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1、精选优质文档-倾情为你奉上一、 限制性内切酶及其应用(一)限制性核酸内切的发现当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 Eco核酸酶不能识别已甲基化的序列。最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan，B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，没有实用价值。首个II型限制内切酶是在1970年，由H.O.Smith等从Heamophilus influenzae的Rd
2、菌株中Hind II 。使得分子的体外精确切割成为可能。从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种中，其中有30%是在NEB发现的 。限制性核酸内切酶(restriction endonuclease )：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5-磷酸二酯键。(二)限制性核酸内切酶的分类分为I型、II型和III型。(三)限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemop
3、hilus influenzae 表示为Hin;2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind;3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hin。d III(四) II型限制性核酸内切酶的基本特性1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由48个核苷酸组成的特定序列(靶序列)。2、识别序列的对称性靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性交错切或对称切(可形成粘性末端或平末端的DNA分子)。与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在
4、限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平 末 端 ：Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。同裂酶：isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶：isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一组同尾酶。注 意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段
5、将不能被该两种酶的任一种所识别。(五)限制性核酸内切酶的消化反应一个限制酶单位(U)指：在理想的反应条件(适宜的缓冲液和反应温度，通常为37)下，1h内中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：DNA的纯度 DNA的甲基化程度酶切反应的温度(通常为37 )DNA的分子结构 核酸内切限制酶的缓冲液在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。二、 DNA连接酶及其应用(一)DNA连接酶的发现环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶
6、存在。首个DNA连接酶(ligase)大肠杆菌DNA连接酶，是1967年发现的，是大肠杆菌基因编码。1970年，发现了T4DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。(二) DNA连接酶作用特点1. 连接的两条链必须分别具有自由3-OH和5-P，而且这两个基团彼此相邻;2. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。E.coli DNA连接酶 -连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明)，现在研究可连接平末端;需NAD+辅助因子，活性低，不常用。T 4DNA连接酶-连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。(三) DNA连接酶的反应条件影响连接效率的因素有：1. 温度
7、(通常在4-15 )2. ATP的浓度(10M/L - 1mM/L )3. 连接酶浓度(一般平末端大约需12U，黏性末端仅需0.1U)4. 反应时间(通常连接过夜)5. 插入片段和载体片段的摩尔比( 1151)(四)T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1.连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.10l体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子(一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1151)，补足ddH2O 至8l。3.轻轻混匀，稍加离心，56水浴5min后，迅速转入冰浴。4.加入含ATP的10Buffer 1l，T4 DNA连接酶
8、合适单位， 用ddH2O 补至10l，稍加离心，在适当温度(一般14-16)连接8-14hr。三、DNA聚合酶及其应用(一)大肠杆菌DNA聚合酶I是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力：5 3聚合酶活性(模板， 带3-OH游离基团的引物、4dNTPs、 Mg2+ )。双链特异性的53核酸外切酶活性。35核酸外切酶活性。从游离的双链或单链DNA的3端降解。不过对于双链的降解可被5-3的多聚活性所抑制。主要是校正作用。大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途1.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针利用其5-3的外切
9、酶活性及其聚合酶活性。2.用于DNA连接前的大缺口填充利用5-3的聚合酶活性。3.用于DNA的序列分析利用5-3的聚合酶活性。(二)Klenow片段酶Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。酶催活性：5 3 的聚合酶活性3 5 的核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途(利用5 3 的聚合酶活性)：修补限制性酶消化DNA形成的3隐蔽末端标记DNA片段的末端底物用-32P-dNTPscDNA克隆中第二链cDNA的合成DNA序列的测定(三)T4 DNA聚合酶T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，1.酶催活性：53
10、的聚合酶活性3 5 的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶强1001,000倍。因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 5 外切酶活力，从双链DNA的3开始降解，直到露出底物dNTP相同的碱基。然后就在此位置发生合成和取代反应。2.T4DNA聚合酶的用途(1)利用取代合成反应制备探针(2)标记具有平末端的或具有3-隐蔽末端的DNA片段利用较强的3 5 外切酶活性和 53聚合活性(3)用于DNA序列分析(四)逆转录酶(反转录酶)逆转录酶 是一种依赖RNA的
11、DNA聚合酶。此酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的Nature杂志上。最普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)分离出来的。活性：一种可以有效地将mRNA反转录成DNA的酶，其产物称为cDNA(complementary DNA).主要用途是 将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。四、修饰性工具酶(一)末端转移酶(terminal transferase)l 末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。l 特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3-OH。特别是对于平末端的双链DNA末端
12、加尾十分有用。l 最常见的用途：给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。(二) SI核酸酶(SI nuclease)这是一种从米曲霉(Aspergillus oryzae)中分离的高度单链特异的外切酶。活性：可以降解单链DNA或RNA或双链的单链区。其主要用途有：在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端;载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴，形成平末端结构。(三)碱性磷酸酶从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶(Bacterial Alkaline Phosphatase)简称BAP。从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶( Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) ，简称CIP，用的广泛。酶催功能：脱磷酸作用，将单链或双链DNA或RNA5-P转化成5-OH。其主要用途有：在用32P标记DNA 5端之前，去除5端的磷;在DNA重组技术中，去除DNA片段的5磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。专心-专注-专业