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1、精选优质文档-倾情为你奉上质量规格要求、生产使用工艺和检验方法，食品中该添加剂的检验方法或者相关情况说明（一）质量规格要求乳铁蛋白的质量标准1 范围本标准适用于食品添加剂乳铁蛋白。2 规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注明日期的文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB 5009.3食品中水分的测定GB 5009.4食品中灰分的测定GB 5009.5 食品中蛋白质的测定GB 5413.21 婴幼儿食品和乳品中钙、铁、锌、钠、钾、镁、铜的测定GB 5009.12 食品中铅的测定GB 4789.2 食
2、品微生物学检验 菌落总数的测定GB 4789.3 食品微生物学检验 大肠菌群计数GB 4789.4 食品微生物学检验 沙门氏菌检验GB 4789.10 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验3 技术要求3.1 原料要求3.1.1生乳：应符合GB19301的规定3.1.2乳和乳制品：应符合GB19644的规定3.1.3 其他原料：应符合相应的安全标准和/或有关规定3.2 感官要求：应符合表1规定表1 感官要求项目要求检验方法色泽具有均匀一致的橙红色泽取适量式样置于50mL烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态，闻其气味，用温开水漱口，品尝滋味滋味、气味具有产品特有的滋味、气味、无异味组织状态干燥均匀
3、的粉末状产品、无结块、无正常视力可见杂质3.3 主要成分指标：应符合表2规定表2 主要成分指标项目指标检验方法蛋白质/（% ） 93GB 5009.5蛋白质中的乳铁蛋白/（ % ） 90附录A 铁 /（mg/kg） 350GB 5413.213.4 理化指标：应符合表3规定表3 理化指标项目指标检验方法水分/（% ） 5GB 5009.3灰分/（% ） 1.5GB 5009.43.5 污染物限量：应符合表4的规定表4 污染物限量项目指标检验方法铅/（mg/kg ） 0.2GB 5009.12 （铅）3.6 微生物限量：应符合表5规定表5 微生物限量项目采样方案及限量a（若非指定，均以CFU/g
4、或CFU/ml表示）检验方法ncmM菌落总数52100010000GB 4789.2大肠菌群5210100GB 4789.3平板计数法金黄色葡萄球菌5210100GB 4789.10 平板计数法沙门氏菌500/25g_GB 4789.4a 样品的分析及处理按GB 4789.1和GB 4789.18执行。4 包装、标签、贮存4.1 包装包装所用容器、包装材料采用符合卫生标准和卫生要求的原材料。4.2 标签符合GB7718的规定4.3 贮存室温阴凉干燥处密封保存。不得露天存放，不得与有毒有害物质或其他杂物混存。附录A 高效液相色谱法（HPLC）测定乳铁蛋白的纯度1.范围适用于高效液相色谱法检测乳铁
5、蛋白的纯度。2. 原理用高效液相色谱法(HPLC)测定原料乳铁蛋白中乳铁蛋白的纯度。用纳米级纯水稀释样本，经聚乙烯苯-二乙烯基苯色谱柱分离，用20-90%乙腈进行线性梯度洗脱。在214nm波长下，经二极管阵列检测。3. 试剂和仪器1). 纳米级纯水：所用水经纳米级纯水净化系统出处理（电阻率达18兆欧姆）2). 纯化的乳铁蛋白，西格玛公司生产3).乙腈（CAN），色谱级或以上4).三氟乙酸（TFA），色谱级或以上5).一次性塑料或玻璃移液管6). 硅烷化色谱瓶(安捷伦 5183-4507号)7).Resource RPC 3-mL聚乙烯苯-二乙烯基苯色谱柱（通用电气医疗集团 17-1182-01
6、号)8).HP 1100高效液相色谱系统(配二极管阵列检测器)4. 步骤4.1 标准样品的制备准确称取13.2mg的乳铁蛋白标准品，定量转移到100mL的容量瓶中，用纳米级的纯水稀释后，用移液管吸取部分标准溶液到硅烷化的HPLC色谱瓶中。4.2 样本的制备准确称取13.2mg的乳铁蛋白样品，定量转移到100mL的容量瓶中，用纳米级的纯水稀释后，用移液管吸取部分标准溶液到硅烷化的HPLC色谱瓶中。4.3 仪器设置HP1100高效液相色谱仪 100mL 注射器 流速1 mL/min Resource RPC 3mL聚乙烯苯二乙烯基苯色谱柱二极管阵列检测器（214nm）洗脱时间30分钟流动相 A-
7、0.1%体积比的三氟乙酸水溶液流动相B- 0.09%体积比的三氟乙酸,90%体积比的乙腈水溶液线性洗脱梯度时间 (分钟)%流动相B02012064016451950205023702410025100272030204.4 分析先注射3次标准样品溶液，接着再注射样本溶液，最后再注射3次标准样品溶液。记录乳铁蛋白的峰面积值。注射顺序如下:第一次: 标准样品第二次: 标准样品第三次: 标准样品第四次: 样本1第五次: 样本 2第六次: 标准样品第七次: 标准样品第八次: 标准样品 5. 计算 计算样本中乳铁蛋白的纯度:乳铁蛋白的纯度%=其中：样本峰面积= 样本中乳铁蛋白的峰面积 标准品峰面积=6次
8、注射的乳铁蛋白标准品的峰面积的平均值 标准品的重量 = 乳铁蛋白标准品的重量（mg） Pstd = 乳铁蛋白标准品的纯度（%）样本的重量=乳铁蛋白样本的重量（mg）（二）乳铁蛋白标准的编制说明一、 标准起草的基本情况乳铁蛋白目前尚无统一的国家标准和行业标准，根据中华人民共和国食品安全法及其实施条例、中华人民共和国标准化法实施条例的要求，制订乳铁蛋白的质量标准。该质量标准规定了乳铁蛋白的技术要求、试验方法、检验规则、标签、包装和贮存等。该标准适用于以牛乳及其制品为原料制成的乳铁蛋白。二、 标准的重要内容及主要制订情况标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，尽可能与国家现行的乳制品标
9、准协调一致，注重标准的可操作性，严格按照食品安全国家标准编写要求进行编写。起草工作收集了国内相关的国家标准，同时也参考了欧盟的相关标准以及全球多家大型牛乳铁蛋白生产厂家提供的技术资料。1.范围本标准规定营养强化剂乳铁蛋白的质量规格要求、检验方法、标签、包装和贮存。本标准适用于乳铁蛋白的生产、流通和监督管理。2. 规范性引用文件对于产品的检验规则、判定规则有相应的法律、法规及标准规定的，本标准在该部分予以列出。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注明日期的文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3 技术要求3.1 原料要求：乳铁蛋白生产所使用的原料应符合相应的国家
10、标准、行业标准或有关规定。3.2 感官要求：本要求参考GB11674食品安全国家标准 乳清粉和乳清蛋白粉的规定，以及全球几大乳铁蛋白生产商提供的技术资料联合确定。3.3主要成分指标：包括蛋白质、蛋白质中乳铁蛋白以及铁的水平，主要参考EFSA对荷兰富仕兰乳品公司和日本Morinaga乳品公司申报的牛乳铁蛋白的科学意见以及全球几大乳铁蛋白生产商提供的技术资料确定上述各项指标的水平。鉴于目前尚无乳铁蛋白检验方法的国家标准，参考欧洲食品安全局（EFSA）对牛乳铁蛋白的科学意见中提到的高效液相色谱法对本指标进行测定，该检测方法的验证已通过欧洲食品安全局的评估。3.4理化指标： 包括水分和灰分，主要参考E
11、FSA对荷兰富仕兰乳品公司和日本Morinaga乳品公司申报的牛乳铁蛋白的科学意见以及全球几大乳铁蛋白生产商提供的技术资料确定上述各项指标的水平。3.5 污染物：本指标参考GB10765食品安全国家标准 婴儿配方粉、欧盟委员会指令96/23 污染物限量规定、EFSA对荷兰富仕兰乳品公司和日本Morinaga乳品公司申报的牛乳铁蛋白的科学意见以及全球几大乳铁蛋白生产商提供的技术资料，确定污染物铅的限量值。3.6 微生物限量：确定了乳铁蛋白中菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的限量要求，采样方案以及限量参考GB10765食品安全国家标准 婴儿配方粉的规定。4 包装、标签、贮存4.1 包装
12、：包装所用容器、包装材料采用符合卫生标准和卫生要求的原材料。4.2 标签：应符合GB7718食品安全国家标准 预包装食品标签通则的规定4.3 贮存：室温阴凉干燥处密封保存。不得露天存放，不得与有毒有害物质或其他杂物混存。三、其他需要说明的情况 无。（三）与国际组织和其他国家（地区）相关标准的比较荷兰富仕兰乳品工业有限公司和日本Morinaga乳品工业有限公司分别于2009年和2011年，向有关欧盟成员国提出申请，申请乳铁蛋白以新资源食品的身份在欧洲上市。欧洲食品安全局（EFSA）对两个公司的申请分别进行了一系列评估，并于2012年发布了评估报告。本申请中所制定的质量规格标准与EFSA报告中所给
13、出的标准的比较见下表。除上述的EFSA对荷兰富仕兰乳品公司和日本Morinaga乳品公司生产的乳铁蛋白所作出的评估外，目前国际上和其它发达国家尚没有对乳铁蛋白的质量规格标准作出要求。与欧洲食品安全局对牛乳铁蛋白的科学意见中所提出标准的比较 项目本标准EFSA1EFSA2色泽具有均匀一致的橙红色泽粉色滋味、气味具有产品特有的滋味、气味、无异味无异味组织状态干燥均匀的粉末状产品、无结块、无正常视力可见杂质粉末状产品蛋白质/（% ） 939394.5蛋白质中的乳铁蛋白/（ % ） 909596铁 /（mg/kg） 350350水分/（% ） 54.54.2灰分/（% ） 1.511.3铅/（mg/k
14、g ） 0.21(总重金属)20(总重金属)菌落总数（CFU/g或CFU/ml）n5c2m1000M100001000 CFU/g1000CFU/g大肠菌群（CFU/g或CFU/ml）n5c2m10M10010 CFU/g0/0.1g金黄色葡萄球菌（CFU/g或CFU/ml）n5c2m10M100不得检出/g不得检出/0.01g沙门氏菌（CFU/g或CFU/ml）n5c0m0/25gM0/10g1 EFSA Panel on Diettetic Products, Nutrition and Allergies(NDA);Scientific Opinion on bovine lactofe
15、rrin.EFSA Journal 2012;10(5)27012 EFSA Panel on Diettetic Products, Nutrition and Allergies(NDA);Scientific Opinion on bovine lactoferrin.EFSA Journal 2012;10(7)2811(四)生产使用工艺1. 乳铁蛋白的生产工艺1.1生产工艺简介：以脱脂牛乳为原料，主要工艺流程为：将生乳加热至50C，分离脱脂牛奶和奶酪，分离的脱脂乳 72 C巴氏灭菌至少15秒，灭菌后进行微孔过滤以降低微生物和脂肪含量，接着采用离子交换法分离牛乳铁蛋白，再进行超/微孔过
16、滤，最后用喷雾或冻干法干燥得到纯化的牛乳铁蛋白。将相对较大的颗粒筛除后，即可将纯化的牛乳铁蛋白进行包装。（见图1）1.2 原料控制在欧盟，牛乳铁蛋白的生产厂家得到批准方可生产乳铁蛋白，其生产的乳铁蛋白要符合欧盟第853/2004管理条例对动物源性食品的有关卫生规定。可食用的脱脂牛奶是生产牛乳铁蛋白的唯一原料，生产牛乳铁蛋白的原料需符合欧洲卫生管理法规。牛乳铁蛋白的生产工艺属于乳品工业常用工艺，产品质量受认证程序（ISO 9000:2000和HACCP）监测。图1 乳铁蛋白的生产工艺流程图2. 牛乳铁蛋白强化婴幼儿配方奶粉的生产工艺2.1 生产工艺简介 对于牛乳铁蛋白强化的婴幼儿配方奶粉,它的基
17、粉生产以及它的包装与目前生产的婴幼儿配方奶粉相同。 具体地来说,就是将水、蛋白质、碳水化合物、油脂(包括乳化剂、DHASCO以及ARASCO)、益生菌和矿物质在中和槽内混合， 接着将该混合物经均质化并进行巴氏灭菌处理，然后将灭菌后的基粉与维生素预混料、铁粉、微量矿物质预混料、核苷酸预混料以及牛乳铁蛋白等成分混合，制成终产品。最后对终产品进行包装。(见图2)2.2 质量控制美赞臣所有可用的质量控制与保证体系都将被用于牛乳铁蛋白强化的婴幼儿配方奶粉的生产与控制中。 美赞臣中国工厂的婴幼儿配方奶粉生产管理体系，与美国Zeeland和Evansville工厂采用的管理体系完全相同。 图2 牛乳铁蛋白强
18、化婴幼儿配方奶粉的生产工艺流程图（五）婴幼儿配方粉中乳铁蛋白的检验方法或者相关情况说明反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定婴幼儿配方粉中乳铁蛋白的含量1. 范围适用于婴幼儿配方粉中乳铁蛋白含量的测定。检出限为0.05g/L.2. 原理 用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定乳铁蛋白强化婴幼儿配方乳粉中乳铁蛋白的含量。用EDTA钙螯合溶液稀释样本，以释放酪蛋白微胶粒内捕获的所有乳铁蛋白，然后加标制备三点标准加入曲线。经离心、过滤后收集乳清蛋白部分进行分析。乳清蛋白经聚乙烯苯-二乙烯基苯色谱柱分离，用20-90%乙腈进行线性梯度洗脱。在214nm波长下，经二极管阵列检测。3. 试剂和仪器1
19、). 纳米级纯水：所用水经纳米级纯水净化系统出处理（电阻率达18兆欧姆）2).乙二胺四乙酸二钠盐二水化合物，试剂级或以上3).纯化乳铁蛋白，西格玛公司生产，由牛乳或牛初乳，或与前述西格玛标准比较后得到的高纯度原料纯化得到4).乙腈（CAN），色谱级或以上5).三氟乙酸（TFA），色谱级或以上6).全能台式高速冷冻离心机，具有固定角度的离心机转盘（3335号)7).玻璃离心管8).一次性塑料或玻璃移液管9).直径25毫米，带有0.45微米滤孔的PALL GHP注射式过滤器10).带有扣压式聚四氟乙烯盖帽的硅烷化色谱瓶(安捷伦 5183-4507号)11).Resource RPC 3-mL聚乙烯
20、苯-二乙烯基苯色谱柱（通用电气医疗集团 17-1182-01号)12).安捷伦1100高效液相色谱系统(配二极管阵列检测器)13).配备吸头的BioHit 0.5-5.0毫升电子移液管使用上述仪器或类似器材。4.步骤4.1 250 mM EDTA溶液的配制称取186.12克EDTA，定量转移于2升容量瓶内。加入纳米级纯水至容量瓶的瓶颈处。将磁力搅拌棒置于容量瓶内，在电磁搅拌器或电热板上缓缓加热并搅拌，直至EDTA溶解（注意：EDTA的溶解可能需要一个小时或更久) 。待EDTA溶液冷却至室温后，取出搅拌棒，用纯水定容、混匀。4.2 加标溶液的配制称取约31.2毫克纯化的乳铁蛋白，定量转移至50毫
21、升容量瓶内。加入250mM EDTA溶液溶解乳铁蛋白（溶解过程可能需要一个小时），最后用250mM EDTA定容至50毫升。4.3 样本的制备1).称取约10克婴幼儿配方乳粉，定量转移至100毫升容量瓶内。加入足量的250mMEDTA溶液使其液面刚好达瓶颈处。放入一只小型搅拌棒，搅拌一个小时后，取出搅拌棒（将粘附其上的残渣洗入容量瓶内），再用250mMEDTA定容。（注意：稀释前往容量瓶内滴1滴1-辛醇，防止产生泡沫)2).用移液管分别移取8.0mL样本溶液至3个25mL容量瓶内。将容量瓶贴上标签1、2、3。按照下表，用移液管分别向每只容量瓶加入相应量的加标溶液：容量瓶编号加入的加标溶液量（m
22、L）1021.032.0用250mM EDTA溶液定容3). 4、10,000 x g离心10毫升样本溶液15分钟。4).用玻璃或塑料移液管吸取乳清蛋白（液体），小心操作，以免搅动顶部的脂肪层或底部的酪蛋白颗粒（注意：根据产品配方，样本中可能没有脂肪层和/或酪蛋白颗粒）。以0.45微米滤孔的 Pall GHP注射式过滤器过滤乳清蛋白，弃去最初1mL滤液。5). 收集过滤后的滤液于硅烷化HPLC瓶内。4.4 流动相的制备1).流动相A（0.1%体积比的三氟乙酸水溶液）- 将1mL三氟乙酸加入999mL纳米级纯水中制成1L流动相A2). 流动相B（0.09%体积比的三氟乙酸,90%体积比的乙腈水溶
23、液）- 将900微升的三氟乙酸、900毫升的乙腈溶液和99.1毫升的纳米级纯水混合，制成1L流动相B。4.5 仪器设置HP1100高效液相色谱仪或类似设备100微升注射器 流速1 毫升/分钟 Resource RPC 3mL聚乙烯苯二乙烯基苯色谱柱（通用电气医疗集团） 二极管阵列检测器（214nm）柱温为室温洗脱时间30分钟线性洗脱梯度时间(分钟)%流动相B02012064016451950205023702410025100272030204.6分析用20%的流动相平衡色谱柱至少20分钟。注射两次空白样本250mM EDTA。每个样本注射一次，各样本间用空白样本清洗。记录LF的峰面积。5.
24、计算1).计算每个样本中加入的乳铁蛋白浓度：容量瓶1：乳铁蛋白0 mg/mL容量瓶2：乳铁蛋白容量瓶3：乳铁蛋白其中：mg 乳铁蛋白用于制备加标溶液的标准原料乳铁蛋白的量P乳铁蛋白=标准原料乳铁蛋白的纯度（以分数表示）2).以加标浓度值和乳铁蛋白峰面积绘制线性回归曲线计算下列参数：相关系数，斜率和截距3).计算样本中乳铁蛋白的含量：a). 样本溶液中乳铁蛋白的含量(g/mL) = 截距斜率b).每1升冲调婴幼儿配方乳中乳铁蛋白的量（克）乳铁蛋白的浓其中：134g冲调1配方乳所需配方粉的量c). 每100克婴幼儿配方乳粉中乳铁蛋白的含量（毫克）乳铁蛋白浓度6. 分析注意事项无7. 标准图谱乳铁蛋
25、白乳铁蛋白标准图谱（六）婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白反相高效液相色谱测定方法的验证验证报告2011年8月2日修订美赞臣内部研究报告1. 背景美赞臣营养品公司于2010年开发出一种可定量检测婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白含量的方法，并对其进行验证。希望在美赞臣全球的质量管理体系下，该方法都是稳定、准确且易于操作的。该方法是通过对D.F Elgar et al 1和 K.P. Palmano, D.F. Elgar 2所发表“反相高效液相色谱法测定乳清蛋白含量（包括乳铁蛋白）”的改编得到。2. 验证方案在验证试验开始之前，先根据分析学中的SOP GRD1.AS.SOP.1.03方法验证程序指南制定验证方案。
26、该方案(见附件1) 指导以下方法性能的测试：适用范围、特异性、线性范围、仪器精密度、方法精密度、测定范围、重现性以及准确度。 3. 方法与材料3.1 试剂试剂级二水乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)和1-辛醇，购自Sigma-Aldrich公司；HPLC级的乙腈和三氟乙酸，购自EMD 公司；水，经实验室内部纳米级纯水制备系统(Barnstead公司生产)处理。3.2 标准与样本纯化的乳铁蛋白原料(批号)，由 DMV公司提供。源自牛初乳的乳铁蛋白标准品，由Sigma-Aldrich公司提供。美赞臣公司的多种婴幼儿配方产品包括:安婴儿优生营养品，批号QAC36; 泰国安儿宝A+ Plain,批号QKS
27、31A12; 安婴儿优生即食型配方奶，批号8MJS020; 泰国LIPIL安儿宝（含85mg乳铁蛋白/100g）; 0.6g乳铁蛋白/L EW2 的基粉-A (不含乳铁蛋白); 1.0g乳铁蛋白/L EW2 的基粉-B (不含乳铁蛋白);安婴儿优生乳铁蛋白强化（1.0克/升）临床产品 3380-729。3.3 样本制备与色谱分析系统用250毫摩尔的 EDTA溶液对样本进行稀释并搅拌1小时后，再用250mM EDTA溶液对样本进一步稀释，加入DMV的乳铁蛋白标准溶液，制作三点标准加入工作曲线。用Sorvall Biofuge Stratos离心机分离样本中的乳清蛋白、酪蛋白和脂肪。用口径为 25
28、毫米、滤孔为0.45微米的PALL GHP注射器式过滤器过滤乳清蛋白，收于硅烷化色谱瓶内，待分析。采用HP1100高效液相色谱仪进行反相高效液相色谱法分析，色谱柱采用Resource RPC 1-mL装填聚苯乙烯-二乙烯基苯柱 (通用电气医疗集团生产)， 20-90%乙腈进行线性梯度洗脱， 214nm波长下检测。样本的制备和确切的分析条件请见附件2-3。4. 验证结果4.1范围适用于反相高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶（粉）中乳铁蛋白的含量。4.2 特异性在本色谱条件下，证明配方产品中的其他成分不会干扰乳铁蛋白的含量分析是必要。产品中除乳铁蛋白外的其他所有成分（矿物质、维生素、蛋白质、脂肪等）都
29、要准备用于方法的特异性分析。虽然美赞臣的安儿宝产品在全球有多种配方，但是鉴于泰国市场的配方中酪蛋白（酪蛋白是配方粉中最有可能和乳铁蛋白的洗脱时间相同的成分，因此会干扰乳铁蛋白的峰面积值）的含量最高，所以本验证过程选用该配方产品。下面的样本根据他们各自相应的检测方法制备(见附件2-3)，以观察其对乳铁蛋白的色谱峰是否具有明显的干扰作用：空白样本 250mM EDTA溶液、安婴儿优生配方粉批号QAC36、安婴儿优生即食型配方奶，批号8MJS020、泰国安儿宝A+ Plain批号QKS31A12。空白样本中未见有干扰峰，而每一个产品样本中，都发现紧挨乳铁蛋白峰之后有一小的洗脱峰。根据发表的研究报告1
30、、2, 该峰为牛血清白蛋白 (BSA)。虽然BSA色谱峰阻碍乳铁蛋白色谱峰尾到达基线处, 但仔细计算峰值面积可以消除BSA的明显干扰。在方法的研发过程中，未能成功解决BSA的色谱峰和乳铁蛋白色谱峰在基线处的分离问题。 样本色谱图见附件4。 4.3 线性与线性范围通过分析各种不同乳铁蛋白含量的配方产品，验证本方法得出的结果（峰面积）与乳铁蛋白浓度成正比的能力。向5份不含乳铁蛋白的安儿宝A+Plain（泰国批号QKS31A12 )样本稀释液（参见附件2)中分别加入乳铁蛋白标准液，得到乳铁蛋白浓度分别为24, 80, 135, 190 和294g/mL的样本。以峰面积作为乳铁蛋白浓度函数，进行线性回
31、归分析，得到相关系数为0.9999，认为该方法是可接受的。待测样本中可检出乳铁蛋白浓度的线性范围为24g/mL 294g/mL。4.4 仪器精确度在同一测定条件下，将同一样本（135mg/mL的样本）在同一天进行7次重复测定，以确定仪器检测重复性（峰面积）能力。经计算，测定结果的相对标准偏差(%RSD)为 0.4%，表明本仪器测定的结果是精确的。4.5方法的精密度制备7份泰国安儿宝LIPIL奶粉（乳铁蛋白含量为85毫克/100克奶粉）样品溶液，由同一分析师在同一天进行分析，以确定检测方法的精确度。之所以选择上述产品进行分析是因为它所含的酪蛋白水平最高，而酪蛋白是配方奶粉中最有可能干扰乳铁蛋白的
32、分离与分析的成分。经计算，7份样本分析结果的相对标准偏差为2.7%，表明RP-HPLC法的测定结果是精确的。4.6重现性通过进行重现性研究，来确定在不同条件下如不同的移动相、不同的色谱柱和不在同一天制备样本等，该方法得到精确结果的能力。每天分别制备1份泰国安儿宝LIPIL 奶粉（乳铁蛋白含量为85毫克/100克奶粉）样本溶液以及1份安婴儿Premium临床产品（乳铁蛋白含量为1.0 g/L，批号3380-729）样本溶液，7天由多位分析师共制备14份样本溶液。在进行重现性试验期间，准备多种流动相，并为两种不同批号的样本准备两种相同的色谱柱(第1-3天和第7天用色谱柱1，第4-6天用色谱柱2)。
33、 另外在试验的第3-6天，分别在安婴儿样本溶液中加入1滴1-辛醇以减少容量瓶内泡沫的产生。 经计算，得到安儿宝和安婴儿样本测定结果的相对标准偏差分别为4.0%和2.2%， 分析结果表明在正常使用情况下固有参数的轻微改变并不会影响方法的检测性能，因此认为本方法是可靠的。另外， 1-辛醇的添加与否是可选择的，并不影响测定结果。4.7准确度通过在不含乳铁蛋白的配方产品样本中添加已知量的乳铁蛋白，制备样本溶液进行RP-HPLC分析，然后比较乳铁蛋白的实际计算结果与理论添加量的差异，来确定方法的准确度。用于验证方法准确度的配方产品包括：泰国安儿宝A+ Plain（批号QKS31A12）; -A EW2
34、基粉(0.6 g/L乳铁蛋白的安婴儿优生配方粉的基粉); -B EW2基粉(1 g/L乳铁蛋白的安婴儿优生配方粉的基粉); 安婴儿优生即食型配方奶（批号8MJS020）。添加到样本中的乳铁蛋白标准样由DMV公司提供(批号)。每个样品制备3份相同的样本溶液。一份样本溶液不加乳铁蛋白标准样品，另外两份掺入已知量的乳铁蛋白标准样品，掺入量尽可能接近终产品的期望添加量。准确称量纯化的乳铁蛋白粉末，并定量转移到装有样本稀释液的容量瓶中。通过计算掺入乳铁蛋白标准品的样本溶液中乳铁蛋白的含量，减去未掺入乳铁蛋白标准品的样本溶液中乳铁蛋白的含量，再除以样本中乳铁蛋白含量的理论值得到掺入的乳铁蛋白标准品的回收率
35、（见表1）。表1 回收率样品平均回收率， %安儿宝102安婴儿 0.6g/L (粉末)101安婴儿1.0 g/L (粉末)98安婴儿即食型配方奶0.6g/L93安婴儿即食型配方奶 1.0g/L88安儿宝和安婴儿配方奶粉的回收率是可以接受的。安婴儿即食型配方奶可能也是可以接受的。但是，由于目前用于准确度测试的即食型配方奶和仍在研发中即食型配方奶可能大不相同, 所以对即食型配方奶可能必须进行进一步的验证。5. 结论反相高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中的乳铁蛋白含量的特异性、线性、精密度、重现性和准确度已得到证实，可以作研究与研发之用。依据目前用于验证测试的即食型配方奶和仍在研发中即食型配方奶的差
36、异，本方法也可以用于即食型配方奶中乳铁蛋白的测定，关于这种配方奶的验证方法的报告稍后将予以公布。参考文献1 Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene., David F. Elgar, Carmen S. Norri
37、s, John S. Ayers, Mark Pritchard, Don E. Otter, Kate P. Palmano, Journal of Chromatography A, 878 (2000) 183-196. 2Detection and quantitation of lactoferrin in bovine whey samples by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene., Kate P. Palmano, David F. Elgar
38、, Journal of Chromatography A, 947 (2002) 307-311.附件1验证方案1.1 范围可检测婴幼儿配方产品中的乳铁蛋白含量的反相高效液相色谱法的验证。 1.2 特异性根据本方法制备下列样本，并对可能会明显干扰乳铁蛋白洗脱时间的色谱峰进行分析。空白溶液 250mM EDTA溶液未添加乳铁蛋白的安婴儿优生配方奶粉未添加乳铁蛋白的安婴儿即食型配方奶未添加乳铁蛋白的安儿宝配方产品(如果可以的话，选择酪蛋白含量最高的配方产品)1.3 线性根据本方法制备5份相同的安儿宝配方产品(未添加乳铁蛋白)的样本稀释溶液，在样本稀释溶液中掺入五种不同浓度的乳铁蛋白标准溶液（60
39、mg DMV的乳铁蛋白/50mL 250mM EDTA溶液）。样本制备：10克安儿宝/100毫升250mM EDTA，用移液管分别移取8.0毫升样本溶液到五个25ml的容量瓶中，再分别用移液管移取以下剂量的加标溶液至5个容量瓶，以制备标准曲线溶液，最后用250mM EDTA溶液定容。 乳铁蛋白加标量(毫升)乳铁蛋白浓度(微克/毫升)0.500241.625782.7501323.8751866.000288绘制乳铁蛋白面积与乳铁蛋白浓度曲线，计算其相关系数。 1.4仪器精密度注射七次132mg/mL的标准溶液，计算%RSD。1.5方法精密度制备7份乳铁蛋白强化的安儿宝配方奶粉（如果可以的话，选
40、用酪蛋白含量最高的配方）样本溶液， 计算%RSD。1.6 线性范围记录用于线性测试的最高和最低乳铁蛋白浓度。 1.7重现性7天制备7份样本（如果可以的话，由多位分析师制备），计算%RSD。1.8 准确度向下列样本的2份相同的稀释液中掺入已知量的乳铁蛋白，另外每个样本还须制备一份未掺入的乳铁蛋白的稀释液:安儿宝，85mg/100g安婴儿 RTU，0.6g/L安婴儿RTU，1.0g/L安婴儿配方奶粉，455mg/100g安婴儿配方奶粉，770mg/100g计算回收率(减去未掺入的乳铁蛋白的稀释液中乳铁蛋白的量)。附件2RP-HPLC测定安婴儿LIPIL和安儿宝配方奶粉以及安婴儿即食型普通配方奶样本
41、中乳铁蛋白的含量2.1 加标溶液称取约31.2毫克的乳铁蛋白标准品加到50毫升的容量瓶内，用250mM EDTA 溶液进行稀释。2.2 样本的制备1).配方奶粉:称取7.5克LIPIL安婴儿配方奶粉或10.0克安儿宝配方奶粉于100毫升容量瓶内。液体配方奶:移取25毫升安婴儿配方奶于50毫升容量瓶内2).将磁力搅拌棒置于容量瓶内，加250mM EDTA溶液至该容量瓶瓶颈处，充分搅拌溶液1时。3).取出搅拌棒并用250mM EDTA溶液稀释至刻度。(注意：稀释之前可以加入1滴1-辛醇以消除泡沫的生成。)4). 分别用移液管吸取8.0毫升样本溶液到4个25mL 容量瓶内，贴上标签1、2、3、4。向
42、每一个容量瓶分别加入下列量加标溶液：容量瓶编号加标溶液的加入量（mL）1021.032.043.0用250mM EDTA溶液稀释至刻度5). 将上述加标后的样本溶液在4C、 10,000g转速下离心15分钟6). 提取乳清蛋白部分，用25毫米口径、0.45微米滤孔的Pall GHP注射式过滤器过滤。7). 将过滤后的样本收集于硅烷化色谱瓶内。附件3：色谱分离条件3.1 仪器装置HP 1100 高效液相色谱仪 100微升注射器 流速1 mL/min Resource RPC 1 mL 聚苯乙烯-二乙烯基苯色谱柱（通用电气医疗集团产) 二极管阵列检测器（214nm）流动相A - 0.1% 体积比的三氟乙酸水溶液流动相B - 0.09%体积比的三氟乙酸, 90% 乙腈水溶液工作曲线的梯度时间(分钟)%流动相B0201206401645195020502370241002510027203020附件4：色谱图实例空白样 - 250mM EDTA最小值安婴儿Premium配方