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1、精选优质文档-倾情为你奉上蛋白质工程复习题名词解释结构域：生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，特别指中这样的区域基因突变：分子发生的突然的、可遗传的变异现象融合蛋白：将两个或多个开放阅读框按一定序列顺序连接，融合阅读框表达出一杂合蛋白。蛋白的表达模式:蛋白质的分子设计：构型：是一个分子中原子的特定空间排布。构型改变必须有共价键的断裂和重新形成。最基本的分子构型为L-型和 D-型，这种异构体在化学上可以分离。构象：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布。构象改变,无共价键的断裂和重新形成，化学上难于区分和分离-氨基酸：原核表达：是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达
2、载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达蛋白质的二级结构：在一段连续的肽单位中具有同一相对取向，可以用相同的构象角来表征，构成一种特征的多肽链线性组合。结构域：二级结构和结构模体以特定的方式组合连接，在蛋白质分子中形成2个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域。蛋白质的三级结构：结构域在三维空间中以专一的方式组合排布,或者二级结构、结构模体及其与之相关联的各种环肽链在空间中的进一步协同盘曲、折叠，形成包括主链、侧链在内的专一排布。蛋白质分子的四级结构：指蛋白质分子的亚基结构（subunit），亚基的数目、类型、空间排布方式和亚基间相互作用的性质，构成四级结构的基本
3、内容。亚基：许多蛋白质作为完整的活性分子，是由两条以上的多肽链组成，它们各自以独特的一级、二级、三级结构相互以非共价作用联结，共同构成完整的蛋白质分子，这些肽链单位称为亚基。其聚合整体称为寡聚体蛋白质的分子设计：从蛋白质分子水平上通过数据库等大量实验数据，结合现代的理论方法通过计算机设计新的分子。分子伴侣：一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份启动子：由核苷酸组成，本身并不控制基因活动而是通过与转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的增强子：能强化转录起始的一段DNA序列为增强子
4、或强化子乳糖操纵子：是参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。双特异性抗体：是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分蛋白质工程：以蛋白质分子的结构与功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。抗体酶：一类具有催化能力的。 简答题一简述蛋白质工程研究的基本途径。1.1 蛋白质结构分析（研究核心） 1）收集大量的蛋白质分子结构的信息；2）建立结构与功能之间关系的数据；3）蛋白质结构与功能之
5、间关系的理论研究。主要技术：晶体学技术（x射线晶体结构分析）、多维核磁共振波谱技术1.2 结构预测 对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能；根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构 。主要技术： 分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。 1.3 创造和改造蛋白质 1）物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等 2）生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、
6、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等 3）基因重组技术或人工合成DNA：可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质 。二欲使目的蛋白在大肠杆菌中表达，则表达载体的一般特点是什么？1）复制起始点 2）选择性基因 3）强的、可诱导的启动子 4）强的转录终止序列 5）核糖体结合位点 6）合适的多克隆位点三简述X射线晶体衍射技术测定蛋白质晶体结构的具体步骤。培养大的、质量好的晶体； 进行初步的x射线衍射分析； 重原子衍生物的制备； 衍射数据的测量和处理； 相位的计算； 电子密度图的计算和解释； 分子模型的修正。四列举两种常见蛋白质晶体结构测定方法及讨论其优缺点。晶体
7、结构：X射线 优点：能快速、精细、直观地表达出分子内各基团的相互空间关系 缺点：不是所有的生物大分子都能够获得良好的结晶；所得到的晶体往往是分子处于基态,而分子功能的行使多发生在激发态，很难捕捉到分子的功能状态 溶液结构：核磁共振（NMR） 优点：是对X-射线晶体衍射的补充，分辨率仅次于X-射线晶体技术，可以在溶液中操作，接近生理状态 缺点：蛋白质的分子量要比较小，一般在50KD以下，分子量越大所测到的谱线就越多，有时各谱线很难分辨。五简述蛋白质在生物体内的形成的过程蛋白质在体内的形成分为两个阶段：第一阶段：在遗传密码指导下，将氨基酸按特定序列在核糖体上连接起来，形成只有一级结构（氨基酸序列）
8、的多肽链，称为多肽链的生物合成。第二阶段：合成的多肽链，以现在尚不清楚的机制自动折叠成为特定的三维结构，形成具有完整结构和功能的蛋白质分子，称为新生肽链折叠（或蛋白质折叠）六蛋白质分子设计的步骤是什么？1）建立所研究蛋白质的结构模型2）找出对所要求的性质有重要影响位置3）悬着一系列的在2）中所选出的位点上改变残基所得到的突变体，一方面使蛋白质可能具有所要求的性质，另一方面又尽量维持原有结构，使其不做大的变动4）预测突变体的结构5）定性或定量计算优化所得到的突变体结构是否具有所要求的性质。 七简述目的蛋白原核表达的基本步骤。（1）、制备表达载体：酶切, 去磷酸化；胶回收纯化（2）、制备目的DNA
9、：质粒纯化/PCR； 酶切；胶回收纯化（3）、将目的DNA 克隆到载体上：目的片断与载体连接、转化非表达型宿主菌、筛选阳性克隆: 菌落PCR, 质粒提取酶,测序确定阅读框（4）、转化表达宿主菌：转化带有T7RNA 聚合酶基因的菌株（5）、诱导优化表达目的蛋白：检测质粒稳定性、确定表达时间和温度的最佳条件、分析蛋白溶解性和活性、SDS-PAGE, Western 印迹等确定目的蛋白（6）、纯化目的蛋白：放大培养、制备粗提物、亲和纯化、切除融合标签并去除蛋白酶八蛋白质分子设计的步骤是什么？ 1. 建立所研究蛋白质的结构模型；2. 找出对所要求的性质有重要影响的位置；3. 选择一系列的在（2）中所选
10、出位点上改变残基所得到的突变体；4. 预测突变体的结构；5. 定性或定量计算优化所得到的突变体结构是否具有所要求的性质。九简述大肠杆菌中表达体系的优缺点?大肠杆菌中表达体系的优点:大肠杆菌表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。利用大肠杆菌作为表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养，特别是高密度发酵；外源基因经常可以达到高效表达。大肠杆菌表达体系的缺点:大肠杆菌系统最大的不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；而广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。大肠杆菌体
11、系的另一个不足之处是外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，有时不能得到足够的产物。 酶工程复习资料 酶的定向进化：模拟自然进化过程(随机突变+自然选择)，在体外对酶基因进行人工随机突变，建立突变基因库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有预先期望的具有某些特性的酶的突变体的技术过程。酶反应器：用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在
12、酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。超临界流体：指温度和压力超过某物质超临界点的流体盐析：在盐浓度达到一定界限时，酶的溶解度随盐的浓度升高而降低。必需水：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。离子液体：由有机阳离子与有机阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低，稳定性好酶的定义：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。离心分离：借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。酶的分类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶提高
13、酶产量的措施 ：添加诱导物（酶的作用底物、酶的催化反应产物、作用底物的类似物）、控制阻遏物的浓度（产物阻遏作用、分解代谢物阻遏作用）、添加表面活性剂、添加产酶促进剂酶的生产方法：提取分离法、生物合成、化学合成培养基的五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水酶生物合成的模式分为4种类型：同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型酶生物合成模式：同步合成型，中期合成型，延续合成型，滞后合成型离心机的分类及选择 低速离心机：主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机：用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。超速离心机：用于DNA、RNA、蛋白质等
14、生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。易错PCR技术 原理：从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。 优点：简便，随机突变丰富；缺点：正突变率低，突变基因文库大，筛选工作量大；适用于较小基因的定向进化酶固定化 概念：采用各种方法，将酶固定在水不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程称为酶的固定化。固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。方法：吸附法、包埋法、交联法、热处理法应用：运用于工业化生产、酶传感器、酶电极 问答题一如何提高酶的产量?答：a
15、、添加诱导物：对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。 b、控制阻遏物的浓度：阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。 c、添加表面活性剂：表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。 d、添加产酶促进剂：产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。二细胞破碎的方法及原理。 a、机械破碎法
16、：捣碎法，研磨法，匀浆法。原理：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎； b、物理破碎法：温度差破碎法，压力差破碎法，超声波破碎法。原理：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎； c、化学破碎法：添加有机溶剂（甲苯、丙酮、丁醇、氯仿），添加表面活性剂。原理：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞破碎； d、酶促破碎法：自溶法，外加酶制剂法。原理：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎三酶分子修饰的意义、方法。概念：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。意义：提高酶的
17、活力；增强酶的稳定性 ；降低或消除酶的抗原性；研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响。方法：金属离子置换修饰：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。大分子结合修饰(共价/非共价)：非共价修饰：使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。共价修饰：用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。侧链基团修饰：采用一定的方法（一
18、般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。肽链有限水解修饰：酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)，利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。氨基酸置换修饰：现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。酶分子的物理修饰 ：通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。四酶的分离纯化有：离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等五酶的纯化
19、过程： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 均质打破细胞 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。 分离纯化路线：细胞破碎，提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，浓缩，干燥结晶。六离心分离，离心机的分类和选择。 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。离心机的分类：a、常速离心机：又称为低速
20、离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。b、高速离心机：最大转速为（12.5）104 r/min ，相对离心力达到 11041105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。c、超速离心机：最大转速达 (2.512)104 r/min，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分
21、子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。七酶非水相催化的类型。酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化。 a、有机介质中的酶催化 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。b 、气相介质中的酶催化酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。c、超临
22、界介质中的酶催化酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。d、离子液介质中的酶催化酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。 八简述细胞破碎的方法及其原理。分类细胞破碎方法细胞破碎原理机械破碎法捣碎法、研磨法、匀浆法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。物理破碎法温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，
23、而使细胞破碎。化学破碎法添加有机溶剂、添加表面活性剂通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。酶促破碎法自溶法、外加酶制剂法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。 九固定化酶与游离酶相比，有哪些优缺点？优点：（1）易将固定化酶和底物，产物分开产物溶液中没有酶的残留简化了提纯工艺（2）可以在较长的时间内连续使用（3）反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化（4）提高了酶的稳定性（5）较能适于多酶反应（6）酶的使用效率高、产率高、成本低 缺点：（1）固定化时酶的活力有损失（2）比较适应于水溶性底物（3）与完整的细胞相比，不适于多酶反应。十阐述酶工程的应
24、用并分别举例说明。酶工程主要应用在以下几个领域：1、发酵工艺：生产葡萄糖、生产氨基酸、生产核苷酸、生产生物柴油、生产抗生素、生产有机酸、甾体激素等；2、医药领域：疾病诊断方面应用：根据体液内酶活力的变化诊断疾病、用酶测定体液中某种物质的量诊断疾病等；疾病治疗方面的应用：生产蛋白酶、溶解酶、超氧化物歧化酶等；药物制造方面的应用：生产青霉素酰化酶、酪氨酸酶、核苷磷酸化酶等；3、分析检测：酶试纸、酶柱和酶管、酶传感器等的应用都有重大贡献；4、基础理论研究：阐明酶反应机制、生物工程中去除细胞壁等方面的应用；5、环境保护领域：环境监测、三废处理、生物脱墨等；6、其他方面：洗涤剂工业、酿酒工业、乳制品工业
25、、饼干、纺织工业、化妆品等工业中都有应用。十一写出四种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。1凝胶过滤：凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。2等电点沉淀：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，
26、分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。3吸附层析：利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。4盐析沉淀法：利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离。5离心分离：是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。6过滤：是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。专心-专注-专业