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1、精选优质文档-倾情为你奉上第三章第10节肾活检组织标本的制作专心-专注-专业前 言 肾活检病理是诊断肾脏疾病的重要手段，许多疾病的命名主要源于肾活检组织学改变，如局灶节段性肾小球硬化和膜性肾病。肾活检病理诊断的正确性与肾组织标本制作质量关系密切，质量不过关（如切片不够薄，染色不清晰）将直接造成诊断错误，因此，应重视肾活检标本处理（取材、固定、包埋、切片到染色）的各个环节，以保证病理诊断的正确性。肾脏病理包括尸检和活检标本，对于肾脏疾病而言，主要是活检标本，本章主要介绍肾活检标本的处理。目前常规肾活检标本来源有两类：一类为切割式活检，一类为穿刺抽吸式活检，前者所取组织较多，但对肾脏损伤较大，不便
2、在临床推广，临床常采用穿刺抽吸式活检。一、肾组织取材 肾活检穿刺时病理技术员必须到场，以便对肾组织标本进行正确的处理，在技术员不能到场的情况下，必须按以下要求对标本处理者进行培训：处理穿刺所获组织应轻柔，避免牵拉或用力钳夹组织；分取组织时应在蜡板上进行，用锋利的刀片快速切割，避免用力挤压组织；尽量用含固定液（光镜或电镜）和生理盐水的专用镊子把分割好的组织块移入固定瓶内；用镊子时避免钳夹组织过度而造成组织受挤压；要求穿刺者尽量取两条组织。穿刺所获第一条含皮质组织送光镜检查，第二条组织在肉眼观察下进行分割，尽量切取皮质区1mm组织送电镜检查，余下组织送免疫荧光检查。如果穿刺仅获一条组织，所取组织有
3、三种情况（图3-10-1）：整条均为皮质，皮髓组织和皮-髓-皮质组织，髓质区血供丰富，颜色略红，皮质区组织略白，分布的红色小点是肾小球，根据穿刺获取不同组织的情况，如图3-10-1所示进行分取。也有人建议纵切后，一半送光镜检查，一半分割后分送免疫荧光和电镜检查，但存在组织太细，不易观察的缺点，临床较少使用。分送免疫荧光检查的组织用无菌的TRIS或PBS溶液浸湿的沙布轻轻包裹，置于培养皿中，避免直接置于冰块上，以免局部组织因冷冻收缩，造成结构破坏1,2。肾活检穿刺组织的分取图3-10-1 肾活检穿刺组织的分取LM：光镜；IF：免疫荧光；EM：电镜二、光镜标本的处理 （一）固定光镜标本的固定液有多
4、种。目前最常用的固定液为10%的中性福尔马林。中性福尔马林固定液的配方：甲醛（40%） 100 ml、蒸馏水 900 ml、磷酸二氢钠4 g、磷酸氢二钠 6.5 g，固定时间至少612 h。（二）前期处理1. 脱水 脱水的目的是去除固定和水洗后组织中的水分，便于后续的透明和浸蜡，常用的脱水剂是乙醇或丙酮，后者脱水能力比乙醇强，但对组织收缩较大，致使组织变脆，多用于快速脱水。为了彻底脱水，一般常规采用不同浓度梯度的乙醇进行脱水：70%乙醇 1020 min，2次；80%乙醇 1020 min，2次；90%乙醇 1020 min，2次；95%乙醇 1020 min，2次；无水乙醇 1020 min
5、，2次。2. 透明 透明的目的是便于石蜡包埋，因为组织脱水后，所用的脱水剂大多数不能和石蜡相混合，必须通过透明剂的作用才能浸蜡，所用的透明剂必须既能和脱水剂相混合，又能和石蜡相混合，起到桥梁作用，不但能提出脱水剂，又能代替脱水剂利于石蜡的浸入。当组织全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，故称为透明。透明剂都是石蜡溶剂，绝大多数都不能与水混合，最常用的透明剂包括二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油等。（1）二甲苯：是应用最广的一种透明剂，价格便宜，沸点为144C，折光率为1.497，易挥发，无色透明液体，易溶于乙醇又能溶解于石蜡，不能和水混合，透明力强，作用较快。最大
6、的缺点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能停留过久。通常在组织进入二甲苯以前先经过1/2纯乙醇和1/2的二甲苯的混合液。（2）甲苯：性质同二甲苯，沸点110.8C，价格亦较便宜，透明较慢，但优点是组织在其内停留1224 h也不变脆，故优于二甲苯。（3）氯仿：组织在其中浸存较久时收缩不明显，也不变脆。因为它的易挥发性，渗入组织的氯仿，高温时比二甲苯易挥发，是其优点。缺点是渗透力稍弱，比二甲苯和甲苯慢，故透明时间较二甲苯时间延长2-3倍。3. 浸透和包埋 组织经过脱水和透明后，要让石蜡等支持剂透入内部使组织变硬，并将组织包埋以利于切片，这个过程称为“浸透”和“包埋”。浸透的目的在于去除组织中的透
7、明剂而代之以石蜡，使石蜡渗入组织内部后把软组织变为有硬度的蜡块，便于切片。石蜡是最常用的包埋剂。使用优质石蜡能保证切片厚度，无刀痕。根据石蜡熔点不同，石蜡分为软蜡和硬蜡，软蜡熔点低，硬蜡熔点高。一般在室温高时用熔点高的蜡，室温较低时用熔点低的蜡。4. 切片 将蜡块修理成小梯形状，进行连续切片，常规切片厚度为2 mm，有条件可进行1.5 mm的连续切片。对于特殊染色，如刚果红则需厚度为5 mm的切片35。（三）染色肾组织标本既要观察细胞结构，又要观察基底膜病变，许多肾脏疾病与免疫复合物相关，因此肾活检标本除常规苏木素-伊红（Hematoxyln-Eosin，HE）染色，需要多种特殊染色如PAS（
8、periodic-acid schiff，PAS）、PASM（periodic acid-silver methenamine，PASM）和Masson三色染色等68。1. 苏木素-伊红染色法 HE染色法即常规染色法，主要显示各种组织正常成分和病变的一般形态结构，进行全面观察。目前关于病理组织学的基本知识，绝大部分都是基于对HE染色切片的观察。在HE染色上基本可以观察到各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复。（1）苏木素染液配制方法：将苏木素溶于乙醇，倾入明矾液中，混合后煮沸，加入氧化汞1 g，以玻棒搅匀，溶液呈深紫色，立即移入冷水中，使之冷却。静置过夜，过滤封闭保存，用前
9、若加5醋酸则染色较佳。配方为：苏木素 0.9g、醋酸 12 ml、氧化汞 0.51.0 g、蒸馏水 200 ml、纯乙醇 10 ml、甘油 20 ml、钾明矾 20 g。（2）伊红乙醇配制方法：将伊红乙醇溶解后，用滴管滴加醋酸使其呈糊状，加数毫升蒸馏水即可，过滤，将滤出的沉渣在烤箱中烤干，溶于95乙醇200ml中即可。配方为：伊红 1 g、蒸馏水10 ml、醋酸数滴。（3）染色过程：切片常规脱蜡入水；苏木素染色310 min；自来水充分冲洗35 min；0.5%1%的盐酸乙醇分化数秒钟；自来水冲洗15 min；弱碱性水溶液返蓝；自来水至蒸馏水冲洗510 min或更长；0.5%1%的伊红3 mi
10、n；乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。（4）染色结果：细胞核被苏木素染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，黏液呈灰蓝色。细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞质内嗜酸性细胞颗粒被染成反光强的鲜红色，胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色。高质量的HE染色细胞核与细胞质蓝红相映，且胞核鲜明，核膜、核仁及核染色质颗粒均清晰可见（图3-10-2）。图3-10-2 HE染色：细胞质呈红色，细胞核呈蓝色（400）2. PAS染色法 PAS染色法属于特殊染色，不仅能显示糖原，而且还能显示中性和某些酸性黏液性物质、软骨、脑垂体、霉菌、脂质、色素、淀粉样物质及基底膜。PAS的染色原理为：过碘酸是
11、一种氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的1, 2-乙二醇基，使之变为二醛；醛与Schiff氏试剂结合生成一种品红化合物，显现为红色。（1）Schiff氏液配制方法：将蒸馏水煮沸，冷至60，溶入碱性品红，冷却后过滤，至50时加盐酸，25时加偏重亚硫酸钠，黑暗中贮放过夜，加入活性碳，摇1 min后过滤，4暗色瓶中备用。配方为：碱性品红1 g、偏重亚硫酸钠2 g、1N盐酸20 ml、活性碳2 g、蒸馏水 200 ml。（2）染色过程：切片常规脱蜡入水；1%高碘酸氧化10 min，水洗；Schiff 氏液10 min，水洗；苏木素染核，盐酸分化，水洗；脱水，透明，封片。（3）染色结果：糖原、基底膜及其他
12、PAS阳性物质均呈红色，细胞核呈蓝色（表3-10-1）。肾小球基底膜、系膜基质、包曼囊壁、肾小管基底膜阳性，淀粉样物质弱阳性（图3-10-3）。3. PASM染色 组织中的粘多糖和蛋白质与银化合物结合后，再经过甲醛还原成为金属银，沉淀于组织内及表面，呈黑色，因此，这些物质又称为嗜银性物质（表3-10-2）。同时再套用Masson红复染，以显示免疫复合物的沉积。（1）六胺银液配制（用时现配，硝酸银在切片放入染缸前加入并摇匀）。配方为：预温蒸馏水 23ml、15六次甲基四胺 6ml、5硼砂 4.5 ml、冰醋酸 1.0 ml、磷钨酸 0.8g。PAS反应阳性物质物质种类举例物质染色结果多糖糖原强阳
13、性糖蛋白胶原纤维、网状纤维、血清白蛋白、球蛋白强阳性基底膜肾小球基底膜、肾小管基底膜、包曼囊壁中等强度淀粉样物质淀粉样物质弱阳性各种色素脂褐素中等强度软骨 软骨强阳性霉菌曲菌强阳性表3-10-1 PAS反应阳性物质图3-10-3 PAS染色：肾小球系膜区基质，肾小球毛细血管袢，包曼囊壁及肾小管基底膜呈粉红色，细胞核呈蓝色（400）（2）染色过程：切片常规脱蜡入水；3%的碘溶于100ml30%的乙醇，配制成碘乙醇，5 min脱汞，水洗；5%硫代硫酸钠5 min脱碘，水洗；1%高碘酸氧化20 min，水洗；六胺银液45 min（根据光镜下染色结果确定染色时间），水洗；3%硫代硫酸钠5 min，水洗
14、；Masson红复染；快速脱水，透明，封片。（3）染色结果：肾小球基底膜、包曼囊壁、肾小管基底膜呈黑色，免疫复合物为红色（图3-10-4），本染色对观察肾小球基底膜病变，免疫复合物的沉积非常重要，是肾活检必不可少的染色。*图3-10-4 PASM染色：肾小球基底膜及包囊壁呈黑色，免疫复合物呈红色，可见内皮下（所示）、上皮侧（所示）和系膜区（*所示）嗜复红物沉积（1000）4. Masson三色染色 用多种（3种以上）颜色显示多种组织（结缔组织）成分，用于判定各种组织、器官的病变与修复情况，以不同色调显示与区分某些非结缔组织及物质成分。（1）Masson红染液配制方法：变色酸2R 0.6g、蒸馏
15、水 100 ml、亮绿0.3 g、冰醋酸 1.0 ml、磷钨酸 0.8 g。（2）染色过程：切片常规脱蜡入水；苏木素染核5 min，盐酸分化，水洗；Masson红30 秒，水洗；0.5%亮绿30秒；快速脱水，透明，封片。（3）染色结果：胶原纤维呈绿色，免疫复合物呈红色，纤维素呈红色（图3-10-5，表3-10-3）。*g图3-10-5 Masson三色染色：肾小球基底膜，包囊壁呈蓝色，免疫复合物呈红色，可见内皮下（所示）、上皮侧（所示）和系膜区（*所示）（400）5. 刚果红染色 刚果红是一种分子为长线状的偶氮染色剂，以胺基和淀粉样物质的羟基结合，平行的附着在淀粉样纤维上，从而使淀粉样物质被染
16、成橙红色。（1）刚果红染液配制方法：1NaOH 0.3 ml、80乙醇氯化钠刚果红饱和溶液 30 ml。PASM染色反应阳性物质物质种类染色结果各种基底膜：肾小球基底膜、包曼囊壁和肾小管基底膜强阳性：黑色系膜基质强阳性：黑色免疫复合物红色淀粉样物质不嗜银表3-10-2 PASM染色反应阳性物质Masson三色染色反应阳性物质物质种类染色结果各种基底膜：肾小球基底膜、包曼囊壁和肾小管基底膜强阳性：蓝绿色系膜基质强阳性：蓝绿色免疫复合物红色淀粉样物质淡染的蓝绿色胶原及纤维组织蓝绿色表3-10-3 Masson三色染色反应阳性物质（2）染色过程：切片常规脱蜡入水（切片厚度5 mm）；苏木素染核，分化
17、，水洗；碱性刚果红液20 min；快速脱水，透明，封片。（3）染色结果：淀粉样物质呈橙红色，细胞核呈蓝色（图3-10-6a）。6. 高锰酸钾-碱性刚果红染色 步骤同刚果红染色，在染刚果红之前，用高锰酸钾处理后，AA型淀粉样物质被降解，再行刚果红染色，不着色，为阴性，以区分AA型和非AA型淀粉样变性。（1）染色过程：切片常规脱蜡入水（切片厚度5 mm）；高锰酸钾-硫酸液3 min，水洗；5%草酸漂白3 min，水洗；苏木素染核，分化，水洗；碱性刚果红液20 min；快速脱水，透明，封片。（2）染色结果：淀粉样物质呈橙红色，细胞核呈蓝色（图3-10-6b）。（四）各种染色过程注意事项常规脱蜡要彻底
18、；每次染色前双层滤纸过滤苏木素；Schiff氏液要4C保存；PASM-Masson染色标本缸要干净、无水滴，切片要求90C烤30 min，显微镜下控制染色深浅；刚果红染色切片厚度要求5 mm。ab图3-10-6 a：刚果红染色，肾小球系膜区，部分肾小管基底膜呈砖红色（400）；b：高锰酸钾刚果红染色，经高锰酸钾处理后，非AA型淀粉样变性刚果红染色仍阳性（400）三、免疫病理标本的制作3, 4 免疫病理所采用的标本可用石蜡和冰冻切片，冰冻切片的肾组织新鲜，抗原保存好，并能在70C冰箱保存使用。石蜡切片的制备同光镜标本。下面主要介绍冰冻切片的制备。（一）冰冻标本的制备肾活检取材用于制备冰冻切片的标
19、本，应放在预先用TRIS或PBS溶液湿润的干净纱布上，连同纱布放入清洁的玻璃小瓶或培养皿中，迅速放入冰桶中送实验室进行冰冻切片，避免直接放于冰块上，以免局部组织冻坏。也可采用速冻方法进行准备。组织速冻方法分液氮法和干冰-丙酮法。液氮法：将肾活检后切取组织放入预先准备好的小容器中，缓慢放入液氮中，待组织接触液氮开始气化后，组织迅速冷冻形成冰块，取出后在液氮中送实验室进行冰冻切片，如不及时切片，也可放入液氮中或70C冰箱中保存。干冰-丙酮法：准备好内放有OCT（Optimal cutting temperature，OCT）包埋剂的标本盒，将组织块完全浸没即可。向装有干冰的保温杯内加入丙酮，调成糊
20、状，将标本盒放入干冰中，待包埋剂变成白色冻块时，取出保存或切片同液氮法。进行组织速冻时须注意，组织不能直接放入液氮，以免组织膨胀破碎，速冻用的包埋剂应适量，新鲜组织不能缓慢冷却，否则形成冰晶，造成组织结构破坏，冷冻后的组织应密封保存，否则会失水，组织块复温时，应在37C加温速融，不能自然复温，否则造成组织结构破坏9。（二）冰冻切片将肾组织置于恒温冷冻切片机的冷冻头上，加少许OCT进行包埋，在20C下进行连续切片，切片厚度为34 m，一般切取20张，用于常规免疫病理（包括免疫荧光法和免疫组织化学法）及放入20C冰箱备用。（三）免疫荧光法1. 直接法 用荧光素标记的抗体与肾组织直接作用，在荧光显微
21、镜下观察，以达到检测目的（图3-10-7）。常用于直接法检测的荧光抗体包括：抗IgG、IgA、IgM、C3、C4和C1q抗体10。具体步骤：冰冻切片用10%小牛血清封闭（PBS稀释）；去除多余液体，加稀释好的抗体，避光，湿盒内室温孵育40 min；流水冲洗，置75%乙醇1 min，无水乙醇1 min，吹干；甘油封片，荧光显微镜观察。免疫荧光直接法和间接法示意图直接法间接法荧光标记抗体荧光标记第二抗体第一抗体组织切片图3-10-7免疫荧光直接法和间接法示意图2. 间接法 用特异性抗体（一抗，未标记荧光）与肾组织结合形成抗原-抗体复合物，再用针对一抗的标记荧光素的二抗与上述抗原-抗体复合物结合，形
22、成抗原-抗体-抗抗体复合物，发出荧光，在荧光显微镜下观察。间接法较直接法敏感510倍，而且只需一种标记的荧光抗体（图3-10-8）。常用间接法检测的荧光抗体包括免疫球蛋白轻链，载脂蛋白A、E（Apo A,Apo E），乙肝抗原，肾组织IV型胶原等10。具体步骤：冰冻切片如已干燥，可直接染色（如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干）；10%小牛血清封闭（PBS稀释）；去除多余液体，加稀释好的抗体后，避光，室温1.5 h；PBS冲洗3次；加荧光标记的第二抗体，避光，置室温40 min，水洗；吹干，甘油封片，荧光显微镜观察结果。ab图3-10-8a：直接法，IgG沿肾小球毛细血管袢分布；b：间接法，
23、肾小球毛细血管袢内Apo E阳性（四）免疫酶标技术免疫酶标技术（immunoenzymatic technique）是指用酶标记抗体或酶标记抗抗体进行的抗原抗体反应，其原理及操作程序与免疫荧光技术基本相似，差别在于用酶代替荧光素作为标记物，并以底物被酶分解后的显色深浅来反映组织中抗原或抗体的含量及位置，常用的酶为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidese，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatese，AKP），常用的显色剂 有DAB（3,3-二氨基联苯胺）和AEC（3-氨基-9-乙基卡巴唑），前者为棕色（图3-10-9a），可长期保存，后者为红色（图3-10
24、-9b），易于褪色。免疫酶技术用于正常和病理组织中，称为酶免疫组织化学技术。优点为：可用普通光学显微镜观察，酶标记抗体染色后，标本还可用其他染料复染，以显示细胞形态或细胞核，标本可长期保存。最常用的是过氧化物酶-抗过氧化物酶法，简称PAP法，此外还有生物素和亲和素（ABC）法。免疫酶标技术分为间接法和直接法，其原理同免疫荧光直接法和间接法12。下面分别介绍其步骤。ab图3-10-9免疫酶标染色a：胰岛Amylin染色，DAB显色为棕色；b：肾组织Cytokeratin染色，AEC显色为红色1. 直接法 标本固定，冰冻切片已干燥，可直接染色（如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干），石蜡切片脱蜡
25、、入水；PBS洗涤23 min； 3.1 H2O2（或1 H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温1020 min；正常血清（1 : 10）孵育，室温20 min；滴加酶标记的抗体371 h或4过夜；PBS洗涤33 min；DABH2O2显色510 min，镜下控制染色结果。DABH2O2应用前15 min配制；充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。2. 间接法 标本固定，冰冻切片已干燥，可直接染色（如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干），石蜡切片脱蜡、入水；PBS洗涤23 min；1H2O2（或1H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温1020 min；正常血清（1 : 10）孵育，室
26、温20 min；滴加第一抗体，371 h或4过夜；PBS洗涤33 min；滴加酶标二抗，室温1 h；PBS洗涤33 min；0.04DAB0.03 H2O2显色510 min；充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。3. 单PAP法 标定固定后，PBS洗涤；1H2O2（或1H2O2 甲醇）阻断内源性过氧化物，室温1020 min；PBS洗涤23 min；正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温20 min；滴加一抗，室温1 h或4过夜；PBS洗涤33 min；滴加二抗，室温30 min；PBS洗涤33 min；加PAP复合物，室温60 min；PBS洗涤33 min；0.04DAB0.03 H2
27、O2显色510 min（图3-10-9）；充分水洗； 苏木素复染，封片观察。4. PAP四层法（图3-10-10）：同单PAP法；二次加酶标二抗；PBS冲洗；二次加PAP；PBS冲洗；0.04DAB0.03 H2O2显色510 min；苏木素复染核，封片，镜检。5. 生物素和亲和素法（ABC法） 标定固定后，PBS洗涤；1H2O2（或1H2O2 甲醇）阻断内源性过氧化物，室温1020 min；PBS洗涤23 min；正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温20 min；滴加一抗，室温1 h或4过夜；PBS洗涤33 min；滴加二抗，室温30 min；PBS洗涤33 min；加ABC液，室温60 m
28、in；PBS洗；0.04DAB0.03 H2O2显色510 min（图3-10-11）；充分水洗；苏木素复染核，封片，镜检。过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物四层法图3-10-10 过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物四层法生物素和亲和素法（ABC法）图3-10-11 生物素和亲和素法（ABC法）四、电镜标本的制备 许多肾脏疾病必须依靠电子显微镜观察肾小球基底膜、电子致密物的沉积部位，沉积物的特点以及细胞器等超微结构的变化来明确诊断。电镜标本的制作过程与石蜡切片相似，也包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节1215。而与石蜡切片不同的是，电镜标本的制备操作过程更为细致与复杂，要
29、求更为严格，而且所用的试剂及配方也不尽相同。（一）取材取材是电镜标本制备的第一个关键环节。取材是否正确与制备出来的样品能否符合观察要求直接相关。由于生物体内代谢非常迅速，生物组织离体后，细胞将会释放出各种水解酶引起细胞自溶，细胞内部发生微细的结构变化。这些微细的改变在光镜下也许无法察觉，在电镜下则会呈现为明显的变化。因此，取材应注意以下几点：在冷板上分离切取组织，动作应迅速，尽快使组织浸入4C固定液中，从而最大程度地保存组织在生活状态时的结构；组织块大小不超过1 mm3； 取样时所用的器具必须干净，刀、剪等必须锋利，在操作时尽量避免拉、锯、压等动作对组织细胞造成的机械损伤；肾活检超微结构观察主
30、要是肾小球，应取肾皮质部位的组织，含肾小球13个，因组织块不能太大，应取34块，以避免未取到肾小球，影响观察。（二）固定、脱水和包埋固定是制样过程中最关键的一步。它的失败将导致整个制样过程的后续步骤完全无效。固定是终止组织细胞的生化过程，同时把它们的超微结构改变控制在最小范围内，并保护这些结构在后续的脱水、包埋等过程中不被破坏。可供选择使用的固定剂种类和固定方法及方式很多，它们各自有其优缺点。判断固定良好的标准见表3-10-4。目前肾活检组织常用的固定方法是化学固定法，浸泡方式固定，采用戊二醛和四氧化锇双重固定。1. 常用的固定剂和包埋剂（1）戊二醛（glutaraldehyde）：戊二醛是一
31、种五碳醛，含有两个醛基。分子式为C5H8O2，分子量为100。电镜固定通常采用电镜专用的25戊二醛水溶液稀释成需要的浓度。其pH为4.05.0。氧气、高温、中性或碱性pH均能使戊二醛发生聚合失去醛基，并降低交联效力，所以平时这种原液应在低温保存。此外，戊二醛存放时间过长时，pH值会降低，颜色变黄，固定效力也大大降低，若戊二醛pH值降至3.5以下或含有其他杂质时，必须纯化后才能使用。戊二醛对皮肤有硬化作用，但它的挥发性较甲醛弱，最好能在通风橱中操作。 戊二醛优点：在固定剂中它与蛋白质的交联能力最好，也能固定糖原和核酸，对细胞内的微管和一些酶的活性保存较好，是保存精细结构最好的醛；反应速度快，是优
32、良的前固定剂，渗透速度比四氧化锇快；能弥补四氧化锇的不足，对糖原、核酸，尤其是对微管、内质网和细胞基质固定效果较好；戊二醛前固定的样品不易变脆，可以长时间固定（但最好不要超过1个星期），因而适用于远离实验室或野外现场取材。但戊二醛在稀释溶液中会自行发生一系列反应，因而固定液应尽可能新鲜配制，配制好的固定液和戊二醛前固定后的样品应在4下储存。戊二醛的缺点：它不能固定脂质，致其在以后的脱水过程中被有机溶剂溶去，不宜作单独的固定剂使用。无法提供高反差，需与四氧化锇同时进行前后固定，相互弥补不足。戊二醛固定不影响细胞的渗透性，对缓冲液和渗透压要求较高。（2）四氧化锇（Osmium tetroxide）
33、：四氧化锇是一种很强的氧化剂，呈浅黄色结晶，其分子式OsO4，分子量254，熔点41，沸点131，饱和水溶液的浓度为7.24（25），它的水溶液为中性，有极大毒性。商品化产品有密封的四氧化锇晶体和2%的四氧化锇水溶液两种。四氧化锇晶体溶于水的速度很慢，必要时可以使用超声波设备来加速溶解。配制好的2四氧化锇水溶液使用方便，较常使用。但要特别注意的是无论是四氧化锇晶体还是水溶液都会挥发出四氧化锇气体，即使在0时也有四氧化锇气体释放，因此，应将四氧化锇置于密闭容器（玻璃容器）中保存。四氧化锇气体对呼吸系统有刺激，对眼睛有严重的破坏作用，因此，在使用时应特别小心，尽可能在通风橱中进行，并且严格控制用量
34、。废弃的四氧化锇溶液应加入乙醇水溶液或硫酸亚铁溶液，使四氧化锇转化为黑色沉淀，以降低毒性，方便收集处理。判断电镜标本固定良好的标准部位标准细胞膜低倍下呈完整清晰的单层结构，高倍下见双层结构核膜内外膜完整，基本平行，可见核孔线粒体饱满，外膜完整光滑，内嵴连续，内、外膜间保持一定距离，没有肿胀或收缩粗面内质网内质网池完整，膜上核糖体可辨，没有脱落或丢失滑面内质网呈分枝小管状或泡状，膜完整高尔基复合体扁平囊成堆叠排列，膜完整核内含物核仁、核液及染色质保存完好，并层次清楚可辨糖原颗粒致密，保存良好，没有丢失细胞质基质呈精细颗粒状，分布均匀，未见明显的空白区表3-10-4判断电镜标本固定良好的标准四氧化
35、锇固定剂的优点： 四氧化锇可以与脂类、糖类和蛋白质反应。对脂类的固定作用可以补充醛类固定剂对脂类固定不足的缺点；能增加膜的反差，起到电子染色作用，使被固定的样品图像有较好的反差。 四氧化锇会破坏大部分细胞膜的半透膜特性，配制四氧化锇固定液对缓冲液的要求不高 。四氧化锇的缺点： 四氧化锇渗透力弱，要求组织块要小，否则组织内部自溶过程继续进行，引起组织块内部固定不好。 不能保存糖原，也不能有效固定核酸，而且对微管固定效果也不理想。四氧化锇能与乙醇或醛类起氧化-还原反应，生成沉淀。所以，醛类处理过的样品转入四氧化锇固定前或四氧化锇固定后转入乙醇溶液脱水前都必须用相应的缓冲液充分漂洗干净。四氧化锇具有
36、挥发性，对黏膜有毒性作用。（3）Epon812包埋剂：Epon812是目前国际上普遍采用的一种优良包埋剂，一种长链的脂肪族环氧化合物，黏度为150210cP（在25）。该包埋剂的配制方法很多，但一般都按1961年Luft提出的配方进行。其配方如下：A液：Epon812 62 ml、DDSA（十二烷基琥珀酸酐） 100 ml；B液：Epon812 100 ml、MNA（甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐）89 ml。改变A液和B液的比例则可调节聚合块硬度，A液多则软，B液多则硬。通常冬天时A : B=2 : 8；夏天时A : B=1 : 9，可视组织的硬度和气候不同调节其比例。2. 组织处理过程 将活
37、检标本切为0.51 mm3左右的小块，放入4C 的2%4%的戊二醛固定液，或者2%的多聚甲醛+2%或2.5%的戊二醛混合固定液中，4下固定24 h或更长。4下用0.1 mmol/L的磷酸盐缓冲液充分漂洗组织一昼夜，中间换液5-8次，最好每12 h换液1次。4下用临时配制的1%锇酸固定液再固定1.52 h。0.1 mmol/L的磷酸盐组缓冲液充分漂洗组织10 min，再用丙酮或乙醇逐级（一般30%、50%、70%、90%）脱水，每级1015 min，但纯丙酮或纯乙醇中脱水2030 min共 2次。将脱水后的标本移入包理剂（已预先配好）与纯丙酮1：1的配制液中浸透30 min以上，再移入2 : 1
38、的配制液中3 h，入纯包理剂3 h 。预先烤干的2号药用胶囊（内放标本号）注入包埋剂八成满，再放样品于胶囊中央，待样品沉到胶囊底部后移入烤箱，371224 h，4512 h，601224 h聚合。3. 修块与定位 在进行超薄切片前，首先必须对包埋块进行修整。修块的目的便于连续切片。修整可以用双面或单面刀片手工修整，将已聚合好的树脂包埋块放入专用的样品夹中，在解剖显微镜下用单面刀片修去顶端和多余的包埋介质，把要观察的部分修成锥体，并将顶端的平面修成边界明显的平整梯形或方形。由于超微结构观察的部位很小，为了便于寻找要观察的部位，超薄切片前要进行定位。将修好的包埋块置于超薄切片或修块机上进行半薄切片
39、（0.52 mm）。半薄切片的观察须借助染色，染色前不必去除包埋剂，常用的染色方法有1%的甲苯胺蓝染液、姬姆萨染液、或甲基蓝-碱性复红。甲苯胺蓝染色的具体步骤如下：0.5-1mm半薄切片捞于载玻片上，0.5-1%的甲苯胺蓝水溶液置于50-60C温箱内浸染5分钟，蒸馏水稍洗，中性树脂封片，镜下观察。根据定位结果，肾活检主要观察肾小球，进一步修好包埋块，保留12个肾小球，或所需观察的肾小管间质或其他部位，把其他部分削去后进行超薄切片。在此需要强调，甲苯胺蓝染色除用于半薄切片的定位，在Fabry病的诊断中具有重要意义，可见足细胞胞浆中甲苯胺蓝染色阳性的颗粒状物质，少数见于肾小管上皮细胞、动脉及管周毛
40、细血管内皮细胞胞浆中（图3-10-12）。图3-10-12 甲苯胺蓝染色，足细胞胞质内见阳性颗粒（400）4. 超薄切片 在超薄切片机上用玻璃刀或钻石刀进行超薄切片，厚度为7090 nm。再用预先覆有支持膜或无支持膜的铜网、镍网捞取超薄切片晾干，以备染色。5. 超薄切片染色 电镜所用的光源是电子束，电镜图像的反差是样品中不同物质对电子束不同散射能力差异所形成的。散射的电子数越多，图像越暗，反之，散射的电子数越少，图像越亮。超薄切片染色是利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使细胞内不同结构对电子束的散射能力不同，从而造成反差。目前常用的为铀和铅双重染色，先染铀再染铅，具体染色方法有多种。
41、传统的醋酸铀-柠檬酸铅双染法具体步骤如下：在预先制作好的蜡板上滴加醋酸铀染液，将捞有切片的铜网覆于染液上1530 min，期间加盖，放于暗处。用双蒸水冲洗、吸干。从醋酸铀染液中取出铜网，用双蒸水冲洗、吸干。在蜡板上放置少许氢氧化钠固体，在其旁边滴加柠檬酸铅染液。注意避免柠檬酸铅染液与氢氧化钠固体接触。把载有切片的铜网覆于染液上510 min。注意放置铜网时不要对着柠檬酸铅染液呼气，且尽快放置好铜网并加盖。当需要染色的铜网数量较多时，可以在一块干净的橡胶上切割数条短裂缝，把铜网逐个直立夹在裂缝中，并将橡胶放置于干净的培养皿中，将醋酸铀染液小心地滴在铜网贴有切片的一面，使其充分接触，1530 mi
42、n后，将橡胶取出。用双蒸水冲洗，将铜网上的水吸干。充分干燥后，将染色好的铜网放入透射电子显微镜中观察（图3-10-13）。五、免疫电镜技术 免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法。主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而提示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入亚细胞的水平。本章主要介绍后者。（一）取材和固定为了既能将抗原准确定位
43、甚至定量，又能观察到近似于生理状态下的细胞超微结构，必须选择合适的固定剂，取组织块时做到越快越好。常用的固定方式有以下两种。灌注固定：效果最好，能够很好保存超微结构。但只适用于动物实验，不适宜人肾活检标本。 浸没固定：将手术、肾活检取材或灌注后切成的标本块浸没在固定液中固定，组织块浸没固定时间常为25 h，游离细胞固定0.51 h。目前常用的固定剂有：4%多聚甲醛、1.5%2%戊二醛、1%多聚甲醛1%戊二醛、4%多聚甲醛0.5%苦味酸0.25%戊二醛、96%乙醇1%醋酸。不论采用何种固定剂，使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。确定固定剂的种类、浓度、温度、pH值及固定时间等以达到最佳固定
44、效果。（二）包埋剂的选择免疫电镜的包埋剂类型包括环氧树脂包埋剂和低温包埋剂。根据免疫标记的时间不同，应选择不同的包埋剂。ab图3-10-13肾组织超薄切片铀-铅双重染色a：肾小球基底膜内皮下及系膜区大量团块高密度电子致密物分布；b：正常线粒体包埋前免疫标记：对已固定的样品先进行免疫标记，然后进行包埋、超薄切片并观察，一般选用环氧树脂包埋剂。环氧树脂具疏水性，在包埋前样品必须先完全脱水，然后在温箱中热聚合。热聚合会使大多数抗原变性，因此，该包埋剂不适用于包埋后免疫标记。 包埋后免疫标记：指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学标记的方法，此方法多用低温包埋剂，如Lowicryl
45、系列包埋剂、LR White包埋剂和LRGold包埋剂。这3种包埋剂均能在低温下（35-80）用紫外光（波长315360 nm）进行聚合，避免高温对抗原性的负面影响，提高了阳性标记率，而且对胶体金的非特异性吸附少，对温度敏感的抗原应选择使用低温包埋剂。（三）免疫标记及染色根据免疫标记与标本包埋之间的不同关系，分为包埋前免疫标记、包埋后免疫标记和不用包埋的冷冻超薄切片免疫标记。根据具体的标本、抗原的部位及性质并结合实验室的具体条件选择适当的方法。三者均包括非特异性位点的封闭、抗体与抗原特异性结合的免疫反应、反应部位的示踪显示等基本步骤。包埋前免疫标记主要用于细胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脱水剂和树脂成分溶解和变性的抗原检测。包埋后免疫标记具有超微结构保存较好、方法简便可靠、阳性结果重复性好的优点，并可对同一组织块的连续切片做各种对照免疫标记，能十分准确地解释免疫标记结果，而且还能在同一张切片上进行多重免疫标记，尤其适合于颗粒性标记物（胶体金标记）的免疫化学定位标记，是目前应用最广的免疫电镜技术。但是该方法也有明显的缺点，抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏，且抗原被树脂遮盖，不易与抗体接触，使免疫标记的阳性率下降。尤其是后固定剂锇酸对抗原的破坏较严重，限制了在临床应用。包埋前和