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1、探析食品中沙门菌检测验证结果摘要:为了考察实验室对沙门菌的检测能力，根据GB4789.4-2016和3M测试片两种不同方法对能力验证的盲样进行检验，同时将盲样与标准菌株做对照。经过预增菌、增菌、分离、生化试验、血清学鉴定，两个盲样均得到满意结果。2种方法均能够准确地鉴定出沙门菌。通过这次能力验证，实验室的能力得到了有效的证实。关键词:沙门菌；国家标准；3M测试片；能力验证；盲样沙门菌是最常见的食源性细菌病原体，是食物传播病原菌中研究最多的一种病菌，也是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各国各类细菌性的食物中毒中，沙门菌经常位居前列。所以，沙门菌的检测是各个国家检验机构对食品的必检项目之一。检测食
2、源细菌的传统方法是对目的菌进行培养、分离和生化鉴定，有时还需要进行血清学鉴定，繁琐耗时。因而快速、准确地检验微生物的新技术、新方法不断出现，可提高食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。通过参加能力验证活动，能够发现实验室存在的问题，帮助实验室不断改善技术和管理水平，同时还能增加客户对实验室的信任程度1。为了提高实验室的检测能力和水平，本实验室参加了由原辽宁出入境检验检疫局组织的沙门菌检测能力验证。此次能力验证样品2个、标准菌株1个、样品4个、样品加标准菌株的菌悬液2个，共9个样品采用国标GB4789.4-2016（食品微生物学检验沙门氏菌检验方法）2和3M测试片法，2种方法对测试样品进行
3、检测分析，获得满意结果。1材料与方法1.1材料沙门菌样品冻干粉，由原辽宁出入境检验检疫局提供；鼠伤寒沙门菌ATCC140283M测试片，购于北京陆桥技术有限责任公司；4种口味的压缩干粮，由军代室提供。1.2培养基和试剂缓冲蛋白胨水BPW、四硫磺酸钠煌绿TTB增菌液、亚硒酸盐胱氨酸SC增菌液、亚硫酸铋BS琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐XLD琼脂、沙门菌显色培养基、沙门菌干制生化鉴定试剂盒，购于北京陆桥技术有限责任公司。沙门菌属O多价血清A-F，购于宁波天润生物药业有限公司。1.3仪器与设备BSC-1500A2-X生物安全柜济南鑫贝西生物技术有限公司；AV8101精细天平美国SpiralBiotech
4、公司；400VW均质器法国Interscience公司；LRH-250生化培养箱上海一恒科技有限公司；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂。2样品制备2.1样品原液的制备无菌开启西林瓶，立即参加少量24mL稀释液生理盐水进行再水化，稀释液合计40mL，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，反复用余下的稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述的无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液，全经过20min内完成3。2.2菌悬液的制备以无菌生理盐水将鼠伤寒沙门菌制成菌悬液，于361，1824h增菌培养后备用。3检验方法及结果采用GB4789.4-2016和3M测试片2种方法进行检测。其中3M测试片只
5、做前增菌的步骤。同时2种方法均利用标准菌株作对照。3.1预增菌1以无菌操作汲取水化后的样品原液25mL，参加装有225mL灭菌BPW的无菌锥形瓶，震荡摇匀。2固体样品粉碎后称取25g，参加灭菌225mLBPW的无菌均质袋中，用均质器拍打12min。320g粉碎固体样品和5mL菌悬液后参加灭菌225mLBPW的无菌锥形瓶，用均质器拍打12min。于361，培养818h。3.2增菌取预增菌后的BPW缓冲液中分别移取1mL转接种于10mLTTB内，于421培养1824h；移取1mL转接种于10mLSC内，于361培养1824h。用无菌吸管汲取1mL能力验证样品、样液和样品加菌悬液的匀液渐渐均匀地滴加
6、到纸片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置10s左右；同时做菌株的匀液。于361，培养1524h。结果：沙门菌在3M测试片上的结果应为绿色菌落。1菌株在3M测试片上的结果为绿色菌落。2能力验证样品1在3M测试片上的结果为黄色菌落。3能力验证样品2在3M测试片上的结果为绿色菌落。4样品1在3M测试片上的结果为黄色菌落。5样品2在3M测试片上的结果为黄色菌落。6样品3在3M测试片上的结果为黄色菌落。7样品4在3M测试片上的结果为黄色菌落。8样品加菌悬液1在3M测试片上的结果为绿色菌落。9样品加菌悬液2在3M测试片上的结果为绿色菌落。3.3分离取增菌后的沙门菌增菌液分别接种在沙门菌显色培养基、XLD琼脂
7、平板于361，培养1824h。BS琼脂平板上，于361，培养4048h。观察各个平板上生长的菌落形态，详见表1。通过观察能够确定沙门菌显色培养基生长的白色和蓝绿色菌落、BS琼脂平板上白色的菌落为非典型菌落，不符合标准菌株的菌落形态能够排除。沙门菌显色培养基上的紫色菌落为A菌，XLD琼脂平板上的能力验证样品1上和样品14上为黄色菌落为B菌，黑色菌为C菌，能力验证样品2上的菌落形态是黑色有光泽和黄色为D和E菌，BS琼脂上灰黑色无光泽为F菌，灰绿色带有黑心为G菌，黑色有金属光泽为H菌。一共8种菌落为可疑菌，需进行生化试验和血清学鉴定。3.4生化鉴定套装试验结果1分别从沙门菌显色培养基、XLD琼脂平板
8、和BS琼脂平板上挑取A到H共8种菌落及标准菌株分别接种在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基上，于361，培养1824h，观察结果，详见表2。通过在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基生化试验比拟发现，XLD琼脂平板和BS琼脂平板上的B、C、F3种菌落生化反响均不符合沙门菌的生化特征，标准菌株符合沙门菌的生化特性。2生化鉴定套装试验：分别从沙门菌显色培养基、XLD琼脂平板和BS琼脂平板上挑取A、D、E、G、H共5种分别接种到沙门菌干制生化鉴定试剂套装中的试剂中，于361，培养1824h，观察结果详见表3。通过生化试验比拟发现，XLD琼脂平板和BS琼脂平板上的A、D、E、G、H5种菌落生化反响均符合
9、沙门菌的生化特征，标准菌株符合沙门菌的生化特性。3.5血清学鉴定先检查待测菌有无自凝现象。经检查两种可疑菌均未发生自凝的现象。在玻片上划出2个约1cm2cm的区域，挑取一环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在右边区域加1滴沙门菌属O多价血清A-F，在左边区域参加1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环将两个区域内的菌落研成乳状液2。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑色背景进行观察，可疑菌A、D、E、G、H均发生凝集反响，血清学实验为阳性，B、C、F可疑菌均未发生凝集反响，血清学实验为阴性。标准菌株发生凝集反响，血清学实验为阳性。利用2种方法检测能力验证样品1均未检出沙门菌，能力样品
10、2均检出沙门菌，结果为满意。样品14未检出沙门菌、菌悬液加样品1和样品2有效的检出沙门菌。3M测试片的方法无需特定的仪器设备，且操作简单、快速出结果、灵敏度高、易于判定；该方法已获得AOAC官方方法认证，其结果准确可靠，合适应用于广大食品企业和政府实验室沙门菌的检测4。国标法是经典的检测方法，但检测周期长，经过复杂5。3M测试片方法检测能够快速准确的检测出结果。2种方法结合，综合判定，可确保检测结果的准确性。通过这次能力验证，提高了实验室的检测能力，积累经历的同时在试验中发现了很多缺乏：13M测试片法中由于实验室很少做，由于不知能力验证样品中添加的沙门菌的浓度，直接使用前增菌液，导致测试片上没有单个菌落生长，最好使用增菌后的的液体。或者使用3M测试片法测定沙门菌配套的试剂。2沙门菌分离纯化可疑菌的时候，需要屡次纯化，本次实验只挑取了选择琼脂上的可疑菌落，以后实验中出现可疑菌的时候应在营养琼脂纯化后再进行生化试验。3血清学鉴定的时候两种诊断血清都应该做，然而实验室只做了沙门菌属O多价的，盲样未凝集故实验室没做抗原H的鉴定，在以后的试验经过中假如O多价凝集后必须再做抗原H的鉴定。