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1、会计学1细胞细胞(xbo)生物学实验之精生物学实验之精第一页，共19页。 实验实验(shyn)目的目的了解了解(lioji)细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的检测方法加深对细胞凋亡现象及本质的理解加深对细胞凋亡现象及本质的理解练习从形态学角度评价细胞凋亡练习从形态学角度评价细胞凋亡掌握荧光显微镜的使用方法掌握荧光显微镜的使用方法第1页/共19页第二页，共19页。 实验实验(shyn)原理原理基本概念：基本概念：细胞凋亡细胞凋亡(Apoptosis)(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种是指细胞基因调控的一种(y (y zhn)zhn)自主性的自杀现象。或者说在一定的生理或病理条自主性的自杀现象
2、。或者说在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。件下，细胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。由于这种死亡方式是由基因调控的死亡过程，因此又称之由于这种死亡方式是由基因调控的死亡过程，因此又称之为程序性细胞死亡为程序性细胞死亡(Programmed Cell Death)(Programmed Cell Death)。细胞凋亡有别于细胞坏死。细胞凋亡有别于细胞坏死。第2页/共19页第三页，共19页。似秋叶的凋零似秋叶的凋零(diolng)，告别生命之辉煌；告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，轻启着道道程序，逼细胞步步
3、走向生命的末端；逼细胞步步走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡线粒体把生命之光一点一点拧淡;第3页/共19页第四页，共19页。n危难危难(wi nn)中的细胞啊，中的细胞啊，n你沉稳不乱，你沉稳不乱，nDNA片片切割，片片切割，n化云梯直通天堂；化云梯直通天堂；n细胞体分团相聚，细胞体分团相聚，n把生命的凝重浓集在小体上；把生命的凝重浓集在小体上；n分别了朝夕相处的伙伴，分别了朝夕相处的伙伴，n再见了快乐美好的时光；再见了快乐美好的时光；n这一切的一切又融入临近的胞体，这一切的一切又融入临近的胞体，n腾出的空间再写
4、生命的篇章。腾出的空间再写生命的篇章。n n 第4页/共19页第五页，共19页。细胞细胞(xbo)凋亡与细胞凋亡与细胞(xbo)坏坏死的区别死的区别坏死坏死(hui s) 凋亡凋亡1.性质性质(xngzh)2.诱导因素诱导因素强烈刺激，随机发生强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生较弱刺激，非随机发生3.生化特点生化特点4.形态变化形态变化6.DNA电泳电泳5.炎症反应炎症反应7.凋亡小体凋亡小体8.基因调控基因调控被动过程，无新蛋白合成，被动过程，无新蛋白合成，不耗能不耗能 主动过程，有新蛋白合成，主动过程，有新蛋白合成，耗能耗能细胞结构全面溶解、破坏、细胞细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀肿
5、胀 胞膜及细胞器相对完整细胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩胞皱缩，核固缩弥散性降解，电泳呈均一弥散性降解，电泳呈均一DNA片状片状 DNA片段化（片段化（180-200bp），），电泳呈电泳呈“梯梯”状条带状条带溶酶体破裂，局部炎症反溶酶体破裂，局部炎症反应应溶酶体相对完整，局部溶酶体相对完整，局部无炎症反应无炎症反应有有病理性，非特异性病理性，非特异性生理性或病理性，特异性生理性或病理性，特异性无无有有无无第5页/共19页第六页，共19页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的形态特征的形态特征n（1 1）凋亡的起始；微绒毛的消失，细胞间接触的消失，与周围的细）凋亡的起始；微绒毛的消失，细胞
6、间接触的消失，与周围的细胞脱离，细胞质中，线拉体大体胞脱离，细胞质中，线拉体大体(dt)(dt)完整，染色质固缩完整，染色质固缩n（2 2） 细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素色素C C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面n（3 3）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围n（4 4）凋亡小体逐渐被
7、周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。第6页/共19页第七页，共19页。细胞细胞(xbo)凋亡的形态学特征凋亡的形态学特征第7页/共19页第八页，共19页。细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病n细胞凋亡不足：细胞凋亡不足：n肿瘤，自身肿瘤，自身(zshn)免疫病免疫病n细胞凋亡过度：细胞凋亡过度：n心肌缺血，心力衰竭，神经元心肌缺血，心力衰竭，神经元 退行性疾病，病毒感退行性疾病，病毒感染染第8页/共19页第九页，共19页。细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)检检测方法测方法基于基于(jy)形态学观察的染色法形态学观察的染色法基于基于(jy)DNA 片断化的
8、检测法片断化的检测法膜联蛋白检测法膜联蛋白检测法Caspase酶分析法酶分析法流式细胞仪定量分析法流式细胞仪定量分析法 第9页/共19页第十页，共19页。第10页/共19页第十一页，共19页。第11页/共19页第十二页，共19页。第12页/共19页第十三页，共19页。第13页/共19页第十四页，共19页。 实验实验(shyn)仪器、材料及仪器、材料及试剂试剂1、仪器、用具、仪器、用具(yngj)：荧光显微镜、显微载玻片、盖玻片、微量：荧光显微镜、显微载玻片、盖玻片、微量2、培养的细胞材料：、培养的细胞材料：HeLa细胞细胞3、试剂：、试剂：吖碇橙吖碇橙/溴化乙锭（溴化乙锭（AO/EB)的的PB
9、S溶液：溶液：PBS溶液中分别加入溶液中分别加入100g/mL 的的AO与与100g/mL 的的EB，配成两种溶液，用时再混合。，配成两种溶液，用时再混合。磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS)：800mL蒸馏水中溶解蒸馏水中溶解8g NaCL、0.2g KCL、1.44g Na2HPO4 、0.24g kH2PO4 ，用盐酸调，用盐酸调pH到到7.4，加水定容到，加水定容到1L。高压灭菌保。高压灭菌保存。存。移液器、高压灭菌锅、细胞培养用具移液器、高压灭菌锅、细胞培养用具第14页/共19页第十五页，共19页。 实验实验(shyn)步骤步骤（1）Hela细胞贴壁生长于DMEM培养液中含10%胎牛
10、血清，置37 5%CO2培养箱中培养23天，待细胞形成单层融合状态。（2）去细胞培养液，加入0.215mol/L双氧水的10%胎牛血清培养液中，继续培养2436小时。（3）收集细胞：用细胞消化液消化细胞使细胞脱壁，制成单细胞悬液。1000X g离心力离心5分钟，弃上清。（4） 取25l培养的细胞悬液滴于载玻片上，稍风干后，加入AO/EB 1:1混合液染色(rns)，并盖上盖玻片。（5） 荧光显微镜下观察。第15页/共19页第十六页，共19页。 1、EB为强诱变剂，使用为强诱变剂，使用(shyng)时要注意防护时要注意防护2、试剂、试剂(shj)与细胞孵育完毕后，要立即检测与细胞孵育完毕后，要立
11、即检测3、正确使用显微镜，保护好镜头和滤光片、正确使用显微镜，保护好镜头和滤光片第16页/共19页第十七页，共19页。 课后作业课后作业(zuy)及思考及思考1、练习、练习(linx)用用AO/EB法检测凋亡的细胞，掌握荧光显微镜的使用法检测凋亡的细胞，掌握荧光显微镜的使用2、查阅相关文献，理清细胞凋亡与细胞坏死的区别、查阅相关文献，理清细胞凋亡与细胞坏死的区别3、了解其它可用于细胞凋亡检测的方法及其原理、了解其它可用于细胞凋亡检测的方法及其原理第17页/共19页第十八页，共19页。1、了解细胞凋亡的最新研究进展，结合自己的知识预测、了解细胞凋亡的最新研究进展，结合自己的知识预测(yc)未来细胞凋亡的研究方向未来细胞凋亡的研究方向2、你认为对细胞、你认为对细胞(xbo)凋亡机制的深入研究，会对生命科学和医学带来何种影响凋亡机制的深入研究，会对生命科学和医学带来何种影响 ?第18页/共19页第十九页，共19页。