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1、生物化学实用技术 章宇宁在同一个碳原子上连接有氨基和羧基的有机物结构通式：作业一：写出氨基酸的结构通式共同点：共同点：除脯氨酸外，均为除脯氨酸外，均为-氨基酸氨基酸，即同一，即同一碳原子上有羧基、氨基与氢。碳原子上有羧基、氨基与氢。不同点：不同点：侧链侧链R R基团不同。基团不同。例外：例外：脯氨酸：严格来说是脯氨酸：严格来说是亚氨基酸亚氨基酸各种生物体中出现的氨基酸约有180种符合通式的、人工合成的氨基酸更多直接参与组成蛋白质的天然氨基酸只有20种，称为蛋白质氨基酸，又称为基本氨基酸或编码氨基酸由20种基本氨基酸经过修饰得到的氨基酸称为非编码蛋白质氨基酸，又称为修饰氨基酸或稀有氨基酸氨基酸生
2、物体中自然存在的蛋白质氨基酸基本氨基酸（编码氨基酸）修饰氨基酸（稀有氨基酸）非蛋白质氨基酸人工合成的2020种种氨基酸的发现年代表氨基酸的发现年代表天冬酰氨天冬酰氨 1806 1806 Vauquelin Vauquelin 天冬门芽天冬门芽甘氨酸甘氨酸 1820 1820 Braconnot Braconnot 明胶明胶亮氨酸亮氨酸 1820 1820 Braconnot Braconnot 羊毛、肌肉羊毛、肌肉酪氨酸酪氨酸 1849 1849 Bopp Bopp 奶酪奶酪丝氨酸丝氨酸 1865 1865 Cramer Cramer 蚕丝蚕丝谷氨酸谷氨酸 1866 1866 Ritthaus
3、en Ritthausen 面筋面筋天冬氨酸天冬氨酸 1868 1868 Ritthausen Ritthausen 蚕豆蚕豆苯丙氨酸苯丙氨酸 1881 1881 Schultze Schultze 羽扇豆芽羽扇豆芽丙氨酸丙氨酸 1881 1881 Weyl Weyl 丝心蛋白丝心蛋白 赖氨酸赖氨酸 1889 1889 Drechsel Drechsel 珊瑚珊瑚精氨酸精氨酸 1895 1895 Hedin Hedin 牛角牛角组氨酸组氨酸 1896 1896 Kossel,Hedin Kossel,Hedin 奶酪奶酪胱氨酸胱氨酸 1899 1899 Morner Morner 牛角牛角缬氨
4、酸缬氨酸 1901 1901 Fischer Fischer 奶酪奶酪脯氨酸脯氨酸 1901 1901 Fischer Fischer 奶酪奶酪色氨酸色氨酸 1901 1901 Hopkins Hopkins 奶酪奶酪异亮氨酸异亮氨酸 1904 1904 Erhlich Erhlich 纤维蛋白纤维蛋白甲硫氨酸甲硫氨酸 1922 1922 Mueller Mueller 奶酪奶酪苏氨酸苏氨酸 1935 1935 McCoy et al McCoy et al 奶酪奶酪基本氨基酸的分类方法一：按侧链结构分类脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸(15(15种种) )芳香族氨基酸芳香族氨基酸(3(3种种) )杂
5、环氨基酸杂环氨基酸(2(2种种) )基本氨基酸的分类方法二：按侧链R基团极性分类非极性非极性( (疏水疏水) )氨基酸氨基酸(9(9种种) )极性不带电荷氨基酸极性不带电荷氨基酸(6(6种种) )极性带正电荷氨基酸极性带正电荷氨基酸( (碱性氨基酸碱性氨基酸)(3)(3种种) )极性带负电荷氨基酸极性带负电荷氨基酸( (酸性氨基酸酸性氨基酸)(2)(2种种) )非极性非极性( (疏水疏水) )氨基酸（氨基酸（9 9种）种）极性带正电荷氨基酸（极性带正电荷氨基酸（3 3种）种）极性带负电荷氨基酸（极性带负电荷氨基酸（2 2种）种）基本氨基酸的分类方法三：按人体能否合成分类必需氨基酸：必需氨基酸：
6、机体不能自身合成，必机体不能自身合成，必须由食物供给的氨基酸须由食物供给的氨基酸 人体必需氨基酸有八种：人体必需氨基酸有八种： Met Met TrpTrp Lys Val Ile Lys Val Ile LeuLeu PhePhe ThrThr “ “假假 设设 来来 借借 一一 两两 本本 书书”作业二：必需氨基酸的定义是什么？八种必需氨基酸的名字分别是什么？基本氨基酸的分类方法三：按人体能否合成分类半必需氨基酸：半必需氨基酸：人体可合成，但合成量不足，如人体可合成，但合成量不足，如精氨酸精氨酸及及组氨酸组氨酸。非必需氨基酸：非必需氨基酸：可自身合成且能满足需要的氨基酸（可自身合成且能满足
7、需要的氨基酸（1010种）种）修饰氨基酸：由基本氨基酸经酶催化，通过化学修饰转化而来非蛋白质氨基酸：某些氨基酸的中间代谢产物，具有一定的生理功能中文名称：牛磺酸 英文名称Taurine 学名：2-氨基乙磺酸 牛磺酸颗粒分子式(Formula)：NH2CH2CH2SO3H 分子量(Molecular Weight)： 125.15 牛磺酸（Taurine）又称2-氨基乙磺酸，最早由牛黄中分离出来，故得名。纯品为无色或白色斜状晶体，无臭，化学性质稳定，溶于乙醚等有机溶剂，是一种含硫的非蛋白氨基酸，在体内以游离状态存在，不参与体内蛋白的生物合成。 牛磺酸虽然不参与蛋白质合成，但它却与胱氨酸、半胱氨酸
8、的代谢密切相关。人体合成牛磺酸的半胱氨酸亚硫酸羧酶（CSAD）活性较低，主要依靠摄取食物中的牛磺酸来满足机体需要。物理性质物理性质 吸收光谱性质吸收光谱性质两性解离性质与等电点两性解离性质与等电点化学反应化学反应物理性质-氨基酸为无色晶体，熔点较高。氨基酸为无色晶体，熔点较高。不同氨基不同氨基酸结晶形态不同。酸结晶形态不同。一般情况下，大多数氨基酸溶解于水而不溶于一般情况下，大多数氨基酸溶解于水而不溶于有机溶剂有机溶剂( (除半胱氨酸和酪氨酸外，其他氨基酸除半胱氨酸和酪氨酸外，其他氨基酸一般均能溶于水、稀酸、稀碱；除脯氨酸外，其一般均能溶于水、稀酸、稀碱；除脯氨酸外，其他氨基酸一般均不能溶于有
9、机溶剂他氨基酸一般均不能溶于有机溶剂) )。紫外吸收光谱性质构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基酸在可见光区种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)(220nm)均有光吸收。均有光吸收。在近紫外区在近紫外区(220-300(220-300nm)nm)只有只有酪氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸苯丙氨酸和和色氨酸色氨酸有吸收光的能力有吸收光的能力紫外吸收光谱性质两性解离性质及等电点两性解离性质及等电点氨基酸的等电点氨基酸的等电点(pI)(pI)：氨基酸的氨基酸的净电荷为零时所处溶液的净电荷为零时所处溶液的pHpH值。值。意义：意义：氨基酸处于等电点时，氨基酸处于
10、等电点时，其溶其溶解度最小，最易沉淀。解度最小，最易沉淀。此性质常用此性质常用于分离制备特定的氨基酸。于分离制备特定的氨基酸。作业三：“氨基酸的等电点”的定义是什么？写出氨基酸两性电离的通式。两性解离性质及等电点补充：pI的计算pKpK值（解离常数）值（解离常数）： 指某种解离基团有一半指某种解离基团有一半 被解离时的被解离时的pHpH值值pI=(pKpI=(pK1 1+pK+pK2 2)/2)/2化学反应1：与茚三酮的显色反应-氨基酸与水合茚三酮溶液共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧，水合茚三酮与反应产物（氨、还原型茚三酮）生成蓝紫色产物（脯氨酸Pro和羟脯氨酸Hyp呈黄色）反应受溶液pH值影响
11、。产物色深与溶液中氨基浓度成正比。该反应可用于定性和定量检测氨基酸化学反应1：与茚三酮的显色反应化学反应2：与甲醛反应与甲醛反应反应：反应： 氨基酸与甲醛反应生成羟甲基、二氨基酸与甲醛反应生成羟甲基、二羟甲基氨基酸，同时释放羟甲基氨基酸，同时释放H H+ +。化学反应2：与甲醛反应与甲醛反应应用：可促进氨基酸两性离子中-NH3+解离，从而使滴定终点pH值下降23个单位。使用此法后，可以用NaOH滴定氨基酸中的羧基氢离子，以测定氨基酸的浓度。此方法被称为“甲醛滴定法”是构成生物体蛋白质的基本单位直接参与生物体内的新陈代谢和其他生理活动人工合成激素、肽、氨基酸衍生物等的重要原料定性鉴别溶液中是否含
12、有氨基酸/样品是不是氨基酸茚三酮显色法定性鉴别溶液中是否含有某种氨基酸/样品是不是某种氨基酸薄层色谱法结晶法需要已知样品作为对照定性鉴别溶液中是否含有某种氨基酸/样品是不是某种氨基酸利用某些氨基酸的特殊反应、特殊性质，如：脯氨酸，羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸在280nm左右有光吸收其他化学反应1.1.米伦反应：米伦反应：酪氨酸与米伦试剂（硝酸汞溶于含有少量亚硝酸的硝酸中）反应即生成白色沉淀，加热后变成红色。含有酪氨酸的蛋白质也有此反应；2.2.坂口反应：坂口反应：在碱性溶液中，胍基与含有萘酚及次溴酸盐的试剂反应，生成红色物质。这是对于精氨酸专一性较强、灵敏度较高的一个反应
13、；3.3.PaulyPauly反应：反应：组氨酸的咪唑基在碱性条件下，可与重氮化的对氨基苯磺酸偶联产生红色物质。酪氨酸也有此反应；4.4.醛类反应：醛类反应：在硫酸存在下，色氨酸与对二甲氨基苯甲醛反应产生紫红色化合物，此反应用于鉴定色氨酸；5.5.铅黑反应：铅黑反应：胱氨酸和半胱氨酸被强碱破坏后，能放出硫化氢，与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀。测定溶液中氨基酸浓度：茚三酮显色分光法甲醛滴定法高效液相色谱氨基酸自动分析仪沉淀分离法 溶解度法 等电点法 特殊试剂沉淀法 有机溶剂沉淀法吸附法 活性炭法 离子交换树脂法膜分离法萃取法结晶法电泳法（1）溶解度法 ：依据不同氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度
14、差异而进行分离的方法。 胱氨酸/酪氨酸，酪氨酸易溶于热水。（2 2）等电点法：等电点法：根据氨基酸的等电点不同，在等电点时，氨基酸分子的净电荷为零，有利于氨基酸分子的彼此吸引而形成结晶体沉淀下来。 通过调节溶液的pH值，可以分离等电点差异较大的氨基酸（3 3）有机溶剂法：）有机溶剂法：是利用某种有机溶剂使需要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀。（4）特殊试剂沉淀法 ：采用某些有机或无机试剂与相应氨基酸形成不溶性衍生物的分离方法。 精氨酸与苯甲醛生成沉淀，盐酸去除苯甲醛是最早应用于混合氨基酸分离的方法之一。某些氨基酸可以与一些有机化合物或无机化合物结合，形成结晶性衍生物沉淀，达到与其它氨基
15、酸分离的目的，但是，特殊沉淀法的沉淀剂回收困难，排放废液中参杂有沉淀剂，加重了污染，残留在氨基酸产品中的沉淀剂还会影响纯度。精氨酸与苯甲醛在碱性和低温条件下,可缩合成溶解度很小的苯亚甲基精氨酸,将沉淀用盐酸水解除去苯甲醛,即可得精氨酸盐酸盐；亮氨酸与邻- 二甲苯- 4 - 磺酸反应,生成亮氨酸的磺酸盐,后者与氨水反应,得到亮氨酸。组氨酸与氯化汞作用,生成组氨酸汞盐的沉淀,再经硫化氢的处理就可得组氨酸 亮氨酸与邻- 二甲苯- 4 - 磺酸反应,生成亮氨酸的磺酸盐,后者与氨水反应,得到亮氨酸。发酵液酸化液酸化过滤滤液水解脱色液脱色液脱色氨解液亮氨酸磺酸复盐pH2.580oC,20min邻- 二甲苯
16、- 4 - 磺酸氨解80oC,60min过滤亮氨酸粗品亮氨酸溶液活性炭脱色常温下结晶减压浓缩浓缩液亮氨酸结晶亮氨酸精品干燥80oC,3h 沉淀法具有简单、方便、经济和浓缩倍数沉淀法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点，广泛应用于氨基酸工业提取中。高的优点，广泛应用于氨基酸工业提取中。 目前较成熟的工艺有目前较成熟的工艺有: :苯甲醛缩合提取精氨苯甲醛缩合提取精氨酸酸; ;邻邻- -二甲苯二甲苯-4-4-磺酸沉淀提取亮氨酸磺酸沉淀提取亮氨酸; ;氯化汞氯化汞沉淀提取组氨酸沉淀提取组氨酸; ;从生产半胱氨酸的废母液中从生产半胱氨酸的废母液中回收胱氨酸回收胱氨酸; ;此外目前国内味精厂也都采用等此
17、外目前国内味精厂也都采用等电点沉淀法提取谷氨酸。电点沉淀法提取谷氨酸。（3）活性炭法 ：利用吸附剂（活性炭）对不同氨基酸吸附力的差异进行分离的方法。 活性炭吸附苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸（4）离子交换法：利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力的差异进行分离的方法。 利用离子交换树脂对不同的氨基酸吸附能力的差异对氨基酸合物进行分组或实现单一成分的分离。离子交换法是氨基酸工业中应用最广泛的分离与纯化方法之一。 氨基酸是一种两性电解质，在酸溶液中，氨基酸以阳离子状态存在，因而能被阳离子交换树脂交换吸附;在碱性溶液中，氨基酸能以阴离子的状态存在，因而能被阴离子交换树脂吸附。根据氨基酸分子中既有氨基又有羧基的
18、两性电离特性，分子中侧链基团(R)的性质和等电点的范围，调节氨基酸混合液的PH值，选择恰当的离子交换树脂，配合相应的交换基团，可以从混合氨基酸中分离出酸性、碱性和中性氨基酸。 缺点：缺点：只有当欲被分离的混合氨基酸之间的等电点相差较大时才能较好地分开 氨基酸离子在树脂中的扩散速度较慢，因此一方面要求料液的流速较低。另一方面对于氨基酸浓度较高的料液在上离子交换柱前还要进行稀释，这就必然导致所需的设备太大; 此外，离子交换法由于本身的生产原理决定了生产过程难以连续化。 正是这些缺点，离子交换法用于混合氨基酸的分离并没有在大规模的生产中推广。 膜过滤法可以实现混合溶液的分离是因为在膜和溶液的界面处存
19、在以下机理: 亲水性等原因所引起的选择性透过; 筛分效应- 待分离物质分子的直径大于膜孔的直径,将被截留,反之则透过; 电荷效应(Donnan 效应) - 若膜表面带与待分离物质同种电荷,则会产生静电排斥作用,反之则会产生吸引作用。 国外膜分离工艺已应用于乳制品工业。采用反渗透浓缩乳清，使用超滤法从乳清中制备浓缩蛋白质，使用微米膜分离乳清中的蛋白质，去除脱脂乳中的细菌，使用纳滤膜去除乳清中的矿物质。近些年，又开始研究膜过滤分离蛋白质、肽和氨基酸的可行性。在人体的新陈代谢过程中存在大量生物膜渗透现象。研究氨基酸的膜分离不仅可以找出有效的生物分离技术，而且有助于加深对这些新陈代谢过程的了解。氨基酸
20、不溶于普通有机溶剂,因此采用通常的溶剂萃取法不能奏效,必须采用反应萃取法,即选择适当的反应萃取剂,其解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应,生成可以溶于有机相的萃取配合物,从而使氨基酸从水相进入有机相。近年来,采用溶剂萃取法分离氨基酸的研究报道很多,但大多是提出了专利申请,或处于研究阶段,未见工业报道。要实现工业化,至少要先解决两个问题: 其一是萃取过程中乳化的问题。 其二是低毒萃取剂的选择和萃取剂残留物对于产品质量的影响。萃取法用于处理发酵液,也取决于新方法在收率上与原来的方法相比较能够获得多大的经济效益。电泳是指带电质点在电场中向与本身所带电荷相反的电极移动的现象。由于不同氨基酸具有不同的等电点，在一定pH条件下，不同氨基酸就带有不同性质的电荷，从而在外电场的作用下被分离开。 电泳的方向和速度主要取决于所带电荷性质、数目及相对分子质量的大小。