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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流白菜雄不育基因的研究.精品文档.毕 业 论 文 题 目： 大白菜育性相关花粉囊专一性的脯氨酸富集蛋白基因BFAPG的获得及表达分析毕业论文任务书论文题目下发任务日期学生姓名指导教师一. 论文主要内容本研究以本课题组转育的大白菜雄性不育两用系 “AB01”为材料，采用抑制差减杂交（SSH）技术二.论文的基本要求1.有关资料的收集：要求尽量收集第一手资料，资料要真实、可靠、有代表性。2 资料的整理与分析：要求条理清晰，数据分析详尽。3 查阅相关文献：要求贴近主题，有参考价值。4 认真撰写论文，字数在10000字以上。三.论文工作进度安排阶段论文各
2、阶段名称日期1毕业论文设计2009.10.132009.10.302田间及实验室获取数据2009.11.152010.9.153实验数据分析2010.9.182010.12.304整理资料，攥写论文2011.3.12011.6.015论文完成2011.6.15备注：四.应收集的资料及主要参考文献（指导教师指定）1、说明：此任务由指导教师填写一式两份，一份发给学生，一份发给指导教师留存。沈阳农业大学毕业论文选题审批表选题名称题目来源自选学号姓名专业园艺指导教师冀瑞琴职称副教授研 究内 容研 究计 划特 色指 导 教 师 意 见教 研 室 意 见学 院 意 见毕业论文指导记录学生姓名专业园艺指导教
3、师姓名冀瑞琴职称副教授本年度指导毕业生人数4论文（设计）题目 指 导 过 程时间地点指导内容2009.11.032010.02.282010.05.222010.08.282010.11.082011.03.262011.05.22主楼334蔬菜实习基地主楼327实验室主楼327实验室主楼327实验室主楼334主楼334论文的撰写及课题研究的内容花粉的采集，实验材料的准备进行实验的前期准备，搜集资料在实验中的各个实验环节和步骤的掌握，仪器的使用，方法的了解数据的整理，文献和综述的整理论文的整体规划和写作论文写作指导学生签字：年 月日 指导教师签字：年 月日教研室主任签字：年 月日沈阳农业大学毕
4、业论文考核表论文题目：姓名： 学号： 专业：园艺指导教师评语： 指导教师（签字）： 年 月 日评阅人评审意见： 评阅人（签字）： 年 月 日成绩：答辩委员会意见： 主任委员（签字）： 年 月 日目 录29摘 要大白菜为两性花异花传粉蔬菜作物，杂种优势十分显著。由于其花器官小，单花结籽少，而单位面积的播种量又较大，常规的杂交制种必然存在去雄费工、费力、成本高等缺点。本课题组率先育成100%不育株率的雄性不育材料，但是，对其遗传规律的认识还停留在形态和细胞水平，产生雄性不育的分子基理还不清楚。本部分试验以大白菜核基因雄性不育甲型两用系不育、可育花蕾为材料，构建正反抑制差减cDNA文库，筛选出的大白
5、菜育性相关多铜氧化酶基因,并通过序列测定及生物信息学分析鉴定这个基因的功能，并利用RT-PCR 技术分析基因时空表达模式。为进一步克隆相关基因、揭示大白菜核基因雄性不育分子机理奠定。主要研究结果如下：（一）须须根、根、茎、叶、蕾中的RT-PCR时序表达结果显示，该基因除在可育花蕾中表达外，可育植株的其它部位及不育植株中均没有表达。不同等级大小花蕾中的时序表达结果显示，各等级可育花蕾中均有同等程度的表达，而在不育花蕾中均不表达。可育花蕾中花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊只在雄蕊中表达，而在其他花器官组织中均不表达。表明该基因为大白菜花蕾发育调控基因，它对育性控制发生在花蕾发生初期就已起作用。（二）说明BF
6、APG基因是一个受大白菜细胞核雄性不育基因抑制的基因。并且其基因可能与雄蕊的生长于发育有关，BFAPG基因的分离与表达分析可为进一步探讨氨基酸代谢在大白菜育性调控中的可能作用提供帮助。Abstract前言白菜（Brassica campestris L. ssp.pekinensis Makino）属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，起源于中国，栽培历史悠久，资源丰富，类型多样，是我国重要蔬菜之一，在各类蔬菜中栽培面积最大。在国际上，大白菜也从我国向世界各国传播，其中日本、朝鲜及东南亚一带栽培较多，历史较长。近年来，欧美等国家都已引入并有不同程度的发展。白菜产量高、耐贮藏、营养丰富。不但适合炒、煮
7、、拌、腌，而且还可生食越来越受到人们的喜爱。大白菜为典型的异花授粉作物，品种或自交系间一代杂种存在明显的杂种优势，国内外白菜的优良品种已绝大部分为一代杂种。一代杂种种子的生产是杂种优势利用的关键步骤之一。自“六五”开展全国攻关以来，在育种技术手段和方法上获得了较大的提高，相继育成了一大批优质、抗病，丰产的一代杂种并在生产上推广利用。白菜一代杂种的种子生产常用方法是利用自交不亲和系和雄性不育系。七十年代开始，为了克服自交不亲和系的缺点，我国选育出多个大白菜隐性核不育系。大白菜隐性核不育两用系的利用，解决了利用自交不亲和系制种亲本繁殖难和生活力下降的难题，但是在生产杂种时拔除母本行50%的可育株，
8、增加了育苗成本，此外，如可育株拔除不彻底，使杂交率降低，种子质量得不到保证。因而利用细胞质雄性不育系制种是生产一代杂种种子最经济，最有效的途径之一，因此受到世界各国育种者的重视。1.植物雄性不育1.1植物雄性不育研究简史植物雄性不育是指植株不能产生正常的花药、花粉或雄配子，而其雌性生殖系统发育和营养生长完全正常的一种生物学现象，其广泛存在于开花植物中。早在 1863 年Kolreuter 就观察到雄性不育现象，一个世纪后 Coleman 首先引入“植物雄性不育”的概念。目前，已在 43 科162属320种的617个品种或种间杂种中发现雄性不育现象2。1.2 植物雄性不育的类型及遗传机制植物雄性
9、不育有许多不同的表现，常见的有：（1）雄性器官萎缩，畸形或消失；（2）不能形成正常的小孢子发生组织；（3）小孢子发育异常，形成不完善的、不能存活的畸形或败育的花粉；（4）花粉不能成熟或无萌发能力；（5）能形成有活力的花粉，但花药不开裂。植物不能产生功能花药、花粉或雄配子的现象称雄性不育3。植物雄性不育是细胞核基因或细胞质基因或两者互作的结果，雄性不育的表现型是不育基因表达的结果，而基因型则是不育性的遗传本质和遗传模式。导致雄性不育的因素是多种多样的，因此，在分类上也因标准不同出现不同的分类系统。Sears 根据遗传机制的差异，将植物雄性不育可分为细胞核雄性不育，细胞质雄性不育和核质互作雄性不育
10、 3 种类型，称之为“三型学说”；Edwardson(1956)把“三型学说”中的质不育和质核互作不育并为一类，从而把植物雄性不育分为核不育型和核质互作不育型（常简称为细胞质雄性不育）简称为“二型学说”。Gabelman（1956）根据花粉、雄蕊的形态将雄性不育划分为花粉型、雄蕊型和功能型 3 类；Heslop-Harrison(1971)按世代交替把雄性不育划分为孢子体不育和配子体不育2种类型。Kaul在总结前人研究的基础上将植物雄性不育归纳为非遗传型和可遗传型 2 大类。随着与细胞质雄性不育基因特异作用的核基因的发现，已经证实，细胞质雄性不育仅仅是核质互作雄性不育的一个短暂的过程，不能被认
11、为一种雄性不育类型，因此，从不育性的基因型组成角度上划分，植物雄性不育有核质互作雄性不育和细胞核雄性不育2种类型，细胞核雄性不育简称核不育（Genie Male sterility,GMS或Nuclear Male Sterility,NMS），核质互作雄性不育简称细胞质不育(Cytoplasmic Male Sterility,CMS)。1） 细胞核雄性不育细胞核雄性不育由核基因控制，其作用不受细胞质类型的影响，因此，这种类型的雄性不育性的遗传和表达完全遵循孟德尔遗传规律。根据不育基因与对应的可育基因之间的显隐关系，又可分为隐性核不育和显性核不育两类。隐性核不育的遗传由一对隐性基因（msms
12、）控制。而显性核不育的遗传，通过遗传资料分析并不是单单由一对基因控制，至少由两对或两对以上基因控制。2） 核质互作雄性不育这种类型的雄性不育性由不育细胞质因子（S）和不育细胞核基因（fr）共同控制。当细胞核存在显性恢复基因（Fr）时，Fr 基因可以抑制不育胞质的作用而产生雄性可育。3） 细胞质雄性不育这种类型的不育性完全受细胞质遗传物质所主宰，与核基因无关，其遗传方式为母性遗传。当这种不育类型与细胞质可育父本交配，其子代总是不育的。属于这种类型的不育系，在理论上只有保持系，找不到恢复系。1.3植物雄性不育性的来源1） 自然突变雄性不育性的自发产生是由于细胞核基因或细胞质基因或两者的自然突变。由
13、可育基因突变为不育基因的频率很高。异花授粉植物自交或近交时更容易产生不育突变。2） 种间杂交植物雄性不育性不仅发生在种内，而且也出现在种间或属间杂种的后代。约74%核质互作雄性不育来自种间或属间杂种的后代。3） 理化诱导物理和化学诱变剂单独或联合处理已在 35 个种中诱导产生雄性不育性。在诱导产生的雄性不育中，射线处理最多，约占 25% ，X 射线占21%，EMS(ethylmethane sulphonate)占 20%，NUM(N-nitroso N-methylurethane)占 8%，EI(Ethelene imine)占 6%，秋水仙素占 5%，NEU（nitrosoethyl u
14、rea）占 5%，其它为 10%3。在无法找到合适的遗传性雄性不育时，化学杀雄剂的研制和利用在一代杂种的种子生产中发挥了重要作用。4） 基因转育已经发现的雄性不育基因，可以通过连续回交和反复选择的方法转育到农艺性状优良的其它基因型作物上。转育因雄性不育类型和显、隐性基因的不同需要不同方法。如萝卜不育胞质转育到油菜、白菜、甘蓝等作物的转育方法。5） 原生质体融合在有性杂交中，细胞质基因组只是来自母本，而在体细胞杂交中，杂种却拥有两个亲本的细胞质基因组。因而体细胞杂交为研究双亲细胞器的互作提供了新手段，这种杂种称作细胞质杂种（Cybrid）。应用 原生质体融合技术不但可以使一个种的雄性不育细胞质与
15、另一个种的核基因组结合在一起，创造新的雄性不育系，而且可以对现有的不育细胞质进行遗传改造和修饰以除去某些不良特性。原生质体融合技术应用于芸薹属作物改良已愈十年历史，并在胞质基因转移、抗性基因转移及创建新的种质等方面取得了一定的成就。已在芸薹属种内、种间、属间及族间通过体细胞杂交实现了胞质基因组的转移，改良或创造了细胞质雄性不育系。6） 基因工程目前利用基因工程创造雄性核不育的策略主要是利用花粉发育的特异启动子与外源基因嵌合，构建表达载体，转化植物来阻断花粉发育的过程从而达到雄性不育的目的。(1)表达细胞霉素基因破坏花药绒毡层创造雄性不育，绒毡层是显花植物花粉发育过程中一种独特的分泌细胞，其活跃
16、的代谢与花粉的发育有着密切联系。(2)将通过影响小孢子发育可导致雄性不育系，Spean 等（1992）采用Rhizogenes 的 rolB 基因与金鱼草 Tap1 启动子融合，转化烟草后发现花药生长素增加，导致雄性不育4。(3)利用反义 RNA 技术获得植物雄性不育。花粉发育是一个及其复杂的过程，许多基因与花粉发育有关。通过反义 RNA 技术阻断与花粉发育有关的基因的表达用样可以获得雄性不育株。(4)提早降解获得雄性不育。是在孢母细胞减数分裂完成后作为小孢子的临时膜，以分隔产生的四分孢子，防止它们之间相互粘连和融合。绒毡层中的合成与分泌的特异性对于花粉的正常发育具有决定性作用。正常情况下，在
17、小孢子形成外壁后，Curtis 等（1996）将-1、3-葡聚糖酶连接在PSL 启动子之下，用农杆菌介导法也获得了莴苣的雄性不育株5。(5)细菌基因在植物中组成型表达导致植物雄性不育。Schmulling(1988)等将农杆菌 T-DNA 间的 rolC 基因与 CaMV35S 启动子串联成嵌合基因转化烟草，获得雄性不育株。(6)随着分子水平的研究不断深入，人们发现细胞质雄性不育与线粒体基因有密切关，现在已在玉米、矮牵牛、油菜等线粒体 DNA 上找到了与CMS 有关的基因。通过基因工程的方法扰乱线粒体与细胞核之间信息交流，可导致雄性不育。2.差异表达基因分离方法差异表达基因分离方法主要有差示筛
18、选（differential screening）、扣除杂交（subtractive hybridization）、mRNA 差异显示技术、RNA指纹图谱技术（RNA fingerprting by arbitrary primed PCR )、代表性差异分析方法（representative differential analysis,RDA）、微阵列技术、抑制性差减杂交 ( supp ression subtrac tive hybridization, SSH )、cDNA-AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）技术，其中应该最广泛的方法
19、为抑制差减杂交（SSH）。2.1SSH 的基本原理 抑制差减杂交技术运用了杂交二级动力学原理,即高丰度的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度快于低丰度的单链cDNA,在试验组(tester)和驱动组(driver)的cDNA变性后再复性的过程中,原来在丰度上有差别的单链cDNA达到均一化。同时,由于试验组的cDNA在进行杂交之前等分的两份加有不同的接头,因此杂交时将产生5种不同类型的分子a、b、c、d和e(图1),当采用与两个不同接头序列互补的引物进行PCR扩增时,只有目标序列得到有效扩增,非目标序列因两端存在反向重复序列,退火时易产生类似”锅柄”的结构,无法与引物配对,扩增受到抑制。2.2
20、 抑制差减杂交(SSH)技术的主要步骤步骤:(1)cDNA的合成与酶切;(2)试验组cDNA分成两份,并与两个不同的接头连接;(3)试验组的cDNA与过量的驱动组cDNA杂交;(4)选择性PCR扩增与接头相连的试验组cDNA分子;(5)克隆PCR产物,构建差减文库;(6)筛选文库。 2.3抑制差减杂交(SSH)技术优缺点优点：抑制差减杂交( suppression subtractive hybridization, SSH)是基于抑制PCR和差减杂交技术建立的简单有效的方法1,通过一次差减杂交可使低丰度的序列(mRNA)得以高于1000倍的富集,有效的选择性扩增目标序列,同时抑制非目标序列的
21、扩增,因此在分离基因特别是分离低丰度差异表达基因方面具有更广阔的应用前景。缺点：SSH方法一般只用于两个样品的差异比较分析,样品间的差异不宜太大或太小,而对于多个样品则无能为力,这在很大程度上限制了它的应用。提取tester RNA的时期非常关键,选择使用该方法时,首先要根据不同的研究目的确定取材的最佳时期,取材时期不当将会给试验带来意想不到的困难,或许只得到很少几个差减克隆或根本得不到克隆,或得到一些非目的克隆。从技术本身讲,提取的tester RNA和driver RNA及从中分离的mRNA的质量、限制酶的酶切效率、接头的连接效率、第二次PCR产物的转化效率及差减克隆的筛选方法等关系着验的
22、成败。另外SSH所需的起始RNA量较大,一般为几微克,对于一些珍贵稀有的不易获得足够RNA的材料要慎重使用。2.4.抑制差减杂交法在雄性不育研究中的应用SSH 技术自 1996 年提出以来 ,在动物研究领域中,已成功地应用到许多分子遗传学和基因克隆的研究中,如鉴别病理变化、生物体生长发 育、组织分化中的基因表达变化以及其他差别表达的基因。自1999 年 Birch等在对马铃薯晚疫病的研究中第一次将此技术成功运用于植物领域后 ,近年来这一技术在植物方面的应用也取得了很大的进展,已将 SSH方法应用到水稻、玉米、小麦、马铃薯、大豆、辣椒、胡萝卜、大麦、棉花、康乃馨、拟南芥、甘蔗、甜菜、人参、芒果、
23、灌。李红霞 等为了深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制,利用抑制差减杂交技术(SHH)构建了黏类小麦育性相关基因的cDNA文库。文库质量检测表明,差减杂交效率较高,质量较好。在不育和可育cDNA文库中随机挑选120个阳性克隆进行测序,获得100余条高质量的表达序列标签(EST)。对序列进行BLAST比对及功能注释,cDNA文库的基因表达谱,发现在可育cDNA文库中参与能量代谢的基因出现频率较高,在不育cDNA文库中检测到了与花发育调控相关的 MADS-box 转录因子、细胞凋亡相关的泛素结合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相关基因。研究发现这些基因与育性相关。郭爽 等以辣椒(Ca
24、psicum annuum L.)细胞质雄性不育系23A、121A 和其相应的近等基因恢复系23C、121C为试验材料,利用抑制差减杂交(SSH)技术成功构建了CMS恢复基因诱导表达的消减 cDNA文库。结合高密度点阵膜杂交差异筛选,获得了 282个阳性克隆。通过测序,除去重复序列共得到 175个Unique ESTs。在 GenBank上进行BLAST分析,55个EST片段未找到对应的同源序列,可能代表了新基因;120个 EST片段找到了对应的同源序列,包括103个已知功能基因和17个未知功能基因。按照 MIPS功能分类法,将其分为14个功能组,涉及代谢、胁迫应答、蛋白活性、转录因子、信号转
25、导等多方面的功能。辣椒CMS类型已鉴定出有关的线粒体基因(Kim etal,2007),但相关的核育性恢复基因的分离克隆研究较少刘忠松 等,2001,从辣椒CMS育性恢复相关基因入手,利用SSH技术分离辣椒CMS育性恢复相关 ESTs,构建辣椒 CM S育性恢复相关 cDNA 文库,为进一步对辣椒育性恢复相关基因进行深入研究奠定基础。同时,试验材料中不育系与相应的恢复系为近等基因系,这在理论上保证了获得的差异表达基因仅与恢复基因位点有关。3脂肪酶的作用脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。 脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的
26、催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；4脂肪酸代谢与雄性不育生物体
27、内脂肪是由脂肪酶水解，在脂肪酶的催化下生成一分子甘油和三分子脂肪酸，脂肪酶的特点：主要作用于有酯键的化合物，不论脂肪来源于什么组织，不论脂肪酸碳链的长短，只要是酯键，脂肪酶就可以使其断裂，这就是酶的专一性即键专一性。事实上，脂肪的水解不是一步完成的，而是分步完成，分步进行水解。第一步脂肪酶水解第一或第三全酯键，即或酯键，如果第一步水解-酯键，第二水解酯键，生成和脂肪酸和甘油-酯，最后，-位的脂肪酸在转移酶的催化下-的脂肪酸转到或位上，再在脂肪酶的作用下，脂肪酸水解下来，共生成三分子脂肪酸和一分子甘油，水解过程为：脂肪（甘油三酯）水解的产物：一分子甘油和三分子脂肪酸。分别用 HPLC 和 GC
28、分析了红莲型细胞质雄性不育水稻同核异质系 YTA 和 YTB 线粒体总膜、内膜以及外膜磷脂类型和脂肪酸的各组分,并用面积归一化法定量分析了各种膜磷脂组分和脂肪酸的含量配比。结果表明同核异质但育性不同的 YTA 和 YTB 之间线粒体膜磷脂组分和脂肪酸配比存在明显的差异,并且二者在外膜之间的差异明显大于内膜。膜磷脂中含量最高的组分 PE 在不育系 YTA 和可育的同核异质系 YTB 之间差异都极显著,YTB 中的含量显著高于 YTA;总膜和内膜中 PI 含量差异显著,均为 YTA 中的含量高于 YTB,而 PA 含量均差异不明显;相对于内膜,外膜的膜磷脂含量在 YTA 与同核异质的 YTB 间差
29、异更大,尤其是 PE、PA 和 PC 的含量。对于线粒体总膜磷脂中含量最高的脂肪酸组分18C:0在不育系 YTA 中的含量极显著高于同核异质的 YTB,而多不饱和脂肪酸 (N:2和 N:3)含量和 IUFA 则是 YTB 极显著高于 YTA;线粒体外膜磷脂脂肪酸的组成及不饱和性与总膜的类似,与总膜及外膜相反,YTB 线粒体内膜的 IUFA 与 YTA 之间差异不明显。这说明线粒体的膜磷脂组分和脂肪酸配比可能受细胞质基因影响,与 HL-CMS 的育性可能具有一定的联系。刘齐元（2006）烟草游离脯氨酸含量与雄性不育性的关系结果表明,花蕾中不育系的脯氨酸含量在小花蕾阶段与其保持系非常接近,但从中花
30、蕾开始,保持系花蕾中的脯氨酸含量急剧上升,而不育系花蕾中的脯氨酸含量则基本保持稳定,因而,不育系花蕾中的脯氨酸含量在大花蕾时期明显低于其保持系;叶片中生育前期不育系的游离脯氨酸含量和相应保持系之间基本上没有大的差异,仅在生育后期存在一定的差异,但这些差异变化无规律性。因此,花蕾中游离脯氨酸含量与烟草雄性不育性有密切的关系,不育系花蕾中脯氨酸含量低是雄性不育性导致的结果;叶片中游离脯氨酸含量与烟草雄性不育性没有直接关系。5. 花粉囊专一性的脯氨酸富集蛋白（anther-specific proline-rich protein，APG）的功能花粉囊专一性的脯氨酸富集蛋白（anther-speci
31、fic proline-rich protein，APG） Roberts等人（1993）发现anther-specific proline-rich protein，APG表现于在阿拉伯芥菜Brssica napus 的花药中，他们以APG promoter启动基因并转植到B.napus中表现，结果发现该基因在许多不同种类花朵细胞中持续表达。Amr Ageez等（2005）在研究叉枝蝇子草雄性不育雄性不育相关基因表达时分离到了APG基因，并将其命名为SIAPG, 表明SIAPG仅在花药中表达，在雌蕊中不表达。该基因可能与花粉粒的形成有关。 6. 花粉囊专一性的脯氨酸富集蛋白在不育中研究现状。
32、一般认为, 花药中游离氨基酸含量, 尤其是游离脯氨酸含量与花粉育性有密切关系。朱广廉等曾对显性单基因控制的太谷核不育小麦不同发育阶段的可育株和不育株的花药及雌蕊内游离脯氨酸和游离总氨基酸的含量进行了分析。结果表明：（1） 在小孢子母细胞减数分裂期, 不同育性花药之间游离脯氨酸的含量无明显差异, 且含量较低。（2） 在小孢子单核初期, 可育花药内游离脯氨酸的含量显著高于不育花药, 是不育花药的7倍, 比减数分裂期增加20倍, 高达其干重的1.65%, 占其游离总氨基酸的50%。（3）在雌蕊中, 游离脯氨酸的含量远远低于花药, 不同育性植株之间差异不很明显。（4）关于游离总氨基酸的含量, 在花药中
33、减数分裂期, 不同育性植株之间无明显差异；在小孢子单核初期, 可育株高于不育株。在雌蕊中, 相应于小抱子单核初期时, 可育株稍高于不育株, 受精后迅速趋于一致, 但整个变化幅度不大。这一现象在小麦、玉米、高梁、洋葱,番茄,辣椒和水稻等植物中普遍存在(Zhang 和Croes,1983)。王强等（2002）采用化学杀雄剂以及增加脯氨酸的去雄剂对棉花花药氨基酸的影响，得出化学杀雄剂引起的氨基酸代谢失调可能是造成雄性不育的主要原因之一。关其原因可能是植株受到胁迫后, 光合作用减弱( 从叶绿素含量降低可以说明) , 棉叶合成的Pro 减少, 并导致了输送到花药的Pro 降低。棉花植株遭受化学杀雄剂胁迫
34、时,表现出来的生理反应还有矿质营养元素硼、锰、硫、铜、锌、镁、钙、铁等的吸收、运输受到影响。5.课题研究的目的和意义大白菜为两性花异花传粉蔬菜作物，杂种优势十分显著。由于其花器官小，单花结籽少，而单位面积的播种量又较大，常规的杂交制种必然存在去雄费工、费力、成本高等缺点。雄性不育系的利用是配制大白菜杂交种经济、可靠的制种手段(孙日飞，2000)。已经获得的大白菜雄性不育材料，可以分成细胞核雄性不育（GMS）和细胞质雄性不育（CMS）两种类型。由于细胞核雄性不育材料的雄蕊退化一般比较彻底、不育性稳定、无不良性状伴生，倍受育种工作者的重视。理想雄性不育系的不育株率应为100%，经济性状具有较高的配
35、合力。100%不育株率的雄性不育材料最早是由本课题组于1991年在大白菜雄性不育“两用系”轮配试验中育成的，由于用传统的单基因隐性或显性遗传无法解释这种遗传现象，从而提出了“大白菜核基因雄性不育复等位基因遗传假说”（Feng Hui et al., 1995），并为后来的实验所证实（Feng Hui et al., 1996）。目前本课题组已建立了一套该材料的应用技术体系，并实现了品种间和亚种间核不育复等位基因的交流，育成了多个新的具有100%不育株率的雄性不育系,但对其产生雄性不育的分子基理还不清楚。本课题组通过抑制差减杂交技术及cDNA-AFLP方法已找到了一系列育性相关基因，但对于单个基
36、因的功能及作用部位尚不清楚。本研究即对大白菜育性相关花粉囊专一性的脯氨酸富集蛋白基因BFAPG的功能及时序表达作了相应研究，为探索复等位基因遗传的大白菜核雄性不育的机理奠定了基础。1材料和方法1材料和方法1.1实验材料本研究所用材料为本课题组转育的大白菜雄性不育甲型两用系 “AB01 ”，不育与可育材料除育性外背景相同，是研究差异基因分离的理想材料。当甲型两用系植株现蕾开花后，分别取不育株和可育株花蕾进行研究。1.2实验方法1.2.1取样方法植株现蕾开花后，分别取不育株和可育株花蕾进行研究。我们按照花药在可育、不育花蕾中的发育变化情况，初步将花蕾分为6个等级，即1级（花蕾长度1.5 mm），稳
37、定发育期；2级（花蕾长度：1.52mm），不育初期；3级（花蕾长度: 22.5mm），4级（花蕾长度: 2.53 mm），5级（花蕾长度: 33.5），6级（花蕾长度3.5 mm），分别选取开花期一致、其它性状相同的不育和可育材料的未开放花蕾按上述标准分别分为6个等级。另外对56级的大花蕾有分别取萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊四份材料。装入1.5mlPE管中，液氮速冻后，-85冰箱保存备用装入1.5mlPE管中，液氮速冻后，-85冰箱保存备用。1.2.2 RNA提取1 用具的处理、溶液配制及无RNase操作1.5 ml PE管、0.2 ml PCR管、各种规格的枪头用0.1 %的DEPC溶液浸泡处理过
38、夜，121高压灭菌30 min。用0.1 % DEPC水配制75 %乙醇、5 mol L-1 NaAc，高压灭菌。新的无水乙醇、氯仿、异丙醇。RNA提取过程、cDNA一链合成均在无菌操作台上进行。2 总RNA提取及质量检测分析使用RNA simple Total RNA Kit（TIANGEN公司，离心柱型）进行总RNA提取，参照说明书，具体步骤如下：取0.5-1.0g样品，液氮研磨后迅速加入1ml裂解液RZ，漩涡1min，室温放置5min。加入200l氯仿，剧烈震荡15sec，室温放置3 min。4 12000 rpm离心10 min，上层水相约500l转到新管。缓慢加入0.5倍无水乙醇，混
39、匀后转入吸附柱CR3。4 12000 rpm离心30 sec，弃废液。向吸附柱CR3加入500l去蛋白液RD，412000 rpm离心30 sec，弃废液。加入700l漂洗液RW，室温静置2 min，412000 rpm离心30 sec，弃废液。加入500l漂洗液RW，室温静置2 min，4 12000 rpm离心30 sec，弃废液。将吸附柱CR3放入2 ml管中，加入50l RNase-free ddH2O，室温放置2 min。4 12000 rpm离心2 min。重复10-11操作，合并两次得到的溶液。取3.5l所得的RNA样品，加1l 6的loading buffer后于1.0 %琼脂
40、糖胶上电泳，电压6Vcm-1，电泳15-20 min后，凝胶成像仪照相分析。1.2.3 目的片段获得方法将提取的RNA采用Micro-Fast Track 2.0试剂盒(Invitrogen)提供的试剂进行mRNA的纯化，并按试剂盒推荐方法进行操作。使用PCR Select cDNA Subtraction Kit(Clontech)提供的试剂进行抑制差减杂交，并根据试剂盒说明进行操作，分别将可育株为测试组及不育株为测试组的正向和反向SSH的第二次PCR产物连接在载体pGEM-T-easy（Promega）上，并转化大肠杆菌JM109感受态细胞，培养在含有IPTG和X-Gal的LB氨苄培养基上
41、，挑选白色阳性克隆于96微孔板中，分别构成正向和反向消减cDNA文库，挑取白色克隆用通用测序引物(M 13/pUC Sequencing primer,M13/pUC Reverse Sequencing primer)进行PCR检测。选取PCR检测为阳性的克隆送上海生工进行测序，测得序列去除载体和接头序列即获得目的片段。1.2.4 RT-PCR以可育株与不育株花蕾为材料，重复三次，每重复为10棵植株的混合花蕾。分别提取RNA（方法同1.2.1）, 并采用M-MLV (PROMEGER)合成第一链cDNA (参照说明书进行)。第一链cDNA合成反应见表1：表1 第一链cDNA合成反应体系组分C
42、omponents反应体系Reaction systemTemplate RNA2.0 g51st Strand Synthesis Buffer4.0 ldNTP Mixture1.0 lRNase Inhibitor1.0 lOligo(dT)182.0 lReverse Transcriptase（M-MLV）（200 U/l）1.0 lRNase-Free ddH2O定容至20.0 l按照上述体系轻柔搅拌混匀各组分，室温放置10分钟后，移至42恒温水浴槽内，反应1小时，反应结束后置于冰中冷却2分钟基因引物序列(53)产物长度/bp退火温度/ACTINFATCTACGAGGGTTATGC
43、T41254RCCACTGAGGACGATGTTTBFAPGFCATCAAGCCCGACGACCT41258RTGCGAATACTCCACCAAAT线性扩增期确定, 以不同浓度可育株 cDNA为模板, 检测内参基因ACTIN在不同循环数下产物量的差异, 找出线性扩增期循环数作为半定量过程中的参照循环数。表2 RT-PCR中防御相关基因的引物及退火温度Table2The primers and annealing temperature for defense related gene expression experimentsRT-PCR检测, 根据目的基因片段序列利用PRIMER5 及DN
44、AMAN设计目的基因引物，提交INVITROGEN公司合成引物序列。以不育花蕾和可育花蕾的第一链cDNA为模板,在线性扩增期进行半定量PCR, 相关参数见表2。PCR 反应体系：组分Components反应体系Reaction systemTemplate cDNA5l10Buffer3ldNTP Mixture1.6l引物上游1l引物下游1l2.5 UL-1 Taq 酶0.4lRNase-Free ddH2O定容至20.0 lPCR反应程序：1.2.5 PCR反应程序：将 PCR 反应所需的成分配置完后，在 PCR 仪上94预加热30秒，使模板 DNA 充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循
45、环中，先于 94 保持 30 秒钟使模板变性，54退火30 秒钟， 72延伸30秒，完成一个循环。重复这样的循环 27 次，使扩增的 DNA 片段大量累积。最后，在 72 保持 3-7min ，使产物延伸完整， 4 保存。94 3min 94 30s 54 30S 30个循环72 30s 72 5min1.2.6 全长序列的获得利用本课题组参与的“多国芸薹属植物基因组计划项目”中大白菜Chiifu的利用Chiifu BAC文库与基因组测序结果信息资源，以片段序列试图调取全长cDNA序列1.2.7 序列相似性搜索利用National Center for Biotechnology Information (NCBI)中的BLAST工具与dbEST数据库，进行特异表达基因同源性比较和功能分析，根据查询序列（Query）与比对序列（Sbjct）共同跨越部分长度（Alignment scores）、E-value及同源相似性（Identities）推测该特异表达基因的可能生物学功能。2结果与分析2.1 RNA提取我们将花蕾按照花药在可育不育花蕾中的发育变化情况初步分为6个等级，即1级（花蕾长度1.5 mm），稳定发育期；2级（花蕾长度：1.52mm），不育初期；3级（花蕾长度: 22.5mm），4级（花蕾长度: 2.53 mm），5