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1、精选优质文档-倾情为你奉上创伤感染时巨噬细胞表面模式识别受体表达、相互作用及其与炎症反应发生的关系基金项目:国家重点基础研究规划项目(2005CB，)，全军十一五科技攻关项目(06G080)supported by the National Key Basic Research and development Plan of China (2005CB), and the Tackling Project of the “Eleventh Five-Year Plan” for Sci & Tech Project of PLA (06G080)作者简介:杨策, 山西大同市人, 博士, 助理研
2、究员, 主要从事创伤基础方面的研究通信作者:蒋建新,电话:(023),E-mail:jiangjx杨策 陈永华 黄宏 王海燕 谢国旗 蒋建新 (第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室,全军交通医学研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 )摘 要： 目的 从免疫细胞表面模式识别受体水平揭示创伤感染条件下炎症反应的发生机制，为探寻有效调控炎症反应的新措施提供新思路。 方法 选择小鼠内毒素血症、盲肠结扎穿孔、肺泡巨噬细胞免疫刺激模型，以免疫组织化学法和RT-PCR法检测主要模式识别受体的表达；利用细胞转染模型研究CD14、TLR4、MD2相互作用及其与跨膜信号转导的关系。 结果 免疫细
3、胞清道夫受体和CD14、TLR4、MD2，分别呈现下调和上调表达，且转染CD14、TLR4和MD2三种表达质粒的HEK293细胞株对FITC-LPS结合率最强(P0.05)、在内毒素刺激后NF-B活性、TNF-分泌最显著(P0.05)。 结论 免疫细胞表面防御性受体下调和效应性受体上调参与炎症反应失控过程，调控模式识别受体表达对减轻机体炎性损伤有重要意义。关键词：模式识别受体; 内毒素; 创伤和损伤中图法分类号：R631.1 文献标识码：AExpression of pattern recognization receptors on macrophages, their interactio
4、n and relationship with development of inflammatory response in traumatic infection YANG Ce, CHEN Yong-hua, HUANG Hong, WANG Hai-yan, XIE guo-qi, LIU Da-wei, JIANG Jian-xin (State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Research Institute of Surgery, Research institute for Traffic Medic
5、ine of PLA, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing , China)Abstract： Objective To investigate the possible mechanism of traumatic infection-related inflammation via the pattern recognization receptors (PRRs) in innate immunocytes and provide the new idea for the new measures i
6、n modulating the excessive inflammatory responses. Methods The models of endotoxemia mice, cecal ligation and puncture, and immmuno-stimulated alveolar macrophages were used for the assay of PRRs with immunohistochemistry and reverse transcription PCR method. HEK293 cells co-transfected plasmids exp
7、ressing CD14, TLR4 and MD2 or two of them were stimulated with 100 ng/ml lipopolysaccharide (LPS) for the determination of NF-B and tumor necrosis factor (TNF)-. Results SR was up-regulated while the expression of CD14, TLR4 and MD2 were down-regulated in innate immunocyte. The HEK293 cells co-trans
8、fected three types of plasmids enhanced the sensitivity to LPS binding and stimulation compared with HEK293 cells co-transfected two of them (P0.05), followed with the significant translocation of NF-B and TNF- secretion (P90 %, 台盼蓝染色鉴定细胞活力95 %。将AM接种于预置玻片的24 孔培养板，于37 C，5% CO2孵箱培养12 h。以细胞因子刺激后，行SP法染色
9、6，同法半定量分析蛋白表达。1.5 肺组织和肺泡巨噬细胞SR mRNA、CD14 mRNA和TLR4 mRNA 检测mRNA以半定量逆转录PCR检测。总RNA按RNA提取试剂盒(Omega, 美国)说明提取。引物（表1）自上海申能博采公司合成。二步法逆转录反应参照试剂盒(Takara, 日本)方法进行。按94 C预变性2 min，94 C变性60 s，57 C退火30 s，72延伸8 min，循环33次。扩增产物电泳后以Quantity One软件计算光密度值。表 1 模式识别受体基因PCR引物指标序列长度SR上游：5- CCAAGTCCTTGCAGAGTCTG -3307 bp下游：5- G
10、TCTGAGGTCGTTGGTGATG -3CD14上游：5- CGCTCAATCTGTCTTTCAC -3384 bp下游：5- GACTGCCTTTCTTTCCTTAC -3TLR4上游：5- CCGGAAGGT TAT TGT GGTAGTGTC -3300 bp下游：5- AGGGCATTTTTA AGTCTTCTCCAG -3GAPDH上游：5- CGGTGCTGAGTATGTCGT -3613 bp下游：5- GGTGGA AGA GTGGGA GTT -3SR: 清道夫受体; TLR4: Toll 样受体4; MD2: 髓样分化蛋白2; GAPDH: 3-磷酸甘油醛脱氢酶1.6
11、转染CD14、TLR4和MD2质粒的HEK293细胞对LPS结合率变化将处于对数生长期的HEK293细胞消化后，以DMEM（Roche，美国）完全培养基调整细胞浓度至5104/ml，接种于24孔培养板，每孔细胞数为5104，培养至60的汇合率。细胞分7组：转染CD14质粒组（pcDNA3/HCD14, 本室保存）；转染TLR4质粒组（pFLAG-CMV-1-TLR4, Muzio教授惠赠，Mario Neg研究所, 意大利）；转染MD2质粒组（pEFBOS-MD2, Kensuka教授惠赠，日本）；共转染CD14、TLR4质粒组；共转染CD14、MD2质粒组；共转染TLR4、MD2质粒组；共转
12、染CD14、TLR4、MD2质粒组。D-Hanks漂洗后，先加1 ml DMEM无血清培养基，随后各组分别加入含相应质粒、转染剂Fugene 6（Roche, 美国）的转染液，继续培养36 h。最后再加入现配的终浓度为1 g/ml的FITC-LPS（Sigma, 美国），37 C孵育2 h。以胰蛋白酶消化细胞，收集并漂洗后，流式细胞仪检测细胞对FITC-LPS的结合率。1.7 转染NF-B反应性d2EGFP的HEK293细胞荧光蛋白表达含有NF-B结合位点的不稳定型绿色荧光蛋白报告质粒p4b-d2EGFP(本所王付龙硕士惠赠)同法转入HEK293细胞。以含600 g/ml G418的选择性培养
13、基筛选710 d。挑取阳性克隆涂板扩增，并以200 g/ml G418继续筛选28 d。随后按上法转染各种组合质粒。转染后36 h，再以终浓度为100 ng/ml LPS刺激。流式细胞仪检测阳性细胞率。1.8 TNF-测定在LPS刺激转染不同质粒的HEK293细胞3 h后，收集上清。严格按ELISA试剂盒(Bendor公司, 美国)说明书操作，TNF-按表示其稀释浓度范围的标准曲线予以定量，以样品吸光度值求得TNF-浓度。1.9 统计学分析实验数据用均数标准差表示，以SPSS11.0进行单因素方差分析和t检验。2 结果与讨论2.1 创伤感染时巨噬细胞表面模式识别受体表达变化与局部炎症反应的关系
14、结果显示，内毒素血症、创伤合并内毒素血症时动物肝、肺组织SR mRNA及其蛋白表达呈进行性下调，CD14、TLR4 mRNA及其蛋白表达呈进行性上调，其中以创伤合并内毒素血症时受体表达变化最明显（肝SR: 39.15 4.24 vs 17.23 2.12, 肝CD14: 17.14 1.69 vs 37.31 5.28; 肺SR: 33.29 2.40 vs 17.48 1.75, 肺CD14: 14.49 1.93 vs 39.17 5.06）。CLP后12 h，SR呈下调变化(SR mRNA: 0.65 0.04 vs 0.22 0.03)，肺组织CD14、TLR4呈不同程度上调表达（CD
15、14 mRNA：1.31 0.11 vs 0.50 0.06, TLR4 mRNA: 0.91 0.06 vs 0.45 0.05）。提示感染或创伤合并感染时，体内组织巨噬细胞表面呈现SR表达下调，CD14、TLR4表达上调的变化规律。体外实验结果显示，随着LPS剂量增加，小鼠肺泡巨噬细胞SR mRNA呈明显的下调表达，LPS刺激可使小鼠细胞内CD14、TLR4 mRNA均呈不同程度的上调表达(CD14 mRNA：1.69 0.09 1.00 0.16 vs 0.35 0.09, TLR4 mRNA: 0.65 0.16 0.21 0.03 vs 0.41 0.10)。与此同时，内毒素血症时肝
16、、肺组织内TNF-a、IL-6、IL-4、IL-10释放增加，LPS刺激培养肺泡巨噬细胞产生TNF-a、IL-6、IL-10增加与组织内CD14表达增加呈显著正相关，与SR表达下降呈显著负相关。此外，内毒素血症时血浆ALT、TB水平、肝组织内MDA水平、肺体指数的增加也分别与肝、肺内SR表达下调、CD14表达上调呈显著的相关性。CLP脓毒症时肺内各PRRs的表达变化分别与肺脏组织内髓过氧化物酶（MPO）、TNF-水平增加也呈一定的相关关系2,3,6,7。因此，感染或创伤合并感染时以上受体的表达变化可能是导致局部和全身炎症反应失控的重要机制。2.2 细胞因子对模式识别受体表达的调控作用TNF-对
17、SR、CD14、TLR4表达的影响：肺泡巨噬细胞SR mRNA表达逐步减少，并在刺激后6 h已明显低于对照水平(1.09 0.09 vs 1.35 0.11）。TNF-刺激3 h，CD14 mRNA表达明显增多(0.83 0.05 vs 0.37 0.15），并随刺激时间延长，CD14 mRNA表达呈增多趋势，TLR4 mRNA表达无明显变化。TNF-刺激后，肺泡巨噬细胞内SR、CD14、TLR4蛋白表达与mRNA表达变化一致(SR: 38.50 3.90 vs 21.50 4.50, CD14: 20.5 4.00 vs 41.3 3.90)。IL-6对SR、CD14表达的影响：SR 和CD
18、14 mRNA表达与IL-6也呈明显的时效和量效关系。SR mRNA表达在IL-6刺激8 h明显降低，至12 h最低(0.28 0.07 vs 0.64 0.07）。IL-6刺激后4 h，CD14 mRNA表达明显增多，至12 h达峰值(0.58 0.04 vs 0.38 0.04）。在0.01100 ng/ml之间，SR和CD14mRNA表达随IL-6浓度增加分别呈不断下降或上升变化。SR蛋白表达则随IL-6刺激时间延长而逐渐降低，至16 h最弱(24.60 4.00 vs 42.20 3.10）。IL-6刺激2 h，CD14蛋白表达增强，至16 h最明显(39.4 3.80 vs 24.4
19、 2.60)，至24 h仍高于正常对照。量效实验显示，SR表达随着IL-6剂量的增加而逐渐降低，至100 ng/ml最低(25.80 4.30 vs 42.70 4.20）。细胞表面CD14表达随着IL-6刺激剂量增加逐渐增强，至100 ng/ml表达最强(41.5 4.60 vs 25.7 3.30)。IL-10对SR、CD14表达的影响：胞内CD14和SR mRNA表达与IL-10呈明显的时效和量效关系，即随IL-10刺激时间延长或刺激浓度增加，CD14 mRNA表达呈进行性下降(0.48 0.06 0.25 0.08 vs 0.49 0.05），SR mRNA表达则进行性增加(0.72
20、0.05 1.22 0.06 vs 0.67 0.05）。随IL-10刺激时间延长，CD14蛋白表达未见明显变化，SR蛋白表达则随着IL-10刺激时间延长而逐渐增多，至16 h达峰值(50.1 3.60 vs 37.30 2.10)。量效实验显示，随着IL-10浓度的增加，CD14蛋白表达无明显变化，SR蛋白表达则逐渐增多，至10 ng/ml达峰值(52.7 3.90 vs 39.20 2.50)。因此，除PAMPs直接作用外，感染过程中释放的促炎因子（TNF-a、IL-6）和抗炎因子(IL-10)能反馈调节效应细胞PRRs表达，且两者调节作用相反。抗炎因子可能通过对PRRs表达调控抑制促炎因
21、子释放、对抗炎症反应。2.3 模式识别受体对免疫细胞的调控作用及其跨膜信号转导模式SR是介导LPS清除的防御性受体，本身不直接介导LPS的细胞激活效应。CD14是一种GPI锚定膜蛋白。利用抗CD14抗体，37C、30 min，阻断CD14，随后用磷脂酶C预处理肺泡巨噬细胞，使膜结合CD14从细胞膜上脱落，或用抗CD14单克隆抗体封闭细胞膜上CD14，均能明显抑制低剂量LPS对细胞的激活效应。用SR配体-氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)预处理肺泡巨噬细胞，可增强LPS刺激肺泡巨噬细胞释放TNF-a的作用。抗CD14抗体则可完全抑制ox-LDL增强LPS的作用3。因此，防御性受体SR和兴奋性受体
22、CD14存在一定的功能联系。目前认为，巨噬细胞表面至少存在CD14、TLR4和MD2介导LPS激活细胞。为揭示三种受体是否都能结合LPS，以单独或协同方式介导LPS跨膜信号，研究通过PRRs基因转染，发现单个基因转染时，CD14与LPS结合率最强，其次为MD2，TLR4与LPS结合率很弱。在两两联合转染时，CD14TLR4组细胞与LPS结合率与CD14组相近，CD14MD2组细胞与LPS结合率强于CD14组和MD2组,TLR4MD2组细胞与LPS结合率强于TLR4组和MD2组。三种联合转染时，细胞对FITC-LPS结合率最强，明显高于两两或单个基因转染组(表2)，表明天然免疫细胞识别LPS可能
23、需三种受体共同参与。表 2 转染携带不同模式识别受体基因的质粒后HEK293细胞与FITC-LPS结合率的变化转染基因阳性细胞百分率空白对照3.72 0.96CD1419.63 3.02bTLR43.28 0.74MD-210.86 2.67aCD14TLR420.19 3.94aCD14MD-226.60 3.92b cTLR4MD-230.78 9.22bCD14TLR4MD-255.44 2.07b ea：P 0.05，b：P 0.01，与空白对照组比较；c：P 0.05，与CD14和MD2组比较；d：P 0.01，与TLR4和MD2组比较；e：P 0.01，与其他组比较进而发现，单个基
24、因转染的细胞对LPS刺激反应均很弱。提示单个膜蛋白不能独立完成LPS跨膜信号转导，需要相互间的协同作用。CD14-MD2共转染时细胞对LPS刺激反应较单个基因转染无明显变化，CD14-TLR4或TLR4-MD2共转染时细胞对LPS的刺激反应较单个基因转染均有所增强。在三者共转染时效应最强，表现为NF-B结合位点的不稳定型绿色荧光蛋白表达最强(图1)和TNF-分泌水平最高(488.26 54.41 pg/ml，表3)。提示巨噬细胞识别LPS及LPS激活细胞至少需要三种受体共同参与，即CD14结合LPS，TLR4将LPS刺激信号传入细胞内，MD2可能协同TLR4结合LPS并转导LPS信号。图1表
25、3 LPS刺激转染携带不同模式识别受体基因的质粒的HEK293细胞TNF-水平（pg/ml）转染基因阳性细胞百分率空白对照68.22 13.95CD1479.29 13.15TLR474.32 8.70MD-265.58 8.13CD14TLR479.45 21.97CD14MD-272.43 3.14TLR4MD-2123.75 16.39aCD14TLR4MD-2488.26 54.41b ca：P 0.05，b：P 0.01，与空白对照组比较；与其他组比较: c：P 0.01综上所述，创伤感染时，免疫细胞表面防御性受体下调、效应性受体上调与炎症反应失控密切相关，CD14、TLR4和MD2
26、对免疫细胞识别病原分子具有协同作用，合理调控模式识别受体表达对于增强机体免疫，防御感染具有重要意义。参考文献：1 蒋建新,姚咏明,郑江. 细菌内毒素基础与临床M.北京:人民军医出版社, 2004：90.2 Jiang J, Xie G, Chen Y, et al. Intra-hepatic expression of scavenger receptor and CD14 and their relationship with local inflammatory response in endotoxemia in miceJ. Shock,2001,164(1):75-80.3 Jia
27、ng J, Xie G, Chen Y, et al. Intrapulmonary expression of scavenger receptor and CD14 and their relation to local inflammatory responses to endotoxemia in miceJ. World J Surg, 2003,27(1):1-9.4 Schnabl B, Brandl K, Fink M, et al. A TLR4/MD2 fusion protein inhibits LPS-induced pro-inflammatory signalin
28、g in hepatic stellate cellsJ. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 375(1):210-214.5 Baker CC, Chaudry IH, Gaines HO, et al. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture modelJ. Surgery, 1983,94(2):331-335.6 陈永华,蒋建新,谢国旗,等.内毒素血症时小鼠肺泡巨噬细胞CD14和清道夫受体的表达J. 第三军医大学学报，2000,22(7):615-620.7 谢国旗,蒋建新,朱佩芳,等.库普弗细胞SR表达变化与内毒素肝损伤的关系J. 中华肝脏病杂志，2001,9(2):117-119.