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1、基因工程（2）PCR技术及其应用2020年空中课堂 高二生物学Polymerase Chain Reaction，PCR聚合酶链式反应Kray Mullis，1944-2019因发明PCR技术，于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR诞生的理论基础：DNA的半保留复制。细胞内复制过程：解旋-子链延伸-复旋PCR的条件在进行PCR的操作时，科研人员需要向试管中加入：目的基因分子，引物，dNTP，缓冲液，热稳定DNA聚合酶，并在高温条件下进行操作。由细胞内DNA复制的过程推测，这些材料分别充当了DNA复制过程中的哪些条件？PCR的条件1. DNA复制需要解旋，细胞中这一过程如何实现？在试管中如何实现？
2、细胞中，DNA的解旋由DNA解旋酶催化完成。在试管中，可以通过加热断开氢键完成解旋。所需温度一般为90-95。PCR的条件2. 催化DNA子链合成的酶是哪一种酶？PCR反应过程需要较高的温度，所使用的酶需要具有什么样的特点？催化DNA合成的是DNA聚合酶。该酶由中国科学家钱嘉韵于黄石公园热泉微生物中分离得到，70条件下反应2h活性残余90%。PCR过程中，需要热稳定DNA聚合酶（Taq酶）催化完成。PCR的条件3. DNA聚合酶的特点：在已有核苷酸链的3端添加单个核苷酸。据此推测，PCR还需要提供什么样的条件？根据目的基因两条链 端的碱基序列，设计并添加相应引物。两种引物序列往往既不相同，也不
3、互补。PCR过程中，需要提供一小段已有核苷酸链，我们称为引物。3请同学们思考，子链的延伸方向是什么？自身的535端3端4. 细胞内DNA复制利用 提供能量，并以 作为原料。PCR过程中，利用dATP、dTTP、dCTP、dGTP同时提供原料和能量。统称为dNTP。d代表脱氧核糖，dATP：脱氧腺苷三磷酸。PCR的条件ATP脱氧核苷酸PCR的条件5. 利用PCR复制DNA的过程中，所需要的模板是什么？目的基因的双链作为复制的模板。6. 适宜的PH值和液体环境：试管内加入缓冲液。 胞内复制PCR反应解旋在 酶作用下，细胞提供，双链 解开加热至 ，双链解开，不需要 酶特点酶复制次数相同点都需要 ，都
4、需要在一定的 中进行，都遵循。DNA解旋ATP部分90-95DNA解旋边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增DNA解旋酶，DNA聚合酶热稳定DNA聚合酶细胞自身控制一般30多次模板原料与能量引物液体环境碱基互补配对原则小结：胞内DNA复制与PCR的异同例题1：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，其基本原理和过程与细胞内DNA的复制类似。下列不是两者共同点的是边解旋边复制 遵循碱基互补配对原则需要引物 反应条件需要高温A B C DDPCR的过程加热解旋（90-95） 冷却，引物结合（55-60）升温，合成子链（70-75）1个循环变性-退火-延伸观看视频，跟随视频画出前三个循环的过程，并思
5、考：PCR的过程几轮循环后会出现只有目的基因片段的DNA分子？理论上讲，N个循环后，会出现多少个DNA片段？资料PCR的过程几轮循环后会出现只有目的基因片段的DNA分子？理论上讲，N个循环后，会出现多少个DNA片段？3轮循环后会出现只有目的基因片段的DNA分子。产物的计算公式：2N例题2：请为下列目的基因选择引物序列，并标出子链延伸的方向。引物2：引物3：例题3：PCR过程一般经历下述三十多次循环：95下使模板DNA变性、解链55下复性（引物与DNA模板链结合）72下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述，不正确的是A变性破坏的是碱基对之间的氢键B引物与DNA模板链的结合
6、依靠碱基互补配对原则完成C延伸需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸DPCR与胞内复制相比所需酶的最适温度较高CPCR的应用电泳：DNA分子在电场作用下发生迁移，一段时间后停止通电，越小的DNA片段距离出发点越远。片段相同的DNA分子会停留在相同的条带，因此可以鉴别PCR的产物是否为目的基因。（1）凝胶电泳法检测PCR的产物1.以DNA扩增为基础的应用PCR的应用1.Marker：标准大小的DNA分子1 2 3 4 5 62：目的基因6：清水3-5：不同循环次数的PCR产物1.以DNA扩增为基础的应用（2）在刑侦学中，只要能获取痕量DNA，就可以应用PCR技术，大量扩增，结合凝胶电泳，判断个
7、体之间的亲缘关系。法医及刑侦学也被形象地划分为“没有PCR的时代”和“有PCR的时代。”谁是凶手？PCR的应用相信同学们都看过电影侏罗纪公园。影片中科学家通过琥珀中保存的少量恐龙血液，扩增DNA，复制了恐龙。在电影上映的同一个月，Nature杂志发表了利用PCR技术扩增1亿年琥珀化石中象鼻虫DNA并进行基因测序的论文。这种手段有助于我们进一步了解进化史上各物种间的亲缘关系，为扩展和修正进化树提供了可信的依据。可以相信，假以时日，PCR也会成为保护珍稀动物的有力手段。（3）协助诊断RT-PCR：逆转录PCRreverse transcription PCR利用提取的样本RNA分子逆转录后进行PC
8、R扩增。例题4：研究者用PCR技术获得一个亨廷顿氏舞蹈症（HD，常染色体显性遗传病，随年龄增长发病，人群中罕见）家族部分成员IT15基因中的CAG重复序列片段，通过检测确定不同个体该基因的差异。检测结果如图2所示，据此结果推测1 _（有/无）出现HD症状的可能，依据是_ _。有1与患者基因型一样，带有致病基因PCR的应用（3）协助诊断荧光定量PCR：可以定量分析样本中的模板分子数量。加入特定荧光探针，每一轮循环都释放带荧光的报告基团。通过检测荧光强度的增长情况，可知模板中DNA分子数。乙肝是我国重要的传染病之一，由乙肝病毒引起。目前，检测患者是否感染乙肝病毒，及感染程度，主要有抗体检测法和荧光
9、定量PCR法。此外，流行性感冒、艾滋病等多种病毒感染性疾病，也都可以通过这种方法进行有效的诊断，为后续治疗提供依据。例题5：肾上腺-脑白质营养不良是一种伴X染色体的隐性遗传病（用d表示），图1为某患者家系图。首先提取四名女性与此基因有关的DNA片段并进行PCR，产物酶切后进行电泳（正常基因含一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点），结果如图2。（1）其中II-2的基因型是 。XdY（2）科研人员提取家系中四名女性的DNA片段并进行PCR，产物酶切后进行电泳（正常基因含一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点）。首先提取四名女性与此基因有关的DNA片段并进行PCR，产物酶切后进行电泳（
10、正常基因含一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点），结果如图2。由图可知突变基因新增的酶切位点位于 （310bp/217bp/118bp/93bp）DNA片段中。310bp（3）已知女性细胞所含两条X染色体中的一条总是保持固缩状态而失活，推测失活染色体上的基因无法表达的原因是 。固缩状态染色体无法正常解旋转录分别提取四名女性的mRNA作为模板， 进行PCR，计算产物量的比例，结果如表1。逆转录综合图2与表1，推断II-3、II-4发病的原因是来自 （父方/母方）的X染色体失活概率较高，以 基因表达为主。父方XdPCR的应用2.PCR是Sanger测序法的重要环节第一步：扩增足够待测样本，
11、加热解旋，保留单链作为模板链。第二步：模板链结合引物后，分别加入4个试管。第三步：每个试管中分别加入足量DNA聚合酶、四种dNTP和一种特定的ddNTP（双脱氧核糖核苷酸）。第四步：在进行DNA扩增时，一旦ddNTP与模板链发生互补结合，子链延伸就停止了，因此得到长度不同的扩增产物。将产物进行电泳，按从下向上的顺序读取，即可完成测序。例题6：科学家把一段T-DNA插入到A基因中，从而诱发突变，获得a基因，用PCR法确定T-DNA插入位置时，应从图1中选择的引物组合是 。 3.应用特定引物，进行基因定位，PCR的应用例题7：用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物、，其连接部位如
12、左下图所示，x为不能与模板链引物结合部位互补配对的序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段应是右下图中的dPCR的应用 4.在已有基因上增加片段PCR的应用 5.应用PCR技术进行基因敲除或增加基因例题8：为研究基因A与四膜虫对DDT的耐药性是否有关，科研人员提取耐药四膜虫个体的DNA，用下图所示的引物组合，分别扩增A基因的A1片段、A3片段。重叠延伸PCR第一轮XY53A1-X5335重叠延伸PCR第二轮：上一轮的产物分子作为本轮的引物N基因的a链N基因的b链A1+XA3+YN基因的a链N基因的b链3355重叠延伸PCR第三轮：上一轮的产物作为本轮的模板A3+YA1+XA3+YA1+X将大量N基因片段与扩增得到的A1片段、 A3片段置于PCR反应体系中进行扩增，得到的绝大多数扩增产物是_。回收的PCR扩增产物通过基因工程方法转入耐药四膜虫细胞中，并用加入_的培养液筛选，获得A基因_的四膜虫。A1-N-A3巴龙霉素被敲除PCR的应用 6.应用PCR技术诱导基因的定点突变小结PCR技术原理催生变性-退火-延伸过程扩增目的基因敲除或增加基因、转基因操作、诱发定点突变、基因测序等应用