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1、第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选,1 基因组DNA文库的构建2 cDNA文库的构建3 基因克隆的筛选策略,外源基因：插入到载体内的那个特定的片段基因。 目的基因：那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。,对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。,为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是
2、未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。,1 基因文库(gene library)概念,又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。,2 构建基因文库的基本程序,1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；2) DNA片段或
3、cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择。,目的基因： 已知基因： 未知基因：构建基因文库 特定探针的制备 文库的筛选（筛库） 含目的基因的克隆,3 基因文库的分类,按照外源DNA片段的来源： 从特定组织提取的染色体基因组DNA-基因组DNA文库 mRNA反转录成的cDNA拷贝-cDNA文库 用于基因克隆的DNA材料的选择：如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列的结构直接推导出来； 如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列，
4、有关这类的信息就只能从染色体基因组DNA中获得。,限制性内切酶,克隆、转化、培养、鉴定,基因组DNA,基因文库,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,1)基因组文库 (Genomic library) ：,是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。其目 的是分离有用的目的基因 和保存某种生物的全部基因。,2)cDNA文库 (cDNA library) ：,是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组
5、，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。cDNA(complementary DNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。,第一节 基因组DNA文库的构建,一、基因组DNA文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。,二、基因组DNA文库的质量标准,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利
6、克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选,三、基因组DNA文库构建的程序,载体DNA的制备；高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的制备；高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；重组克隆的挑选和保存。,基因组DNA文库,限制性内切酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,四、原核生物基因组DNA文库的构建,（一）原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA 要求：制备的DNA的长度为100-200kb， 防止在制备过程中的机械断裂,（二）基因组DNA的不完全酶切,1、根据实验需要
7、选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/10242、分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因： 10 kb b) 克隆基因族： 20kb3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量,DNA的不完全酶切,（三）酶切片段与克隆载体连接,、酶切片段的分离与纯化）低熔点琼脂糖回收目的片段）试剂盒回收目的片段,2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择,a）质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效的范围为10kb) b）载体可承载25kb DNA左右片段(
8、有效的范围为15 kb) c）Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段(有效的范围为平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收2平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段3加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收,二、全长cDNA文库,基因组DNA文库,cDNA文库,二、基因组DNA文库与cDNA文库的比较,基因组DNA文库,cDNA文库,1 基因组DNA文库的优点,相对于cDNA文库，基因组文库的优点：cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列， cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA
9、的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。,2 cDNA文库的主要优点,cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。cDNA文库的筛选比较简单易行。每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。cDNA文库可用于在细菌中能进行表
10、达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。,3 cDNA克隆的主要的缺点,cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。,第三节 基因文库的筛选与鉴定,重组体(recombinant，转化子transformant
11、)： 就是掺入或导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。,1 表型筛选法(1)抗药性筛选:这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。,一、基因文库的筛选,(2)插入失活筛选法 经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子，也含有不需要的非重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。,抗药性标记选择(插入失活法),(3)显色反应选择法(-互补法) 将含有-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融为一
12、体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-D-硫代半乳糖苷)的培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为-互补。, 互补的检测或-半乳糖苷酶法,PCR筛选法 利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR，通过对PCR产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。,3 菌落原位杂交法 （colony in situ hybridization）,1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根据检测重组子DNA分子的核酸杂交技术原理，对Southern印迹技术作了一些修改，提出了菌落原位杂
13、交技术。,4 免疫筛选法,放射性抗体检测法,滤膜（固定抗体）,+,免疫沉淀检测法,菌落,沉淀素,二、基因文库的鉴定,限制性核酸内切酶分析 当载体与外源基因进行连接时，都需要对其进行酶切，而且这些内切酶都是已知的，因此可以从初步筛选出来的阳性重组菌中提取质粒DNA，然后用已知的内切酶进行酶切，酶切进行琼脂糖凝胶电泳，如果出现与预知的大小一致的电泳片段，就证明已经有目的基因插入到载体中。,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,PCR扩增片段,表达质粒pXETA1酶切电泳结果1.DNA/EcoRI+HindMarkers；2.pET-28b(+)/BamHI+H
14、ind；3.pKMA100/BamH+Hind； 4.pXETA1/BamH+Hind；5.pXETA1； 6.pXETA1 plasmid.,毒素基因,2 Southern Blotting 这种方法是E.M.Southern于1975年建立的，它是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法，经常用于对原位杂交所得到的阳性克隆进一步分析，这种方法包括两部分内容： 将DNA的限制性核酸内切酶的酶切片段从琼脂糖凝胶上转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上； 用各种标记的DNA探针同固定在膜上的DNA片段杂交，经放射自显影或其它显色方法确定出与探针互补的电泳带。,3 DNA序列测定法,本章重点掌握的内容,目的基因的概念基因文库的概念及构建基因文库的基本程序基因组文库的概念及操作步骤cDNA文库的概念及操作步骤基因组DNA文库与cDNA文库的优缺点,