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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流BIO-RAD双向电泳培训资料.精品文档.双向电泳实验流程l 样品制备（Sample preparation）l 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration）l 第一向等电聚焦（IEF）l 胶条的平衡（IPG strip equilibration）l 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis）l 凝胶的染色及检测（Detection/Staining）l PDQuest软件分析（Software analysis）l 质谱鉴定（Protein identification）l 我方主要工
2、作人员通讯录目录第一章 实验材料11 IPG预制胶条及载体两性电解质12 蛋白质定量试剂盒及其试剂13 试剂盒及其试剂14 化学试剂15 蛋白质Marker16 染色试剂17 注意事项第二章SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳2. 1 溶液的配制2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制2. 3 操作方法2. 4 注意事项第三章双向电泳3. 1 溶液配制3. 2 操作步骤3. 3 注意事项附录1双向电泳完整的操作步骤附录2聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3细胞样品的一般处理步骤附录4组织样品的一般处理步骤附录5我方主要工作人员通讯录第一章 实验材料11 IPG预制胶条及载体两性电解质（一）IPG预制胶
3、条（美国Bio-Rad公司），-20冰箱保存IPG预制胶条pH 3-10，7 cm163-2000IPG预制胶条pH 3-10，7 cm，nonlinear（NL）163-2002IPG预制胶条pH 4-7， 7 cm163-2001IPG预制胶条pH 3-6， 7 cm163-2003IPG预制胶条pH 5-8， 7 cm163-2004IPG预制胶条pH 7-10，7 cm163-2005IPG预制胶条pH 3-10，17cm163-2007IPG预制胶条pH 3-10，17 cm，nonlinear（NL）163-2009IPG预制胶条pH 4-7， 17cm163-2008IPG预制胶
4、条pH 3-6， 17cm163-2010IPG预制胶条pH 5-8， 17cm163-2011IPG预制胶条pH 7-10，17cm163-2012IPG预制胶条pH 3-10，18cm163-2032IPG预制胶条pH 3-10，18cm，nonlinear（NL）163-2033IPG预制胶条pH 4-7， 18cm163-2034IPG预制胶条pH 3-6， 18cm163-2035IPG预制胶条pH 5-8， 18cm163-2036IPG预制胶条pH 7-10，18cm163-2037IPG预制胶条pH 3-10，11cm163-2014IPG预制胶条pH 3-10，11cm，no
5、nlinear（NL）163-2016IPG预制胶条pH 4-7， 11cm163-2015IPG预制胶条pH 3-6， 11cm163-2017IPG预制胶条pH 5-8， 11cm163-2018IPG预制胶条pH 7-10，11cm163-2019IPG预制胶条pH 3.9-5.1，17cm163-2020IPG预制胶条pH 4.7-5.9，17cm163-2021IPG预制胶条pH 5.5-6.7，17cm163-2022IPG预制胶条pH 6.3-8.3，17cm163-2023IPG预制胶条pH 3.9-5.1，18cm163-2038IPG预制胶条pH 4.7-5.9，18cm1
6、63-2039IPG预制胶条pH 5.5-6.7，18cm163-2040IPG预制胶条pH 6.3-8.3，18cm163-2041IPG预制胶条pH 3.9-5.1，11cm163-2024IPG预制胶条pH 4.7-5.9，11cm163-2025IPG预制胶条pH 5.5-6.7，11cm163-2026IPG预制胶条pH 6.3-8.3，11cm163-2027IPG预制胶条pH 3.9-5.1，7cm163-2028IPG预制胶条pH 4.7-5.9，7cm163-2029IPG预制胶条pH 5.5-6.7，7cm163-2030IPG预制胶条pH 6.3-8.3，7cm163-2
7、031（二）载体两性电解质（美国Bio-Rad公司），4冰箱保存Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，10ml163-1112Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，25ml163-1113Bio-Lyte 3/5 Ampholyte，20%，10ml163-1132Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，10ml163-1142Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，25ml163-1143Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，10ml163-1152Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，25ml1
8、63-1153Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，10ml163-1162Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，25ml163-1163Bio-Lyte 7/9 Ampholyte，40%，10ml163-1172Bio-Lyte 8/10 Ampholyte，20%，10ml163-1182Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，10ml163-1192Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，25ml163-1193（三）等电聚焦上样缓冲液（美国Bio-Rad公司），4冰箱保存100ReadyStrip Buffer，for pH
9、 7-10 IPG Strips，1ml163-2093Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，100，1ml163-2094100ReadyStrip Buffer，for pH 6.8-8.3 IPG Strips，1ml163-2095100ReadyStrip Buffer，for pH 5.5-6.7 IPG Strips，1ml163-2096100ReadyStrip Buffer，for pH 4.7-5.9 IPG Strips，1ml163-2097100ReadyStrip Buffer，for pH 3.5-5.1 IPG Strips，1ml163-20981
10、2 蛋白质定量试剂盒及其试剂Protein Assay Kit I，bovine -globulin standard500-0001Protein Assay Kit II，BSA standard500-0002Protein Standard I，bovine -globulin，1 bottle500-0005Protein Assay Dye Reagent Concentrate，450ml500-0006Protein Standard II，bovine serum albumin，1 bottle500-0007RC DC Protein Assay Kit I，bovine
11、 -globulin standard500-0121RC DC Protein Assay Kit II，BSA standard500-012213 试剂盒及其试剂ReadyPrep Sequential Extraction Kit163-2100Tributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml163-2101ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 1，1vial163-2102ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 2，1vial163-2103ReadyPrep Seq
12、uential Extraction Kit Reagent 3，1vial163-2104ReadyPrep 2-D Starter Kit163-2105ReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer163-2106ReadyPrep Starter Kit Equilibration Buffer I，with DTT163-2107ReadyPrep Starter Kit Equilibration BufferII163-2108Iodoacetamide，30g163-2109E.coli Protein Sample，ly
13、ophilized，2.7mg163-2110ReadyPrep Overlay Agarose，50ml163-211114 化学试剂尿素Urea，250g161-0730尿素Urea，1kg161-0731AG 501-X8（D）Mixed Bed Resin142-6425CHAPS，1g161-0460CHAPSO，1g161-0465Triton X-100，500ml161-0407DTT（Dithiothreitol），1g161-0610DTT（Dithiothreitol），5g161-0611Tributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml163-210
14、1溴酚蓝（Bromophenol Blue），10g161-0404矿物油（Mineral Oil），500ml163-2129SDS，25g161-0300SDS，100g161-0301SDS，1kg161-0302Tris，100g161-0715Tris，500g161-0716Tris，1kg161-0719Iodoacetamide，30g163-2109低熔点琼脂糖，25g161-3111甘氨酸，250g161-0717甘氨酸，1kg161-0718甘氨酸，2kg161-0724丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，100g161-0100丙烯酰胺（Acrylamide）
15、，99.9%，500g161-0101丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，2kg161-0103丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，1kg161-0107丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，5kg161-0108甲叉双丙烯酰胺（Bis），5g161-0200甲叉双丙烯酰胺（Bis），50g161-0201PDA（Piperazine Diacrylamide），10g161-0202PDA（Piperazine Diacrylamide），50g161-0203过硫酸氨（Ammonium Persulfate），10g161-0700过硫酸氨（Ammonium P
16、ersulfate），100g161-0754TEMED，5ml161-0800TEMED，50ml161-0801甘油国产或Sigma硫尿Sigma15 蛋白质Marker2-D SDS-PAGE Standards，500ml161-0320SDS-PAGE Standards，high range，200ml161-0303SDS-PAGE Standards，low range，200ml161-0304SDS-PAGE Standards，broad range，200ml161-0317Polypeptide SDS-PAGE Standards，200ml161-0326Prec
17、ision Protein Standards，unstained，1500ml，150 applications161-0362Precision Protein Standards，prestained，500ml，50 applications161-0372Kaleidoscope Polypeptide Standards，500ml161-0325Kaleidoscope Prestained Standards，broad range，500ml161-0324Prestained SDS-PAGE Standards，high range，500ml161-0309Presta
18、ined SDS-PAGE Standards，low range，500ml161-0305Prestained SDS-PAGE Standards，broad range，500ml161-0318IEF Standards，pI range 4.45-9.6，250ml161-031016 染色试剂Coomassie Brilliant Blue R-250，10g161-0400Coomassie Brilliant Blue G-250，10g161-0406IEF Gel Staining Solution，1L161-0434Coomassie Brilliant Blue R
19、-250 Staining Solutions Kit161-0435Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，1L161-0436Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，41L161-0437Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，1L161-0438Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，41L161-0439Bio-Safe Coomassie
20、Stain，1L161-0786Bio-Safe Coomassie Stain，5L161-0787SYPRO Ruby Protein Gel Stain，200ml170-3126SYPRO Ruby Protein Gel Stain，1L170-3125SYPRO Ruby Protein Gel Stain，5L170-3138Silver Stain Kit161-0443Silver Stain Plus Kit161-045017 注意事项1.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级。尽量选用进口试剂。2.双向电泳中使用MilliQ水（电导小于1mS）。3.所有包含尿素
21、的溶液加热温度不超过30，否则会发生蛋白氨甲酰化。详细订货信息请参考BIO-RAD中英文目录第二章 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳2. 1 溶液的配制30% 聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150g甲叉双丙烯酰胺4gMilliQ水500ml滤纸过滤后，棕色瓶4冰箱保存。1.5mol/L Tris碱 pH8.8Tris碱90.75gMilliQ水400ml用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4冰箱保存。0.5mol/L Tris碱 pH6.8Tris碱12gMilliQ水120ml用1mol/L HCl调pH至6.8，加MilliQ水定容至200ml。4冰箱保存。1
22、0% SDSSDS10gMilliQ水100ml混匀后，室温保存。10% ApAp0.1gMilliQ水1ml（用时加水溶解）溶解后，4冰箱保存。10电泳缓冲液（1= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）Tris碱30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混匀后，室温保存。2SDS-PAGE上样缓冲液0.5M pH6.8 Tris碱2.0ml10% SDS4.0ml甘油2.0ml1% 溴酚蓝0.05mlMilliQ水定容至10mlDTT0.154g（用时现加）2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制参见附录1。2. 3 操作方法1. 将玻璃板洗净、
23、晾干、固定。2. 按照实验要求，配制不同浓度的分离胶。将分离胶注入玻璃板夹层中，上部用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，配制浓缩胶。3. 配制好浓缩胶后，倒去分离胶表面的少量水分，然后灌入浓缩胶，插入点样梳。4. 将待分析鉴定的蛋白质样品，加入等体积2SDS-PAGE上样缓冲液，100水浴3-5分钟（插入冰浴冷却后加样）。5. 在电泳槽加入电泳缓冲液后，小心拔去上样梳，然后用注射器洗干净加样孔，检查一下电路连通状况（注意正负级），然后关闭电源。用微量加样器分别吸取待分析样品，根据蛋白质浓度和加样孔体积决定加样量。6. 加样完毕后，接通电源，起始时用的低电流或
24、低电压，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流（或电压），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。7. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。8. 染色。2. 4 注意事项1. 玻璃板一定要清洗干净，否则在染色时会有不必要的凝胶背景。2. 过硫酸铵（Ap）要新鲜配制。40%的过硫酸铵储存于冰箱中只能使用2-3天，低浓度的过硫酸铵溶液只能当天使用。3. 蛋白质从浓缩胶部分到分离胶部分转移为避免点脱尾和损失高分子量蛋白，应缓慢进行（场强小于10V/cm）。4. 用Mini Protein 3电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为5mA/gel，
25、待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到10-15mA/gel；以电压为标准，开始进样的低电压为50-75V/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电压到150-200V /gel。用Protein II电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为10mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到20-30mA/gel；以电压为标准，开始进样的低电压为75-100V /gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电压到300-400mA/gel。第三章 双向电泳3. 1 溶液配制水化上样缓冲液（I）尿素8M4.805gCHAPS 4%0.4gDTT65mM0.0
26、98g（现加）Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml（40%）（现加）溴酚蓝0.001%10ml（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml分装成10小管，每小管1ml，-20冰箱保存。水化上样缓冲液（II）尿素7M4.2g硫脲2M1.52gCHAPS 4%0.4gDTT65mM0.098g（现加）Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml（40%）（现加）溴酚蓝0.001%10ml（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml分装成10小管，每小管1ml，-20冰箱保存。水化上样缓冲液（III）尿素5M3.0g硫脲2M1.52gCHAPS 2%0.2gSB 3-10 2%0.2gDTT65
27、mM0.098g（现加）Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml（40%）（现加）溴酚蓝0.001%10ml（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml分装成10小管，每小管1ml，-20冰箱保存。胶条平衡缓冲液母液尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.375M pH8.825ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl）甘油20%20mlMilliQ水定容至100ml分装成10管，每管10ml，-20冰箱保存。胶条平衡缓冲液I胶条平衡缓冲液母液10mlDTT0.2g充分混匀，用时现配。胶条平衡缓冲液II胶条平衡缓冲液母液10ml碘乙酰胺0.25g 充分混匀，用时现配。低熔点琼脂糖
28、封胶液低熔点琼脂糖0.5%0.5gTris25mM0.303g甘氨酸192mM1.44gSDS0.1%1ml（10% SDS）溴酚蓝0.001%100ml（1%溴酚蓝）MilliQ水定容至100ml加热溶解至澄清，室温保存。30% 聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150g甲叉双丙烯酰胺4gMilliQ水500ml滤纸过滤后，棕色瓶4冰箱保存。1.5mol/L Tris碱 pH8.8Tris碱90.75gMilliQ水400ml用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4冰箱保存。10% SDSSDS10gMilliQ水100ml混匀后，室温保存。10% ApAp0.1gMi
29、lliQ水1ml（用时加水溶解）溶解后，4冰箱保存。10电泳缓冲液（1= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）Tris碱30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混匀后，室温保存。3. 2 操作步骤（一）第一向等电聚焦（用自制的电泳上样缓冲液，17cm的胶条，pH 4-7）1. 从冰箱中取-20冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml
30、样品，充分混匀。4. 从冰箱取-20冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），于室温放置10分钟。5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不
31、使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20冰箱保存。（二）第二向SDS-PAGE电泳1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，
32、保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。3. 从-20冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。4. 配制胶条平衡缓冲液I。5在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。7.
33、配制胶条平衡缓冲液II。8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。11.将10电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在
34、滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电
35、泳槽中。18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。20.进行染色（按照伯乐染色试剂盒上的操作步骤）。（三）等电聚焦程序设置7cm胶条水化50V12-16小时（17）主动水化S1250V线性30分钟除盐S2500V快速30分钟除盐S34000V线性3小时升压S44000V快速20,000伏小时聚焦S5500V快速任意
36、时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。（30-50mA/根）l 设置等电聚焦时的温度。（17）11cm胶条水化50V12-16小时（17）主动水化S1250V线性30分钟除盐S21000V快速30分钟除盐S38000V线性4小时升压S48000V快速40,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。（50mA/根）l 设置等电聚焦时的温度。（17）17cm胶条水化50V12-16小时（17）主动水化S1250V线性30分钟除盐S21000V快速1小时除盐S310000V线性5小时升压S410000V快速60,000伏小时
37、聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。（50-70mA/根）l 设置等电聚焦时的温度。（17）3. 3 注意事项（一）等电聚焦1. 配好的尿素储液必须马上使用，或用mixed-bed离子交换树脂，清除长时间放置时尿素溶液中形成的氰酸盐，预防蛋白质的甲酰化。2. 将水化上样缓冲液分装后再储存于-20。用时，只要解冻需要量，其余继续储存。水化上样缓冲液一旦溶解不能再冷冻。3. 将水化上样缓冲液加入蛋白样品中，终溶液中urea的浓度需6.5M。4. 等电聚焦溶胀缓冲液和样品溶液中都要加入两性电解质，它能够帮助蛋白质溶解。两性电解质的选择取决于IPG胶条的
38、pH范围。下图可提供参考。IPGpH RangeBio-Lyte Ampholyte(Stock)Range Conc.(w/v)Sample Solution VolumePer 5ml per50ml3-103-1040%25ul250ul4-74-640%12.5ul125ul5-740%12.5ul125ul3-63-520%25ul250ul4-640%12.5ul125ul5-85-840%25ul250ul7-107-940%12.5ul125ul8-1020%25ul250ul5. 下表显示的是通常推荐使用的双向电泳第一向蛋白上样量。因为样品和样品之间存在差异，所以这种上样量仅
39、提供参考。对于窄pH范围的IPG胶条，需要比宽pH范围的IPG胶条上更多的样品，这是因为pI值不在此范围内的蛋白质在等电聚焦的过程中会走出胶条。单pH范围IPG胶条的上样量是通常的4-5倍还多，这样就可以很好的检测低丰度的蛋白质。IPG胶条的长度分析型的上样量（银或SYPRO Ruby染色）制备型的上样量（考马斯亮蓝染色）7 cm10-100ug蛋白200-500ug蛋白11cm50-200ug蛋白250-1,000ug蛋白17cm100-300ug蛋白1-3mg蛋白6. 样品溶液的上样体积见下表。这样就可以使胶条溶胀至它们原来的厚度（0.5mm）。胶条最少需要经过11小时的溶胀。即使看上去所
40、有的缓冲液都已经被吸收，也一定要确保胶条在槽中溶胀充分的时间。只有在IPG凝胶的孔径已经溶胀充分后，才可以吸收大分子量蛋白质，否则大分子量蛋白质无法进入胶条。ReadyStripTM IPG胶条的长度上样体积7 cm125ul-250ul11cm185ul-370ul17cm300ul-600ul7. 如果在等电聚焦过程中，聚焦盘中还有很多的溶液没有被吸收，留在胶条的外面，这样就会在胶条的表面形成并联的电流通路，而在这层溶液中蛋白质不会被聚焦。这就会导致蛋白的丢失或是图像拖尾。为了减少形成并联电流通路的可能性，可以先将胶条在溶胀盒中进行溶胀，然后再将溶胀好的胶条转移到聚焦盘中。在转移过程中，要用湿润的滤纸仔细地从胶条上吸干多余的液体。8. 带上手套用镊子去除IPG胶条上的保护层。将IPG胶条仔细的置于溶胀缓冲液上，胶面朝下，确保整个胶面都能被浸湿。9. 在样品溶液中加入痕量的溴酚蓝对观察溶胀过程很有帮助。在覆盖矿物油之前，可以让胶条先吸收1小时的液体。IPG胶条上一定要覆盖矿物油，否则缓冲液会蒸发，使得溶液浓缩，导致尿素沉淀。作为防止缓冲液蒸发的预防措施，矿物油必须缓缓地加在每个槽内，确保完全的覆盖住每一根胶条。10. 下面的表格给出了建议