脑炎，脑脊液，细菌研 究 属 性BA.基础研究 B.应用研究 C.开发研究 D.综合研究申请经费（万元）10预计研究年限 2011 年 5 月-2013 年 5 月预期成果BA.著作 B.论文 C.研究报告 D.新产品 E.新技术申请者信息姓名王振海性别男出生年月 1968 年 2月民族汉学历博士学位博士所属院（系）宁夏医科大学总医院主要研究领域中枢神经系统感染和脑脊液细胞学研究专业技术职称主任医师，副教授行政职务副院长联 系 电 话13995089189申请者已承担的其它研究项目情况项 目 名 称项目来源起止时间完成情况中枢神经系统Borna病病毒感染
4、的基础研究(编号:30760067)2007年国家自然科学地区基金课题2008.1-2010.12已结题中枢神经系统新发病毒感染脑脊液分子生物学诊断建立和分子流行病学研究(编号：2006AA02Z196)“863”研究计划专题课题2007.01-2009.12已结题中枢神经系统Borna病病毒感染的脑脊液细胞CT技术诊断平台建立研究（编号：20070420721）2007年第42批中国博士后科学基金项目2008.01-2010.12已结题单疱病毒脑炎认智功能障碍大鼠脑组织CDK5表达的相关性研究（编号：Z-2008-1-75002）2008年教育部“春晖计划”合作科研项目2009.01-201
5、1.12在研中项目组主要成员（不含项目负责人）姓名性别出生年月专业职称学位所属部门项目分工签 名赵莉女1981.10在读硕士硕士宁夏医科大学实验设计、实验操作杨娟女1985.06在读硕士硕士宁夏医科大学标本收集、实验操作胡坤女1982.06在读硕士硕士宁夏医科大学标本收集、实验操作赵春梅女1976.06主治医师硕士宁夏医科大学标本收集、实验操作刘强男1983.10在读硕士硕士宁夏医科大学标本收集、实验操作侯晓霖男1977.07主治医师硕士宁夏医科大学实验操作、论文撰写梁志娟女1982.01在读硕士硕士宁夏医科大学实验操作、论文撰写惠晶女1984.11在读硕士硕士宁夏医科大学标本收集、实验操作总
6、人 数高级中级初级硕士生博士生备 注912060二、立项依据（一）研究目的、意义及国内外研究现状1 研究目的和意义化脓性脑膜脑炎，系由各种细菌感染引起的脑膜炎症，在发达国家成人年发病率为410万610万1。主要临床表现为发热、颈项强直、意识改变和惊厥，其发生率分别为96、55、94和122,3。自使用抗生素以来其病死率已由5090降至10以下，但仍是严重感染性疾病之一。目前，许多发展中国家由于疫苗尚未得到推广，化脓性脑膜脑炎的病死率仍高达10%-30%4-6，一些非洲国家的农村儿童急性化脓性脑膜脑炎的总病死率更是高达35%-36%7,8，幸存者中有30%-50%发生永久性神经系统后遗症4,6,
7、9。CSF检查和培养是诊断化脓性脑膜脑炎的必须手段，其中能检测到的细菌可达数十种，但由于面临着抗生素的早期使用、菌种变迁、混合感染等问题，导致CSF细菌培养结果常常呈假阴性。用PCR方法能诊断出多种病原菌，敏感性和特异性均明显高于CSF培养法，可为化脓性脑膜脑炎的病原学诊断提供更为可靠的依据。但这种方法所提供的信息量有限，且其研究目标通常是测定目前已知的单一细菌的基因组序列。传统检测方法存在漏诊率高、假阳性率高、通量低等问题。检测方法技术落后，已经不能适应现在的要求，导致错误用药或是延误治疗，因此现迫切需要从新的角度寻找病原菌辅助临床诊断和指导用药。近年来，宏基因组学（metagenomics
8、）的提出为解决这一问题提供了可行途径，它是研究直接从环境样本，如人类胃肠道、口腔等中直接提取基因组遗传物质并进行相关分析的学科。传统的微生物研究依赖于实验室培养，而宏基因组避开了传统研究方法中微生物培养这一步，扩展了微生物资源的利用空间，它的兴起填补了无法在传统实验室中培养的微生物研究的空白。本课题拟选择1例典型急性化脓性脑膜脑炎患者在入院、治疗10天、20天、30天时的CSF，扩增细菌16S rDNA序列，然后采用新一代高通量测序技术16S rDNA测序分析，对16S rDNA序列直接进行宏基因组测序，可得到化脓性脑膜炎患者CSF中菌群的物种分类、物种丰度、系统进化、功能注释等研究。这种方法
9、不需进行克隆筛选，测序的通量高，获得的数据量大，周期短，能更加全面的反映CSF中的细菌成份，真实的物种分布及丰度信息。并将不同阶段的样品进行比较，可获得细菌与人疾病等特性的联系，全面提升对于化脓性脑膜脑炎患者CSF中的菌群之间密切关联认识的总体水平，进一步揭秘人体与细菌之间的关系，有效地指导人类对疾病的认识，确定在该领域的核心地位和国际竞争力。2 国内外研究现状及发展动态分析2.1 化脓性脑膜脑炎的诊断2.1.1 CSF的细菌培养和药敏试验CSF的细菌培养和药敏试验是临床医师诊断和治疗化脓性脑膜脑炎，合理选用抗生素，提高疗效，避免抗生素滥用的重要依据，但其耗时较长(通常为34d)；由于CSF细
10、菌培养所需菌量较多，细菌培养只能检测活细菌，标本采集和送检过程中难以保证细菌存活，且临床应用抗生素者细菌生长受抑，故临床上CSF培养阳性率较低，而且确诊前常因有不正规的抗生素治疗使CSF改变更不典型等，如脑膜炎双球菌脑膜炎应用抗生素2h，肺炎链球菌脑膜炎应用抗生素4d，CSF培养细菌即为阴性10，给早期诊治带来一定的困难，难以适应临床早期诊断。2.1.2 CSF 16S rRNA基因检测16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌及衣原体、支原体、螺旋体等原核生物的染色体基因中，不存在于病毒、真菌等非原核生物体内。16S rRNA基因有高度保守性，长度适中，
11、多信息、多拷贝，在通用保守区设计引物，可用于对病原微生物感染的检测。理论上可以设计不同的引物对所有细菌或特定细菌进行PCR检测。细菌16S rRNA基因检测技术不需细菌培养，可短期内完成（2-3h），终点测量定量准确；且只要有细菌存在，无论死菌活茵，不需体外培养均可检测到，故该项技术近年来多有报道。常用的检测方法包括：（1）PCR-探针杂交：根据16S rRNA编码基因可变区的序列设计一系列特异性探针，通用PCR扩增含有可变区的部分16S rRNA基因，然后与特异性探针进行杂交11。（2）PCR-反向斑点杂交法：将特异探针点样于硝酸纤维素薄膜或尼龙膜，以生物素或地高辛标记的PCR产物与之杂交，
12、加入与碱性磷酸酶结合的抗体，与PCR产物结合，再加入显色底物，通过比色检测结果12。（3）PCR直接测序法：在细菌16S rRNA编码基因的保守区设计通用引物，先进行PCR扩增模板DNA，然后对扩增片段进行测序，测序后经人工解读或使用测序数据分析软件包自动解读，测序的正反序列经校正后可排列成一条一致的序列，再与已知细菌的特征性序列进行比较，就可以准确地鉴定该种菌。（4）PCR-RFLP：在细菌16S rRNA编码基因的保守区设计通用引物，先进行PCR扩增模板DNA，再用限制性内切酶酶切，然后电泳分析酶切片段13。（5）微型寡核苷酸芯片：根据CSF标本中常见病原菌16S rRNA基因保守区的序列
13、设计用于基因扩增的通用引物，制备细菌的通用探针、革兰阳性菌和阴性菌通用探针，以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针，将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增，扩增过程中用生物素标记；将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交，检测CSF中细菌的感染情况14。2.2 宏基因组学基本策略及在医学研究领域中的可能应用宏基因组（metagenome）是指从环境样本中取得全部微生物的基因组，而不是采用传统的培养微生物的基因组。最早于1998年由Handelsman
14、等15在研究土壤微生物时提出的。宏基因组学（metagenomics）就是利用现代基因组技术针对宏基因组进行系统的研究，一般包括克隆、构建文库和功能分析筛选等工作。宏基因组学的基本策略包括4个步骤：第1步是分离DNA，在方法上规避了先培养微生物再提取DNA的传统做法，而是从环境中直接收集能够代表环境微生物多样性的样品；然后利用各种理化方法破碎微生物，使其释放DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。第2步是对纯化的大分子量DNA进行酶切或者超声打断处理，并与合适的载体DNA进行连接。第3步是将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转入模式微生物，例如大肠埃希菌。使那些以前无法研究的不可培养微
15、生物的DNA在模式微生物中得到复制、表达，进而得到研究。所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。第4步是对宏基因组文库的DNA进行分析。基于研究目的的不同有很多分析方法，主要分为两类：一类为表型筛选，即利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因。例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆16。另一类为基因型分析，即对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究。例如分析文库中16S rRNA序列，对所研究环境的多样性进行评估17。宏基因组学的出现改变了微生物学家研究问题的方法，它已经广泛应用于生物学和生物技术领域，也将进一步加深人们对地球上一些特殊生境的认识，如深海热流
16、排放口、酸性热泉、永久冻土、沙漠、南极冰湖、人类的口腔和内脏、白蚁和毛虫的内脏、植物的根际和叶际、和地衣共生的真菌等。不过到目前为止，医学领域只有为数不多的一些研究工作。如Breitbart等18利用宏基因组方法分析了人粪便中不可培养的病毒群体，发现该群体中包含1200个病毒基因型，对其序列分析表明大多数是之前没有报道的。Walter等19对小鼠大肠微生物群构建了宏基因组文库，并对表达-葡聚糖酶活性的克隆进行了筛选，发现2个克隆是来自不可培养微生物的。Diaz-Torres等20利用宏基因组学方法对口腔细菌群体中耐药基因进行了分析，结果证明用宏基因组学方法进行耐药情况调查和研究是可行的。Gil
17、l等17建立了人肠道微生物群的宏基因组，并对其代谢特征进行了分析。Manichanh等21利用宏基因组方法对比研究了正常人和节段性回肠炎病人肠道微生物多样性，发现病人肠道微生物多样性大大降低，尤其是硬壁菌门的细菌种类大大减少。Wenderoth等22对胆道支架表面生物膜的群落组成进行了研究，他们从病人体内取出来的胆道支架上的微生物群落提取DNA和RNA，对16S rRNA和rDNA序列进行扩增，采用单链构象多态性分析(single stranded conformation polymorphism SSCP)和测序等方法对扩增片段进行分析，发现以下细菌：克雷伯氏肺炎杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞
18、菌、产气肠杆菌和2种与大肠杆菌(Ecoli)以及索氏志贺菌关系甚远的未培养细菌存在于所有被测胆道支架的生物膜，其中未培养细菌为胆道支架生物膜的主要成员。他们还发现不同国家，不同病人的胆道支架生物膜的群落非常相似，并且有相似的主要成员。Moran实验室从蚜虫体内分离出细菌DNA，并对其测序，然后重新组合成细菌的基因组。他们发现巴克纳氏菌属有一个缩减的基因组，在和重建的原始基因组比较后发现，该缩减基因组丢失了1906个基因。这些丢失基因的功能大部分和由宿主承担的生物合成途径相关，提示了基因缩减是共生生活类型的结果，某些功能由宿主承担之后，其共生菌就不再需要具有该功能的基因了23。蚜虫巴克纳氏菌基因
19、组的重组使人们可以了解细菌和昆虫共生体的进化，它们所演变出来的生化相互依赖性，基因组缩减和重排的机制等。CSF作为CNS和脊髓的外环境，可以反映某些CNS疾病的变化。目前还未见应用宏基因组学的方法分析人CSF中不可培养微生物群体的报道。本课题立足于化脓性脑膜脑炎的病原学诊断困难，可能存在某些未被认识的致病菌，严重影响了疾病的治疗和预后，借助于宏因组学研究方法在环境微生物研究中的众多优势，拟应用这一近年新兴的研究方法对CSF中细菌种群构成进行调查分析，本课题拟选择1例典型急性化脓性脑膜脑炎患者在入院、治疗10天、20天、30天时的CSF，扩增细菌16S rDNA序列，采用16S rDNA 宏基因
20、组测序技术，对样品16S rDNA的V6可变区进行测序，并拼接成Tag，并根据Tag进行物种分类、OTU分析、多样性分析、比较分析等可得到化脓性脑膜炎患者CSF中菌群的物种分类、物种丰度、系统进化、功能注释等信息。这种方法不需进行克隆筛选，测序的通量高，获得的数据量大，周期短，能更加全面的反映CSF中的细菌成份，真实的物种分布及丰度信息。并将不同阶段的样品进行比较，可获得细菌与人疾病等特性的联系，全面提升对于化脓性脑膜脑炎患者CSF中的菌群之间密切关联认识的总体水平，进一步揭秘人体与细菌之间的关系，有效地指导人类对疾病的认识，确定在该领域的核心地位和国际竞争力。参考文献：1 Schuchat
21、A,Robinson K,Wenger JD,et a1.Bacterial meningitis in the United States in 1995J.N Engl J Med,1997,337:970-976.2 Ostergaard C,Konradsen HB,Samuelsson S.Clinical presentation and prognostic factors of streptococcus pneumoniae meningitis according the focus of infectionJ.BMC Infect Dis,2005,5:93.3 Casa
22、do-Flores J,Aristegui J,de Liria CR,et al.Clinical data and factors assoociated with poor outcome in pneumococcal meningitisJ.Eur J Pediatr,2005,165(5):285-289.4 Chaudhuri A.Adjunctive dexamethasone treatment in acute bacterial meningitisJ.Lancet Neurol,2004,3(1):54-62.5 Celal A,Faruk GM,Salih H,et
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24、 bacterial meningitis among children,in Manhica,a rural area in Southern MozambiqueJ.Acta Trop Pediatr,2008,54(2):125-128.8 Bercion R,Bobossi-Serengbe G,Gody JC,et al.Acute bacterial meningitis at the Complexe Pdiatrique of Bangui,Central African RepublicJ.J Trop Pediatr,2008,54(2):125- 128.9 Pomar
25、V,Martinez S,Paredes R,et al.Advances in adjuvant therapy against acuge bacterial meningitisJ.Curr Drug Targets Infect Disord,2004,4(4):303-309.10 Kanegaye JT，Soliemanzadeh P，Bradley JSLumbar puncture in pediatric bacterial meningitis：Defining the time inteval for recovery of cerebrospinal fluid pat
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28、ntification of common bacterial pathogens in cerebrospinal fluidJ.J Clin Microbiol,2000,38(6):2076-208014 毕春霞，武静，张德坤等.脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究J.青岛大学医学报学报,2006,42(3):200-202.15 Handelsman J,Rondon MR,Brady SF,et al.Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes:a new fro
29、ntier for natural productsJ.Chem Biol,1998,5(10):245-249.16 MacNeil IA,Tiong CL,Minor C,et al. Expression and isolation of antimicrobial small molecules from soil DNA librariesJ.J Mol Microbiol Biotechnol,2001,3(2):301-308.17 Gill SR,Pop M,Deboy RT,et al.Metagenomic analysis of the human distal gut
30、microbiomeJ.Science,2006,312(5778):1355-1359.18 Breitbart M, Hewson I,Felts B,Mahaffy JM,Nulton J,Salamon P,Rohwer F.Metagenomic analyses of an uncultured viral community from human fecesJ.Bacteriol,2003,185(20):6220-6223.19 Walter J,Mangold M,Tannock GW.Construction,analysis,and beta-glucanase scre
31、ening of a bacterial artificial chromosome library from thelarge-bowel microbiota of miceJ.Appl Environ Microbiol.2005,71(5):2347-2354.20 Diaz-Torres ML,Villedieu A,Hunt N,et al.Determining the antibiotic resistance potential of the indigenous oral microbiota of humans using a metagenomic approachJ.
32、FEMS Microbiol Lett,2006,258(2):257-262.21 Manichanh C,Rigottier-Gois L,Bonnaud E,et al.Reduced diversity of faecal microbiota in Crohns disease revealed by a metagenomic approachJ.Gut,2006,55(2):205-211.22 Wenderoth DF,Ferslev B,Macarri G,et al.Leitbakteria of microbial biofilm communities causing
33、occlusion of biliary stentsJ.Environ icrobiol,2003,22:859-866. 23Mira A,Ochman H,Moran NA.Deletional bias and the evolution of bacterial enomeJ.Trends Genet,2001,17:589-596.（二）研究内容、预期目标、拟解决的主要问题1 研究内容1.1 PCR扩增细菌16S rDNA序列16S rDNA序列具有以下特点：（1）多拷贝：16S rDNA编码基因以多拷贝形式存在于所有细菌染色体基因组中，每个细菌约含510个拷贝，这使得对该基因的检
34、测具有敏感性。（2）多信息：16S rDNA编码基因内部结构由可变区和保守区组成。保守区为所有细菌所共有，细菌间无差别，有“分子化石”之称。可变区在不同细菌之间存在有不同程度的差异，具有属或种的特异性，可变区与保守区交错排列。可根据保守区设计各种细菌的通用引物，也可根据可变区设计特定细菌的特异引物或探针。16S rDNA基因可变区所含信息的种间差异使检测具有特异性。（3）长度适中：16S rDNA编码基因长度适中，约1500bp，不像23S rDNA基因序列太长不易进行全序列测定，因此，各种细菌16S rDNA基因的测序工作在微生物学界成为热点。目前，人体液中常见病原菌的16S rDNA基因几
35、乎全部测序完成，为细菌的基因诊断提供了条件，16S rDNA编码基因的这些特点使之成为较理想的细菌基因分类的靶序列，逐渐成为细菌鉴别、分类的金标准。1.2 CSF中细菌分类分析使用BLASTN 将序列比对到16S rDNA数据库。挑选其中的最佳比对结果。没有比对上数据库的序列不给出物种分类信息。BLAST有多个结果的序列会根据众数原则，也就是如果66%的比对结果都支持同一个物种分类，那么就认为是属于那个物种分类的。如果不符合要求，就向上一个物种分类等级再做比对。1.3 CSF中物种丰度分析 首先，计算tag的丰度分布；然后，为了更好地获得样品的细菌丰度，可基于tag采用OTU分析的方法。1.4
36、 化脓性脑膜脑炎患者CSF中致病菌的系统发生学分析基于16S rDNA V6序列差异的大小，对一些类群构建系统发育树。1.5 不同阶段样品间的比较分析基于系统进化，功能注释的多样品比较分析可寻找细菌分类上的显著差异。2 研究目标2.1 PCR扩增细菌16S rDNA序列，为细菌分类及后续分析做准备；2.2 通过基因测序，运用不同的分析方法和手段推测基因的种属来源、表达丰度、建立系统发生树并对不同阶段样品间的比较分析寻找细菌变化的显著差异。3 拟解决的关键问题本研究运用新一代高通量测序技术16S rDNA宏基因组测序技术，对的V6可变区进行测序分析，不需进行克隆筛选，测序的通量高，获得的数据量大
37、，周期短，能更加全面的反映样本的物种组成、真实的物种分布及丰度信息。测序后运用不同分析方法和手段进行生物信息学分析，可得到物种分类、群落结构、系统进化、功能注释等信息。所以测序和生物信息学分析是本研究的关键，本课题组将借助深圳华大基因研究院生物信息中心在基因组测序和生物信息学分析方面的强大优势来完成本课题的研究。（三）研究方法、技术路线、实验（设计）方案及可行性分析1 研究方法 选取宁夏医科大学附属医院神经内科确诊为化脓性脑膜脑炎患者12例，对此患者进行动态观察，分别收集入院时、治疗3天、7天、12天时的CSF标本，应用通用引物扩增细菌16S rDNA序列，采用16S rDNA宏基因组测序技术
38、对样品16S rDNA的V6可变区进行测序，并拼接成Tag，并根据Tag进行物种分类、OTU分析、多样性分析、比较分析等可得到化脓性脑膜炎患者CSF中菌群的物种分类、物种丰度、系统进化、功能注释等信息。2 技术路线图3 实验方案3.1.1 样本采集拟收集宁夏医科大学附属医院2011年5月至2012年8月确诊化脓性脑膜脑炎患者1例，分别取此患者入院时、治疗3天、7天、12天时CSF各12ml；化脓性脑膜脑炎的临床诊断标准：（1）有或无近期呼吸道或肠道感染史，有或无中耳炎、鼻窦炎等病史；（2）有发热、头痛、呕吐、抽搐等症状，有嗜睡、谵妄或昏迷等意识障碍；（3）体格检查：颈项强直、Kernig征及B
39、rudzinski征阳性，但成人患者阳性率仅50，故对阴性者不能排除诊断；视乳头水肿，脑神经麻痹；（4）辅助检查血常规：白细胞计数明显增多，可达(2040)109L，中性粒细胞达90以上；CSF检查：CSF压力200mmH2O，外观混浊或呈脓性，糖2.2mmol/L，氯化物0.4g/L，未经治疗的化脓性脑膜脑炎白细胞数高于正常水平，为(100010000)106L，以中性粒细胞升高最为明显；但亦有10患者以淋巴细胞升高为主。CSF涂片镜检及细菌培养发现病原菌为诊断金标准；血细菌培养：血培养阳性具有确定病原的价值；脑CT早期正常，病程进展可见脑膜呈线状强化，硬膜下积液可见颅骨内板下新月形低密度区
40、，包膜形成时可见内膜强化，室管膜炎及脉络膜炎时脑室壁呈线状强化，脑积水显示脑室扩大，脑实质受损可见低密度区和占位效应；脑MRI早期脑膜及皮质呈条状信号增强，脑组织广泛水肿，脑沟和脑裂变小；中期皮质和皮质下梗死，T1WI低信号，T2WI高信号；后期可见脑积水、硬膜下积液及脑萎缩等；排除以下疾病：颅脑外伤、脑肿瘤、颅内出血、其它致病微生物所致颅内感染、脑白质病变、代谢性脑病等。3.1.2 样本的处理从-80冰箱取出CSF样本，室温解冻，分别将每份CSF混匀后，于Effendorf管中，采用差速离心法对样本中的细菌进行富集。3.1.3 提取CSF总DNA应用IsoQuick 试剂盒提取样本中的总DN
41、A，按照试剂盒操作说明进行。3.1.4 DNA片段大小、浓度、纯度测算样品DNA 浓度以及大小的测算是用已知浓度的Marker 作为对照和样品DNA同时电泳根据DNA条带亮度推算出DNA的大概浓度，根据DNA条带位置推算出DNA的大概片段长度，样品DNA纯度估计是将2l DNA样品稀释至500l后测定260nm和280nm下样品的OD值，通过样品OD260/OD280 的值来进行估计的。OD260/OD280 在1.8至2.0之间就判定为纯，小于1.8表明样品中有较多的单链DNA或RNA，大于2.0则表明样品中含有较多的蛋白。3.1.5 16S rDNA 引物的选取与 PCR 扩增本研究选择1
42、6S rDNA基因通用引物：27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492R(5-TACTTGTTACGACTT-3)，进行PCR扩增。反应产物保存于 4 备用。3.1.6 测序与生物信息学分析将PCR扩增产物送去测序（本部分在深圳华大基因信息研究院生物信息中心完成）。采用与新一代高通量测序技术相结合的16S rDNA Metagenomes测序技术，对样品16S rDNA的V6可变区的PCR产物进行测序，并拼接成Tag，并根据Tag进行细菌分类、OTU分析、多样性分析、比较分析等。测序及分析流程：（1）进行原始数据的处理：去除有adapter污染的序列；数据的拼接：运用
43、华大研发的overlap 拼接软件对数据进行拼接，得到拼接的结果。通过重叠关系将两条两端测序得到的序列组装成一条序列。拼接的条件是最小匹配长度为5bp，重叠区域不允许错配，N所占最大百分比是0.4。为了更多的利用序列，不满足以上结果的序列将各切除5bp继续组装，如此重复多次。最终产生的就是V6区的序列。去除引物：挑出完全匹配引物的序列，而不匹配的序列不进行后续分析，去除V6区两端的引物。去除引物后剩下的序列称为tag。（2）细菌复杂度分析：计算tag的丰度分布。（3）细菌分类：使用BLASTN 将序列比对到16S rDNA数据库。挑选其中的最佳比对结果。没有比对上数据库的序列不给出细菌分类信息
44、。BLAST有多个结果的序列会根据众数原则，也就是如果66%的比对结果都支持同一个细菌分类，那么就认为是属于那个细菌分类的。如果不符合要求，就向上一个细菌分类等级再做比对。（4）Alpha多样性分析：为了更好的评价环境的细菌丰富程度，使用操作分类单位（Operational Taxonomic Units,OTU）OTU进行分析。选择97%一致度的OTU（相当于细菌的水平）进行OTU的分析。基于OTU的结果，计算样品OTU的alpha 多样性。是一个环境中物种的多样性分析的结果。（5）系统进化分析：基于16S rDNA V6序列差异的大小，对一些类群构建系统发育树。（6）产生profiling
45、表格：将不同的样品的细菌或OTU的结果结合，生成profiling表格。（7）Beta diversity分析：基于profiling table，计算两两样品间的beta diversity。（8）PCA分析：基于profiling table，找出不同环境中变化较大的细菌。两个样品距离越近，表示组成越相似。（9）聚类分析：根据聚类结果对样品进行聚类。通过样品内细菌组成的相似性，bootstrap 100次。4 可行性分析4.1 总体研究方案切实可行从学术思路上看，宏基因组学以环境中全部DNA作为研究对象，通过克隆异源表达来筛选有用基因及其产物；是研究微生物生态是新型发展的方法。本课题针对化
46、脓性脑膜脑炎的病原学诊断困难，可能存在某些未被认识的致病菌，严重影响了疾病的治疗和预后，结合宏基因组学的研究策略，从化脓性脑膜脑炎患者CSF样品中提取总DNA，克隆DNA到合适的载体，导人宿主菌体，构建宏基因组文库。这将为研究CSF中细菌的种系发生学、发现新的病原微生物、筛选抗生素耐药基因、筛选药物治疗靶点及为开发基因芯片诊断技术奠定基础。从研究技术上看，本项目负责人长期从事神经病学临床、科研和教学工作，具有中枢神经系统感染、脑脊液细胞学研究及分子生物学的基础。申请单位和协作单位都具备承担相关技术的研究工作基础，并得到国内同行的认可。研究方案设计科学、合理、可行，研究技术完全具备。研究团队由相关多学科组成，涉及专业知识面广，涵盖神经病学、分子生物学、生物医学工程、生物信息学等学科交叉，优势互补，联合攻关。4.2 研究团队基础力量可行 本项目依托单位负责人主持和参加科研项目13项，其中国家“973”和“863”研究计划项目各1项，国家自然科学基金面上项目2项，2007年第42批中国博士后科学基金1项，教育部春晖计划1项，宁夏自然科学基金项目3项。深圳华大基因研究院生物信息中心先后完成了国际人类基因组计划“中国部分”（1%）、国际人类单体型图计划（10%）、水稻基因组计划、家蚕基因组计划、家鸡基因组计划、抗SARS研究、炎黄一号等