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1、乙肝病毒的变异及临床意义 乙型肝炎病毒感染引起的慢性乙型肝炎以及相关的肝硬化、肝细胞癌和肝功能衰竭是全球范围内重要的医学和公共卫生问题。抗病毒治疗是这一类慢性肝病的根本治疗方法。干扰素和核苷（酸）类似物（NA)是两类主要的抗病毒治疗药物。但长期使用NA，耐药是一个突出的问题。所以，认识耐药、防范耐药具有重要的临床意义。 一、乙肝病毒的研究简史 二、乙肝病毒的结构及复制 三、病毒变异: S、C、P、X区 四、病毒耐药的概念和危害 五、常用抗病毒药的耐药位点 六、预防和监测一、乙肝病毒的研究简史 1965年Blumberg发现澳大利亚抗原 1967年发现其与肝炎相关，称为肝炎相关抗原 1970年D
2、ane发现HBV完整颗粒 1972 WHO将澳大利亚抗原命名为乙型肝炎表面抗原（HBsAg) 1979年Galibert完成了HBV全基因测序 HBsAg的发现曾获诺贝尔医学奖二、乙肝病毒的结构及复制 乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科 ，HBV基因组由不完全的环状双链DNA组成，长的为负链、短的为正链，负链含3200bp，正链长度约为负链的50-80%。 HBV有四个ORF均位于负链，分别称作s区、C区、X区和P区，分别编码外膜蛋白、核心蛋白、X抗原和DNA多聚酶 。 HBV进入肝细胞后，病毒核酸进入细胞核并转换成cccDNA(共价闭合环状DNA), 以此为模板，转录成四种HBV RNA,其中
3、只有的mRNA含病毒DNA序列上的全部遗传信息，因此也称为病毒前基因组RNA。它与病毒聚合酶一起被核壳蛋白包裹，包装成病毒核心。在病毒核心内的前基因组RNA通过逆转录合成负链DNA，再以负链为模板合成正链DNA，一部分再进入细胞核补充消耗的cccDNA,另外一部分则在内质网中装配包膜，形成成熟的病毒颗粒向细胞外分泌。 HBV病毒颗粒感染肝细胞及病毒颗粒感染肝细胞及DNA复制过程复制过程 慢性活动型乙肝患者肝细胞每天可以产生1013个HBV颗粒，在外周血中浓度可达1012 /ml，半衰期11.2 d。被HBV感染的肝细胞半衰期为10天100天不等。肝细胞内的cccDNA半衰期较长，根据数学模型分
4、析，排除宿主的特异性免疫反应以及病毒变异的影响，需要进行14年的抗病毒治疗才能完全清除患者肝细胞内的cccDNA。 目前无药物可作于cccDNA,其稳定存在是HBV不能根治的原因。 三、病毒变异 病毒变异是生物遗传进化的必然，乙型肝炎病毒(HBV)变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的。在外来压力的作用下，HBV常发生选择性变异，一些特异性HBV突变株被选择出来。HBV DNA每个复制循环中每10000个碱基对可发生1个核苷错误，每天产生3.21010个点突变。HBV逆转录过程中缺乏校正机制是HBV容易耐药的根本原因。 1、S基因区变异基因区变异 S基因区可分为：前基因区可分为：前S
5、1、前、前S2和和S区，区， 分别编码preS1、preS2和HBsAg。前S蛋白免疫原性很强，可与肝细胞的受体结合，是HBV具有嗜肝性的重要原因。 由于S基因编码HBsAg，所以其变异会产生如下不良临床结果： Keeffe EB, et al.慢性活动型乙肝患者肝细胞每天可以产生1013个HBV颗粒，在外周血中浓度可达1012 /ml，半衰期11.2006年 NIH会议建议其定义为：治疗后达到应答，但在继续治疗过程中HBV DNA比达到的最低值一致性地超过1 log10拷贝/ml时，称为病毒学反弹。5考虑联合治疗或剂量加倍方案到治疗48周时，如仍为部分应答或不充分应答，应改变治疗药物，除非H
6、BV DNA接近可检测的下限；病毒变异是生物遗传进化的必然，乙型肝炎病毒(HBV)变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的。治疗的规范性和病人的依从性可减少耐药的发生，如果不按照要求随意更换药物、不按时服药或随意停药，就会增加病毒耐药的机会及其他危害（举例4：略）。此突变有助于HBV逃避免疫攻击但它并不影响HBV复制，而形成慢性感染状态。抗病毒治疗是这一类慢性肝病的根本治疗方法。在病毒核心内的前基因组RNA通过逆转录合成负链DNA，再以负链为模板合成正链DNA，一部分再进入细胞核补充消耗的cccDNA,另外一部分则在内质网中装配包膜，形成成熟的病毒颗粒向细胞外分泌。1965年Blumb
7、erg发现澳大利亚抗原2、核苷类： 疗程不固定48周时完全应答，继续治疗其他的耐药株有215、237和238位点变异，但需进一步确定这种变异的临床意义。这种情况临床上表现为HBeAg(-)、HBV-DNA(+)。C1896位(A83)的变异：是HBV中最常见的变异。48周时完全应答，继续治疗 (1) HBsAg阴性的乙肝病毒感染：S基因变异后所表达基因变异后所表达的的HBsAg不能被现在的普通检查方法检测到，不能被现在的普通检查方法检测到，致使乙肝病毒仍然存在，却不被发觉。对这种情况，应该结合HBeAg检查和乙肝病毒的基因检查技术，方可得出正确的结果。 (2)免疫预防失败：使用野毒株HBsAg
8、制备的血源性或基因过程乙肝疫苗所产生的抗乙肝疫苗所产生的抗HBs对一些变异株的对一些变异株的HBsAg的亲和力和中和作用明显下降的亲和力和中和作用明显下降，从而可使乙肝疫苗阻断母婴传播和乙肝免疫球蛋白预防移植肝再感染乙肝病毒失败。 (3) 致病性的改变：S基因变异株在乙肝病毒无症状携带者、急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化和肝癌患者体内均有发现，使病变程度加重病变程度加重，范围增加。 (4) HBsAg亚型的改变：由于核苷酸序列发生变异，会引起HBsAg亚型的改变，使病情复杂化病情复杂化。 总之 S基因变异是疫苗免疫失败的重要原因 S基因变异后免疫球蛋白将不能发挥保护作用 逃避干扰素治疗和宿
9、主免疫清除逃避干扰素治疗和宿主免疫清除 S基因变异是形成 HBsAg 阴性、抗 HBs 阳性、HBV-DNA 持续阳性的慢性乙型肝炎的重要原因 2、前C/C基因变异 C1896位(A83)的变异：是HBV中最常见的变异。nt1896G-A，使28位的色氨酸（密码子TGC ）变异为终止密码TAC，导致前C蛋白的翻译终止，从而使eAg不能合成。此突变有助于HBV逃避免疫攻击但它并不影响HBV复制，而形成慢性感染状态。这种情况临床上表现为HBeAg(-)、HBV-DNA(+)。 上述变异也见于干扰素治疗后，因此提示以HBeAg转阴作为疾病好转的指标有时并不准确，应结合HBV DNA检测判断。 前C区
10、/C区突变检测的临床意义判断判断e e抗原下降代表病毒复制能力下降的诊断是否可靠抗原下降代表病毒复制能力下降的诊断是否可靠判断乙肝病毒是否为特殊的判断乙肝病毒是否为特殊的e e抗原阴性病毒类型抗原阴性病毒类型慢性重症肝炎、肝硬化失代偿、原发性肝癌与慢性重症肝炎、肝硬化失代偿、原发性肝癌与C C区位点区位点突变有关突变有关对判断疾病预后对判断疾病预后, , 调整抗病毒治疗方案具有一定的参考调整抗病毒治疗方案具有一定的参考价值价值 是否是真的血清学转换C区变异使得细胞毒T淋巴细胞(CTL）效应降低 3、X基因突变 X基因突变编码154个氨基酸的X蛋白，X蛋白可激活乙肝病毒基因的复制过程，是乙肝病毒
11、基因组内结构和功能重叠最明显的区域。因此，X基因在乙肝病毒复制、表达及致病中起关键作用。近年来还发现乙肝病毒X基因变异及其产物HBxAg与乙肝病毒的致癌密切相关。 4、P基因变异 P基因主要编码DNA多聚酶，是最长的开放读框，与C、S与X基因重叠。该基因共分成5个区(A、B、C、D和E)。这些区域是较保守的，参与核苷酸或模板结合，并且具有催化活性。近10多年来，在用核苷类药物治疗患者中，出现了P基因突变，体内外试验表明这些突变株与药物耐药相关。四、病毒耐药的概念和危害 在核苷(酸)类似物治疗过程中，从病毒变异到临床耐药是一个逐渐发生的过程。最初，体内可能有少量变异的病毒株。尽管这些病毒对药物抵
12、抗力强，但其复制数量比野生病毒株少。因此，体内的野生病毒株仍占“优势” ，但随着治疗时间延长，野生病毒株被药物抑制住以后，耐药的变异病毒株被“筛选”出来，得到复制的机会，并逐渐增多，成为体内的“优势”株，这时便出现耐药。 与与DNA-PDNA-P结合抑制结合抑制HBV-DNAHBV-DNA复制复制核苷类似药物的作用机制核苷类似药物的作用机制 图. 抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临床耐药 为了准确地反映这种病毒变异到临床耐药的过程，我们把病毒变异后的耐药分为基因耐药、病毒学耐药和临床耐药三个阶段 基因耐药：在抗病毒治疗过程中体内乙肝病毒基因组产生了变异，形成新的耐药性病毒基因序列，对药物易感性降
13、低，但这种耐药病毒株在体内的量很少，只能通过病毒基因的检测查到变异病毒株。 *（表型耐药） 病毒学耐药：在基因耐药的基础上继续发展，变异病毒株逐渐增多，HBV DNA水平反弹，一般在(1103)(1106)拷贝/毫升之间，还没有造成肝功能异常和明显的肝脏组织学损伤。病毒学耐药也称为病毒学反弹。2006年 NIH会议建议其定义为：治疗后达到应答，但在继续治疗过程中HBV DNA比达到的最低值一致性地超过1 log10拷贝/ml时，称为病毒学反弹。 临床耐药：病毒学耐药继续发展，HBV DNA水平上升至1106拷贝/毫升以上，最终出现ALT升高、肝脏组织学损伤，并可能有临床症状。病 毒 耐 药 对
14、 临 床 的 影 响 耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低 耐药病毒的出现使后续治疗的药物选择减少 耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处病毒反弹, 血清转氨酶升高, HBeAg血清转换率降低肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡肝移植后肝炎复发率增高 公共卫生危害耐药病毒株的传播免疫逃逸五、常用抗病毒药的耐药位点 拉米夫定耐药位点：病毒最主要的变异发生在YMDD位点。YMDD是4个氨基酸(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)的缩写，这4个氨基酸位于乙肝病毒DNA聚合酶上，是拉米夫定的主要作用位点，最常见的变异是M(蛋氨酸)被V(缬氨酸)或I(异亮氨酸)取代，分别称为YVDD或YIDD变异(即：M
15、204V/I) 。一旦发生了YMDD变异，拉米夫定对HBV DNA的抑制作用就会降低1000倍以上。当长期应用拉米夫定时，发生YMDD变异的比率逐年增加。 举例1：略 阿德福韦耐药位点：主要为N236T(苏氨酸置换门冬酰胺)或A181/T(缬氨酸/苏氨酸置换丙氨酸)。体外检测，这些变异株对阿德福韦的易感性降低310倍，具有这些变异株的患者可伴有病毒学反弹、肝炎发作和肝功能失代偿。其他的耐药株有215、237和238位点变异，但需进一步确定这种变异的临床意义。 举例2、举例3：略 恩替卡韦耐药位点：P区的184、202和250位点发生氨基酸的置换变异，认为与发生恩替卡韦耐药有关，使其对药物易感性
16、降低10倍。在原有拉米夫定耐药患者中，病毒对恩替卡韦的感性降低830倍。恩替卡韦属于高基因屏障药物，耐药方式：rtL180M+rtM204V耐药位点再出现rtT184，或S202，或M250位点改变，也就是必须同时出现3个耐药位点。 替比夫定耐药位点：其抑制HBV复制的活力较拉米夫定强，但二者有交叉耐药，对有M204I变异或L180M/M204双重变异的拉米夫定耐药患者，替比夫定的敏感性也同样降低1000倍以上；但替比夫定对单独M204变异株仍有抑制作用，其易感性仅降低12倍。对阿德福韦耐药株A181的易感性降低35倍，但对N236T变异株仍敏感。 以上可以看出，拉米夫定、替比夫定有交叉耐药性
17、，恩替卡韦与前两者有部分交叉耐药性，而阿德福韦的耐药位点独特，与以上三种药物均无交叉耐药性。 干扰素治疗对HBV的压力主要集中在前C/C区及前S区。近来对前C区基因变异的研究显示，干扰素治疗并不增加前C区基因变异的机会，前C区终止变异也不影响干扰素治疗应答，但在干扰素治疗过程中产生前C区变异往往可预示病毒清除失败。 出现机体耐药可能与中和抗体的产生有关。 病毒对不同抗病毒药物的“基因屏障”是不同的，因此药物的耐药发生率也不同。所谓病毒对药物的基因屏障是病毒变异或逃逸药物选择造成病毒耐药的阈概率。有高耐药基因屏障的药物，病毒耐药的危险性较低；而低耐药基因屏障的药物，病毒耐药的危险性较高。 图2.
18、 各种抗病毒药物的耐药发生率六、预防和监测 抗病毒治疗期间所达到的病毒抑制程度，既是决定预后最重要的指标，也是预测耐药发生的好方法。近年来，路线图的概念是为了预测疗效及耐药而提出来的。Roadmap预测的概念Keeffe EB, et al. Clinical Gastroenterol Hepatol 2007;5:890897. 12周检测最初无应答病毒学应答早期治疗失败依从性良好依从性不好24周检测早期应答PCR 检测阴性完全病毒学应答介于300和104copies/ml部分病毒学应答 104 copies/ml病毒学应答不好开始治疗加用第二种药物继续原方案治疗每6个月监测一次初始选择低
19、耐药基因屏障药物：加用不同变异位点的药物初始选择高耐药基因屏障药物：每3个月监测一次，持续超过48周初始选择抗病毒疗效弱药物：每3个月监测一次，持续至48周48周时完全应答，继续治疗48周时不完全应答，加用疗效更强并且不交叉耐药的药物 治疗期间病人监测的目的是评估药物的安全性、依从性和有效性。特别是早期病毒学的应答状况对发现原发性治疗失败和预测长期疗效非常有价值，可以预测长期治疗可能发生组织学改善、减少肝病进展和/或耐药。 第一个监测点是在治疗12周时，如果血清HBV DNA下降小于1 log10 IU/ml或50 copies/ml，称为原发性治疗失败。原发性治疗失败是罕见的，如果不是因为病
20、人依从性问题，对于原发性治疗失败的病人应当改变治疗方案。 第二个监测时间点是治疗24周时病人的血清HBV DNA水平。24周时的疗效分为完全应答、部分应答或不充分应答。 完全应答的定义为：HBV DNA60 IU/ml或300 copies/ml(PCR法)。完全应答的病人继续服药，延长到每6个月随访并检测一次。 部分应答定义为：治疗24周时HBV DNA2000 IU/ml (4 log10 copies/ml)。部分应答的病人如使用耐药基因屏障较低的药物，应考虑增加第二种无交叉耐药性的药物，防止病毒耐药后反弹；如使用耐药基因屏障较高药物，应当继续每3个月监测一次直到48周以后；如使用抗病毒
21、作用较慢的药物(如：阿德福韦)，应当继续每3个月监测一次；到治疗48周时，如仍为部分应答或不充分应答，应改变治疗药物，除非HBV DNA接近可检测的下限；如在治疗48周时达到完全应答，应继续治疗。 不充分应答被定义为：在治疗24周时，HBV DNA 2000 IU/ml(4 log10 copies/ml)。 病毒耐药的预防病毒耐药的预防 1使用抗病毒疗效理想和有高耐药基因屏障的药物。在目前上市的乙肝抗病毒药物中，干扰素疗程短，不引起病毒耐药；在口服抗病毒药物中，选择高耐药基因屏障的药物。 2规范治疗和提高病人治疗的依从性 治疗的规范性和病人的依从性可减少耐药的发生，如果不按照要求随意更换药物
22、、不按时服药或随意停药，就会增加病毒耐药的机会及其他危害（举例4：略）。 3. 掌握好抗病毒指征及停药标准 4坚持治疗中的随访监测 在治疗过程中要定期监测ALT和血清HBV DNA，最好每3个月(12周)随访一次。如果及时发现HBV DNA升高和肝功能异常，及时处理完全可以避免病毒变异对病人健康的影响。如果在治疗中出现病毒反弹要考虑到可能有耐药发生，应予相应检测、调整治疗。 5考虑联合治疗或剂量加倍方案 在HIV感染的治疗中，“鸡尾酒”疗法(三种抗病毒药物联合治疗)明显减少的HIV的耐药率，提高了抗HIV的疗效。但在抗HBV治疗的研究中，联合治疗可以减少耐药的发生，但没有明显地提高e抗原血清转换率，因此对于没有耐药的初治患者是否联合治疗尚有争论。但是，对于失代偿期肝硬化患者，多数学者认为应该选择拉米夫定+阿德福韦联合治疗，或选择恩替卡韦治疗。 耐药或效果不理想的处理耐药或效果不理想的处理 病毒耐药或效果不理想不应贸然停药，可以继续原来的药物治疗、更换新的药物或加用新的药物继续治疗。病毒耐药后由于药物对体内残存的野毒株仍有效，因此在一些患者中继续原来的药物治疗比不治疗要好，但出现疾病重新活动和恶化的风险较高，在目前已有多种抗病毒药物上市的情况下，不值得提倡，可更换新的药物或加用新的药物继续治疗的药物选择。 Add on? Switch?感谢观看感谢观看