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1、精选优质文档-倾情为你奉上碱性磷酸酶Km值得测定【实验目的】1. 了解磷酸酶Km值的测定原理和方法；2. 掌握磷酸酶活性测定的原理和方法；【实验原理】1. 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度S增大而增加，但底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，即最大反应速度（Vmax）。反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：2. 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的额衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。其反应如下：【实验器材与试剂】器材：试管架，试管，移液管，移液枪，恒
2、温水浴箱，721型分光光度计试剂：0.02mol/L底物液，pH=10碳酸缓冲液，蒸馏水，酶液，碱性溶液，4-氨基安替比林，铁氰化钾【实验步骤】试剂 1 2 3 4 5 6 7 空白 0.02mol/L 0.05 0.10 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 0.00底物液 pH= 10 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90碳酸缓冲液蒸馏水 0.95 0.90 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 1.00混合水浴37，预温5分钟酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 （0.5mg/ml） 加入酶
3、液后立即混匀，37水浴保温，反应开始。并开始计时，反应时间为15 min碱性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 4 -氨基安 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 替比林铁氰化钾 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2. 0 2.0 混匀，室温放置10min左右，以空白管调零，测定各管的吸光度（A510）时间 步骤 现象 分析15 :50 配好底物混合液 无明显现象 并开始预热15: 55 预热结束并加入酶液 无明显现象 水浴15min 16: 07 水浴结束，依次加入 1-5号管红黄 生成酚类 碱性溶液等试剂，混 颜色依
4、次加深 衍生物， 匀，置于室温下10min 6,7管颜色不深 6,7号管反 应未完全16: 17 测定各管吸光度【实验结果记录与处理】试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8A510 0.030 0.053 0.097 0.158 0.232 0.119 0.128 0.0 数据处理试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8底物浓度0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10 0mmol/L1/S 2 1 0.5 0.25 0.167 0.125 0.10 0 1/A510 33.33 18.87 10.31 6.33 4.31 8.40 7.81 0以1/S为横轴，1/A510为纵轴作
5、图：【计算】根据y = 15.071x + 3.3668，当y=0时，x=-0.2234，继而Km=2.61mmol/L【实践与思考】1.底物浓度变化对酶促反应速度可造成什么样的影响？ 在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。2.Km值在酶动力学研究中有什么意义？不同的酶Km值不同,同一种酶与不同底物反应Km值也不同,Km
6、值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大,表明亲和力小；Km值小,表明亲合力大.【注意事项】1. 计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。2. 各管温度的时间一致。分子筛层析（凝胶过滤法）【实验目的】1. 掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理；2. 学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。【实验原理】1.凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体，它们的内部有很细微的多孔网状结构。2.在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流
7、出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。3.本实验采用葡聚糖凝胶G-25，以水为洗脱溶剂，层析分离大分子蓝葡聚糖（M200万）和小分子黄色重铬酸钾（M=294）。【实验仪器与试剂】仪器：层析柱，试管架，铁架台，试管，小烧杯，胶头滴管试剂：葡聚糖凝胶，蓝色葡聚糖，黄色重铬酸钾，蒸馏水【实验步骤】时间 步骤 现象 分析 打开柱的下口让水逐渐流出待到 床面上只留下极薄的一层水时 夹住出口管 用胶头滴管吸取混合液，小心地 将35滴此样品垂直加到凝胶床的表面上 注意加样时勿将床面凝胶冲起，亦不要沿 柱壁滴加样品，因为这样样品易从柱壁与 凝胶床之间漏下 打开出口管，待样品全部进入床后，关闭 绿色混
8、合液集聚在 柱的下口，加入3cm水后，再打开柱的下 胶体上 罚，加水进行扩展洗脱 混合液缓慢分离 大分子较快 加蒸馏水洗脱，用小量筒收集洗脱液 上方为黄色，下方 通过胶体 小 为蓝色 分子较慢 保持水位，直到分离结束【实验结果】123456789101112131415-+-161718192021222324252627282930-+-【曲线图】颜色深浅 蓝色 黄色 10 20 试管编号【实验讨论】1. 通过盐析法可将一些目的蛋白质沉淀下来，为了除去蛋白质中的盐离子，常采用Sephadex G-25 分子筛层析法脱盐；2. 操作中应该注意的问题1) 柱子要细，要长，越细越长越好，流速会变慢
9、，时间会延长，因需要而异2) 缓冲液一定要选好，常用的有磷酸，Tris-Hcl，Tris-甘氨酸，醋酸等。凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。3) 控制凝胶的流速，凝胶层析，流速一般不是很快，一般0.51ml/min，但也不能太慢，因为太慢有扩散现象，峰会很宽。应保证凝胶能充分的沉淀且分布的较均匀。4) 装柱时注意柱压，柱压过大时填料会塌陷。5) 样品的浓度和加样量的多少是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随 之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%2%，制备用量一般为柱床体积的20%30%。专心-专注-专业