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1、选修3现代生物科技专题第1课基 因 工 程 考点一基因工程的工具考点一基因工程的工具 【必备知识速填必备知识速填】1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶( (简称限制酶简称限制酶):):(1)(1)来源来源: :主要是从主要是从_中分离纯化出来的。中分离纯化出来的。(2)(2)作用作用: :识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的_。(3)(3)作用结果作用结果: :原核生物原核生物磷酸二磷酸二酯键酯键2.DNA2.DNA连接酶连接酶: :(1)(1)作用作用: :将将DNADNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNADNA分子。分
2、子。(2)(2)常用常用类型类型E Ecolicoli DNA DNA连接酶连接酶T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶来源来源_T T4 4噬菌体噬菌体功能功能只只“缝合缝合”_“缝合缝合”黏性末端和平末端黏性末端和平末端, ,连接连接_末端的效率更高末端的效率更高结果结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_大肠杆菌大肠杆菌黏性末端黏性末端黏性黏性磷酸二酯键磷酸二酯键3.3.载体载体: :(1)(1)种类。种类。常用载体常用载体: :质粒质粒, ,为细菌拟核之外小型为细菌拟核之外小型_分子。分子。其他载体其他载体:_:_、动植物病毒等。、动植物病毒等。(2
3、)(2)特点和意义特点和意义特点特点意义意义稳定并能复制稳定并能复制使目的基因稳定存在并复制使目的基因稳定存在并复制有有_限制酶切割位点限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因可携带多个或多种外源基因具有特殊的具有特殊的_基因基因便于重组便于重组DNADNA的鉴定和选择的鉴定和选择环状环状DNADNA噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物一个至多个一个至多个标记标记(3)(3)作用作用: :作为作为_,_,携带外源携带外源DNADNA片段进入受体细胞。片段进入受体细胞。利用它在宿主细胞内对利用它在宿主细胞内对_进行大量复制。进行大量复制。运载工具运载工具目的基因目的基因【秒判正误秒判正误】1.1.限制酶只
4、能用于切割目的基因。限制酶只能用于切割目的基因。( )( )分析分析: :限制酶既能用于切割目的基因限制酶既能用于切割目的基因, ,也能用于切割载体也能用于切割载体, ,并且一般用同一种限并且一般用同一种限制酶切割目的基因和载体。制酶切割目的基因和载体。2.2.限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶、DNADNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。( )( )分析分析: :质粒是基因工程中常用的工具而不是工具酶。质粒是基因工程中常用的工具而不是工具酶。3.3.切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6 6个
5、核苷酸序列。个核苷酸序列。( )( )分析分析: :切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别核苷酸序列切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别核苷酸序列, ,但识别的但识别的核苷酸序列不一定是核苷酸序列不一定是6 6个。个。4.DNA4.DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。( )( )分析分析: :DNADNA连接酶的作用是将两个具有相同末端的连接酶的作用是将两个具有相同末端的DNADNA片段连接起来片段连接起来, ,把目的基把目的基因与载体黏性末端的磷酸与脱氧核糖连接成磷酸二酯键因与载体黏性末端的磷酸与脱氧核糖连接成磷酸二酯键, ,而不是将碱基对连接
6、而不是将碱基对连接起来。起来。5.5.E Ecolicoli DNA DNA连接酶既可连接平末端连接酶既可连接平末端, ,又可连接黏性末端。又可连接黏性末端。( )( )分析分析: :E EcolicoliDNADNA连接酶只能连接酶只能“缝合缝合”黏性末端。黏性末端。6.6.限制酶也可以识别和切割限制酶也可以识别和切割RNARNA。( )( )分析分析: :不能。限制酶又称限制性核酸内切酶不能。限制酶又称限制性核酸内切酶, ,专一对专一对DNADNA起作用。起作用。【重点难点讲透重点难点讲透】1.DNA1.DNA连接酶和限制酶的关系连接酶和限制酶的关系(1)(1)限制酶和限制酶和DNADNA
7、连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。(2)DNA(2)DNA连接酶起作用时连接酶起作用时, ,不需要模板。不需要模板。2.2.与与DNADNA有关的有关的4 4种酶比较种酶比较: :比较比较项目项目限制酶限制酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶解旋酶解旋酶作用作用底物底物DNADNA分子分子DNADNA分子分子片段片段脱氧脱氧核苷酸核苷酸DNADNA分子分子作用作用部位部位磷酸磷酸二酯键二酯键磷酸磷酸二酯键二酯键磷酸磷酸二酯键二酯键碱基对间碱基对间的氢键的氢键形成形成产物产物黏性末端黏性末端或平末端或平末端形成重组形成重组DNADNA分子分子新的新的D
8、NADNA分子分子形成单链形成单链DNADNA【教材命题源教材命题源】教材原文教材原文: :选修选修3 3_P5P5_图图1-41-4命题角度命题角度: :角度角度1.1.限制酶如何切割限制酶如何切割DNADNA分子分子? ?提示提示: :限制酶能够识别双链限制酶能够识别双链DNADNA分子的某种特定核苷酸序列分子的某种特定核苷酸序列, ,并且使每一条链中并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。如图所示之间的磷酸二酯键断开。如图所示: :EcoEcoRR限制酶识别限制酶识别的碱基序列是的碱基序列是GAATTC,GAATTC,切割位点在切割位点在G G和和A
9、 A之间之间, ,断开断开G G和和A A之间的磷酸二酯键。之间的磷酸二酯键。角度角度2.2.断开的断开的DNADNA分子怎么连接分子怎么连接? ?提示提示: :将切下来的将切下来的DNADNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNADNA分子分子, ,是靠是靠DNADNA连接酶来完成的。若是连接酶来完成的。若是黏性末端可用黏性末端可用E Ecolicoli DNA DNA连接酶和连接酶和T T4 4 DNA DNA连接酶连接连接酶连接, ,若是平末端可用若是平末端可用T T4 4 DNA DNA连接酶连接。连接酶连接。 【典例示范典例示范】下图中的图下图中的图1 1和图和图2 2分别表示的是分别表
10、示的是EcoEcoRR限制酶和限制酶和SmaSma限制酶的作用示意图限制酶的作用示意图, ,据图分析据图分析: :(1)(1)两类酶识别的碱基序列及切割的位点分别是两类酶识别的碱基序列及切割的位点分别是_和和_。(2)(2)若将图若将图1 1中的末端再连接起来中的末端再连接起来, ,则需要用哪类连接酶则需要用哪类连接酶? ?若连接图若连接图2 2的末端的末端, ,则则需要用哪类连接酶需要用哪类连接酶? ?【解析解析】(1)(1)限制酶的作用是识别双链限制酶的作用是识别双链DNADNA分子的某种特定核苷酸序列分子的某种特定核苷酸序列, ,并且使并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
11、断开。每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。EcoEcoR R限制酶识限制酶识别的碱基序列是别的碱基序列是GAATTC,GAATTC,切割位点在切割位点在G G和和A A之间之间; ;SmaSma限制酶识别的碱基序列是限制酶识别的碱基序列是CCCGGG,CCCGGG,切割位点在切割位点在G G和和C C之间。之间。(2)(2)连接图连接图1 1中的黏性末端既可用中的黏性末端既可用E Ecolicoli DNA DNA连接酶连接酶, ,也可用也可用T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶, ,连连接图接图2 2中平末端只能用中平末端只能用T T4 4 DNA DNA连接酶。连接酶。
12、答案答案: :(1)(1)EcoEcoR R限制酶识别的碱基序列是限制酶识别的碱基序列是GAATTC,GAATTC,切割位点在切割位点在G G和和A A之间之间SmaSma限制酶识别的碱基序列是限制酶识别的碱基序列是CCCGGG,CCCGGG,切割位点在切割位点在G G和和C C之间之间(2)(2)连接图连接图1 1用用E Ecolicoli DNA DNA连接酶或连接酶或T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶, ,连接图连接图2 2用用T T4 4 DNA DNA连接酶。连接酶。【素养新命题素养新命题】(1)(1)以上实例说明酶有何特性以上实例说明酶有何特性? ?为什么为什么?(?(科学思
13、维科学思维: :分析与综合分析与综合) )提示提示: :说明酶具有专一性。因为识别不同碱基序列的限制酶不同说明酶具有专一性。因为识别不同碱基序列的限制酶不同, ,切割位点切割位点不同。同样不同。同样, ,连接不同黏性末端需要的连接不同黏性末端需要的DNADNA连接酶不同。连接酶不同。(2)(2)为使载体与目的基因相连为使载体与目的基因相连, ,载体用载体用 E Ecolicoli 切割后切割后, ,含有目的基因的含有目的基因的DNADNA除除可用可用E Ecolicoli 切割外切割外, ,能否用另一种限制酶切割能否用另一种限制酶切割?(?(科学思维科学思维: :归纳与演绎归纳与演绎) )提示
14、提示: :可以。为使载体与目的基因相连可以。为使载体与目的基因相连, ,不同的限制酶只要切出相同的黏性末不同的限制酶只要切出相同的黏性末端即可。端即可。 【热考角度通关热考角度通关】角度一角度一 考查工具酶的应用考查工具酶的应用1.(20161.(2016全国卷全国卷)图图(a)(a)中的三个中的三个DNADNA片段上依次表示出了片段上依次表示出了EcoEcoRR、BamBamHH和和SauSau3A3A三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点, ,图图(b)(b)为某种表达载为某种表达载体的示意图体的示意图( (载体上的载体上的EcoEcoRR、Sau
15、Sau3A3A的切点是唯一的的切点是唯一的) )。 根据基因工程的有关知识根据基因工程的有关知识, ,回答下列问题回答下列问题: :(1)(1)经经BamBamHH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切酶切后的产物连接后的产物连接, ,理由是理由是_。 (2)(2)若某人利用图若某人利用图(b)(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子重组子, ,如图如图(c)(c)所示。这三种重组子中所示。这三种重组子中, ,不能在宿主细胞中表达目的基因产物不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有的
16、有_,_,不能表达的原因是不能表达的原因是_。 (3)DNA(3)DNA连接酶是将两个连接酶是将两个DNADNA片段连接起来的酶片段连接起来的酶, ,常见的有常见的有_和和_,_,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。【解析解析】本题主要考查限制性核酸内切酶和本题主要考查限制性核酸内切酶和DNADNA连接酶的作用及基因表达载体连接酶的作用及基因表达载体的构建。的构建。(1)(1)BamBamH H和和SauSau3A3A的共同识别序列是的共同识别序列是GATC,GATC,二者切割形成的黏性末端相二者切割形成的黏性末端相同同, ,可以被可以被DNADNA
17、连接酶连接。连接酶连接。(2)(2)在基因表达载体中在基因表达载体中, ,启动子应位于目的基因的前端启动子应位于目的基因的前端, ,终止子应位于目的基因终止子应位于目的基因的后端的后端, ,这样目的基因才能顺利地转录并完成翻译过程这样目的基因才能顺利地转录并完成翻译过程, ,即顺利表达即顺利表达, ,图中所示图中所示甲、丙均不符。甲、丙均不符。(3)(3)常见的常见的DNADNA连接酶有连接酶有T T4 4 DNA DNA连接酶和连接酶和E Ecolicoli DNA DNA连接酶连接酶,T,T4 4 DNA DNA连接酶既能连接酶既能连接黏性末端连接黏性末端, ,又能连接平末端。又能连接平末
18、端。答案答案: :(1)(1)SauSau3A3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游, ,丙中目的基因插入在终止子丙中目的基因插入在终止子的下游的下游, ,二者的目的基因均不能被转录二者的目的基因均不能被转录( (其他合理答案亦可其他合理答案亦可) )(3)(3)E Ecolicoli DNA DNA连接酶连接酶T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶 科学思维科学思维模型与建模模型与建模限制酶的选择方法限制酶的选择方法根据目
19、的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。(1)(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶应选择切点位于目的基因两端的限制酶, ,如图甲可选择如图甲可选择PstPst。(2)(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶不能选择切点位于目的基因内部的限制酶, ,如图甲不能选择如图甲不能选择SmaSma。(3)(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接, ,也可使用不同的限制酶切也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒割目的基因和质粒, ,如图甲也可选择用如图甲也可选择用PstPst和和EcoREcoR两种限制酶两种
20、限制酶( (但要确保质但要确保质粒上也有这两种酶的切点粒上也有这两种酶的切点) )。角度二角度二 考查载体的应用考查载体的应用2.(20162.(2016全国卷全国卷)某一质粒载体如图所示某一质粒载体如图所示, ,外源外源DNADNA插入插入AmpAmpr r或或TetTetr r中会导致中会导致相应的基因失活相应的基因失活( (AmpAmpr r表示氨苄青霉素抗性基因表示氨苄青霉素抗性基因, ,TetTetr r表示四环素抗性基因表示四环素抗性基因) )。有人将此质粒载体用有人将此质粒载体用BamBamHH酶切后酶切后, ,与用与用BamBamHH酶切获得的目的基因混合酶切获得的目的基因混合
21、, ,加加入入DNADNA连接酶进行连接反应连接酶进行连接反应, ,用得到的混合物直接转化大肠杆菌用得到的混合物直接转化大肠杆菌, ,结果大肠杆菌结果大肠杆菌有的未被转化有的未被转化, ,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种, ,分别是含有环状目的分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题列问题: :(1)(1)质粒载体作为基因工程的工具质粒载体作为基因工程的工具, ,应具备的基本条件有应具备的基本条件有_(_(答出两点即可答出两点即可) )。而作为
22、基因表达载体。而作为基因表达载体, ,除满足上述基本条件除满足上述基本条件外外, ,还需具有启动子和终止子。还需具有启动子和终止子。(2)(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选, ,在上述四种大肠杆菌细胞中在上述四种大肠杆菌细胞中, ,未未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的, ,其原因是其原因是_;_;并且并且_和和_的细胞也是不能区分的的细胞也是不能区分的, ,其原其原因是因是_。在上述筛选的。在上述筛选的基础上基础上, ,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落若要筛选含有插入了目的基
23、因的重组质粒的大肠杆菌单菌落, ,还需使还需使用含有用含有_的固体培养基。的固体培养基。(3)(3)基因工程中基因工程中, ,某些噬菌体经改造后可以作为载体某些噬菌体经改造后可以作为载体, ,其其DNADNA复制所需的原料来复制所需的原料来自自_。【解析解析】本题考查基因工程的相关知识。本题考查基因工程的相关知识。(1)(1)质粒被选用为基因工程的载体是因为质粒被选用为基因工程的载体是因为: :具有一个或多个限制酶切点具有一个或多个限制酶切点; ;具有自具有自我复制能力我复制能力; ;带有标记基因带有标记基因; ;对宿主细胞无害。对宿主细胞无害。(2)(2)未转化的和仅含环状目的基因的细胞都不
24、能在含有氨苄青霉素的培养基上未转化的和仅含环状目的基因的细胞都不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长生长, ,故这两种不可区分。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的故这两种不可区分。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长, ,这两种也不可区分。因目的基因这两种也不可区分。因目的基因插入位点在四环素抗性基因上插入位点在四环素抗性基因上, ,四环素抗性基因被破坏四环素抗性基因被破坏, ,在获得的单个菌落中在获得的单个菌落中各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上, ,不能生
25、长的为要筛选的菌落不能生长的为要筛选的菌落, ,即含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。即含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)(3)噬菌体营寄生生活噬菌体营寄生生活, ,能利用宿主细胞内的原料和场所进行自身能利用宿主细胞内的原料和场所进行自身DNADNA的复制和的复制和蛋白质的合成。蛋白质的合成。答案答案: :(1)(1)能自我复制、具有标记基因能自我复制、具有标记基因(2)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因二者均不含有氨苄青霉素抗性基因, ,在该培养基上均不生长含有质粒载在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒体含有插入了目的基因的重组质粒( (或含有重组质
26、粒或含有重组质粒) )二者均含有氨苄青二者均含有氨苄青霉素抗性基因霉素抗性基因, ,在该培养基上均能生长四环素在该培养基上均能生长四环素(3)(3)受体细胞受体细胞【知识拓展知识拓展】载体上标记基因及其作用原理载体上标记基因及其作用原理(1)(1)载体上的标记基因载体上的标记基因: :一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。(2)(2)作用原理作用原理: :当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后, ,抗性基因在受体抗性基因在受体细胞内表达
27、细胞内表达, ,使受体细胞能够抵抗相应抗生素使受体细胞能够抵抗相应抗生素, ,所以在受体细胞的培养体系中所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞, ,原理如图所示原理如图所示: :【加固训练加固训练】(2017(2017全国卷全国卷)真核生物基因中通常有内含子真核生物基因中通常有内含子, ,而原核生物基因中没有而原核生物基因中没有, ,原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNARNA序列的机制。已知在人序列的机制。已知在人体中基因体中基因A(A(有内含子有内含子) )可
28、以表达出某种特定蛋白可以表达出某种特定蛋白( (简称蛋白简称蛋白A)A)。回答下列问题。回答下列问题: :(1)(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因某同学从人的基因组文库中获得了基因A,A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白到蛋白A,A,其原因是其原因是_。(2)(2)若用家蚕作为表达基因若用家蚕作为表达基因A A的受体的受体, ,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中在噬菌体和昆虫病毒两种载体中, ,不选用不选用_作为载体作为载体, ,其原因是其原因是_。(3)(3)若要高效地获得蛋白若要高效地获得蛋白A,A,可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比可选用大肠杆菌作为受体
29、。因为与家蚕相比, ,大肠大肠杆菌具有杆菌具有_(_(答出两点即可答出两点即可) )等优点。等优点。(4)(4)若要检测基因若要检测基因A A是否翻译出蛋白是否翻译出蛋白A,A,可用的检测物质是可用的检测物质是_(_(填填“蛋白蛋白A A的基因的基因”或或“蛋白蛋白A A的抗体的抗体”) )。(5)(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNADNA是遗传物质做出了重要贡献是遗传物质做出了重要贡献, ,也可以说是基因工程的先导。如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供也可以说是基因工程的先导。如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示了启示, ,那么那
30、么, ,这一启示是这一启示是_。【解析解析】本题主要考查了基因工程的相关知识。本题主要考查了基因工程的相关知识。(1)(1)人体基因人体基因A A有内含子有内含子, ,将获得的基因将获得的基因A A导入大肠杆菌中导入大肠杆菌中, ,经过转录得到含有内经过转录得到含有内含子的含子的mRNA,mRNA,因为大肠杆菌没有真核生物所具有的切除内含子对应的因为大肠杆菌没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNARNA序列序列的机制。内含子部分对应的的机制。内含子部分对应的mRNAmRNA序列阻断了蛋白序列阻断了蛋白A A的合成。的合成。(2)(2)若用家蚕作为表达基因若用家蚕作为表达基因A A的受体的受体
31、, ,选用昆虫病毒作为载体选用昆虫病毒作为载体, ,不选用噬菌体作不选用噬菌体作载体的原因是噬菌体的宿主细胞是细菌载体的原因是噬菌体的宿主细胞是细菌, ,噬菌体不能侵染家蚕。噬菌体不能侵染家蚕。(3)(3)大肠杆菌是原核生物大肠杆菌是原核生物, ,原核生物作为受体细胞原核生物作为受体细胞, ,有以下优点有以下优点: :结构简单、繁结构简单、繁殖速度快、容易培养等。殖速度快、容易培养等。(4)(4)要检测基因要检测基因A A是否翻译出蛋白是否翻译出蛋白A,A,最准确的方法是利用蛋白最准确的方法是利用蛋白A A的抗体的抗体, ,因抗体因抗体具有特异性具有特异性, ,一种抗体只能与特定的蛋白质结合一
32、种抗体只能与特定的蛋白质结合, ,可根据蛋白可根据蛋白A A抗体的杂交情况抗体的杂交情况来判断是否合成了蛋白来判断是否合成了蛋白A A。(5)(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中将一种生物个体的艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中将一种生物个体的DNADNA转移到了另一转移到了另一种生物个体中种生物个体中, ,并表达合成了相应的蛋白质。并表达合成了相应的蛋白质。答案答案: :(1)(1)基因基因A A有内含子有内含子, ,在大肠杆菌中在大肠杆菌中, ,其初始转录产物中与内含子对应的其初始转录产物中与内含子对应的RNARNA序列不能被切除序列不能被切除, ,无法表达出蛋白无法表达出蛋白A A(2)
33、(2)噬菌体噬菌体的宿主是细菌噬菌体噬菌体的宿主是细菌, ,而而不是家蚕不是家蚕(3)(3)繁殖快繁殖快, ,容易培养容易培养(4)(4)蛋白蛋白A A的抗体的抗体(5)DNA(5)DNA可以从一种生物可以从一种生物个体转移到另一种生物个体个体转移到另一种生物个体考点二基因工程的基本操作程序考点二基因工程的基本操作程序 【必备知识速填必备知识速填】1.1.目的基因的获取目的基因的获取: :(1)(1)目的基因目的基因: :主要指主要指_的基因的基因, ,也可以是一些具有也可以是一些具有_作用的因子。作用的因子。(2)(2)获取目的基因的方法获取目的基因的方法编码蛋白质编码蛋白质调控调控2.2.
34、基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心: :(1)(1)目的目的: :使目的基因使目的基因_,_,同时同时, ,使目的基因能够表达和发挥作用。使目的基因能够表达和发挥作用。(2)(2)基因表达载体的组成及作用基因表达载体的组成及作用在受体细胞中稳定存在在受体细胞中稳定存在, ,并且可以遗传给下一代并且可以遗传给下一代(3)(3)构建过程构建过程3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞“三种类型三种类型”比较比较: :生物种类生物种类植物植物动物动物微生物微生物常用方法常用方法农杆菌转化法农杆菌转化法显微注射技术显微注射技术感受态细胞法感受态细胞法受体细胞受
35、体细胞_转化转化过程过程将目的基因插入将目的基因插入_上上农杆菌农杆菌导入植导入植物细胞物细胞整合到受整合到受体细胞体细胞_上上表达表达将含有目的基因的表达载将含有目的基因的表达载体体提纯提纯取卵取卵( (受精卵受精卵)_受精卵发育受精卵发育获得具有获得具有_的动物的动物CaCa2+2+处理细胞处理细胞_细胞细胞重组重组表达载体表达载体DNADNA分子与分子与_混合混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子体细胞或受精卵体细胞或受精卵受精卵受精卵原核细胞原核细胞TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA染色体的染色体的DNADNA显微注射显微注射新性状新性状感受态感受态感受态细胞感受态
36、细胞4.4.目的基因的检测与鉴定的目的基因的检测与鉴定的“两个水平两个水平”: :【秒判正误秒判正误】1.1.目的基因就是指编码蛋白质的基因。目的基因就是指编码蛋白质的基因。 ( )( )分析分析: :目的基因大多是编码蛋白质的基因目的基因大多是编码蛋白质的基因, ,少数是具有调控作用的因子少数是具有调控作用的因子, ,如启动如启动子、终止子等。子、终止子等。2.2.用用PCRPCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。方法扩增目的基因时需要设计两种引物。( )( )分析分析: :用用PCRPCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物方法扩增目的基因时需要设计两种引物, ,分别和目的基因两条单链分别
37、和目的基因两条单链的一端结合。的一端结合。3.3.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。( )( )4.4.检测目的基因是否成功表达可用抗原检测目的基因是否成功表达可用抗原抗体杂交技术。抗体杂交技术。( )( )分析分析: :目的基因成功表达的含义一般是指合成了特定的蛋白质目的基因成功表达的含义一般是指合成了特定的蛋白质, ,可以用特定的可以用特定的抗体进行抗原抗体进行抗原抗体杂交抗体杂交, ,检测是否出现杂交带。检测是否出现杂交带。5.5.应用应用DNADNA探针技术探针技术, ,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的
38、存在及其是可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达。否完成表达。( )( )分析分析: :应用应用DNADNA探针技术可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在以及探针技术可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在以及是否转录是否转录, ,但不能确定目的基因是否指导合成了抗冻蛋白。但不能确定目的基因是否指导合成了抗冻蛋白。【重点难点讲透重点难点讲透】1.1.基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心步骤核心步骤: :(1)(1)需要用到的工具需要用到的工具: :限制酶、限制酶、DNADNA连接酶、载体。连接酶、载体。(2)(2)基因表达载体组成包含目的基因、启动子、终止子、标记
39、基因等。基因表达载体组成包含目的基因、启动子、终止子、标记基因等。(3)(3)基因表达载体要能在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代基因表达载体要能在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代, ,还要能还要能表达和发挥作用。表达和发挥作用。(4)(4)启动子启动子(DNA(DNA片段片段)起始密码子起始密码子(RNA);(RNA);终止子终止子(DNA(DNA片段片段)终止密码子终止密码子(RNA)(RNA)。(5)(5)目的基因的插入位点不是随意的目的基因的插入位点不是随意的, ,基因表达需要启动子和终止子的调控基因表达需要启动子和终止子的调控, ,所所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部
40、位。以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位。(6)(6)构建基因表达载体一般用同种限制酶切割载体和目的基因。也可用两种限构建基因表达载体一般用同种限制酶切割载体和目的基因。也可用两种限制酶切割制酶切割, ,以避免质粒或目的基因自身连接。以避免质粒或目的基因自身连接。(7)(7)限制酶切割载体时不能破坏标记基因限制酶切割载体时不能破坏标记基因, ,以避免标记基因不能表达以避免标记基因不能表达, ,不能筛选不能筛选出含有目的基因的受体细胞。出含有目的基因的受体细胞。2.PCR2.PCR技术与技术与DNADNA复制比较复制比较: :体内体内DNADNA复制复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作
41、用下在解旋酶作用下, ,细胞提供细胞提供能量能量, ,部分解开部分解开加热至加热至90 90 以上以上, ,双链全部解双链全部解开开, ,不需要解旋酶不需要解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA可以是可以是RNARNA或单链或单链DNADNA分子片段分子片段合成合成子链子链在引物基础上在引物基础上, ,一条链连续一条链连续合成合成, ,另一条链不连续合成另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始分别从两条链的引物端开始, ,都都是连续合成是连续合成, ,控制温度控制温度72 72 特点特点边解旋边复制边解旋边复制, ,半保留复制半保留复制体外迅速扩增体外迅速扩增TaqTaq DNA DNA聚合
42、酶聚合酶不需要不需要需要需要相同点相同点生物体内的生物体内的DNADNA复制和复制和PCRPCR体外体外DNADNA扩增都需要模板、四种脱氧扩增都需要模板、四种脱氧核核苷酸苷酸, ,且都需要在一定的缓冲溶液中进行且都需要在一定的缓冲溶液中进行【教材命题源教材命题源】教材原文教材原文: :选修选修3 3_P11P11图图1-101-10。 命题角度命题角度: :角度角度1.1.构建基因表达载体的目的构建基因表达载体的目的? ?提示提示: :基因表达载体的构建是基因工程的核心基因表达载体的构建是基因工程的核心, ,目的是使目的基因在目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在受体细胞中稳定存在, ,并且可
43、以遗传给下一代并且可以遗传给下一代, ,同时同时, ,使目的基因能使目的基因能够表达和发挥作用。够表达和发挥作用。 角度角度2.2.一个完整的基因表达载体的组成一个完整的基因表达载体的组成? ?提示提示: :一个基因表达载体的组成一个基因表达载体的组成, ,除了目的基因外除了目的基因外, ,还必须有启动子还必须有启动子(promoter)(promoter)、终止子终止子(terminater)(terminater)以及标记基因等。以及标记基因等。角度角度3.3.如何构建基因表达载体如何构建基因表达载体? ?提示提示: :用同种限制酶切割目的基因和载体用同种限制酶切割目的基因和载体, ,获得
44、相同的黏性末端获得相同的黏性末端, ,然后用然后用DNADNA连连接酶连接目的基因和载体接酶连接目的基因和载体, ,得到的重组得到的重组DNADNA分子即为基因表达载体。分子即为基因表达载体。 【典例示范典例示范】(2018(2018全国卷全国卷)某种荧光蛋白某种荧光蛋白(GFP)(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光, ,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白蛋白(L1)(L1)基因连接在基因连接在GFPGFP基因的基因的55末端末端, ,获得了获得了L1
45、-GFPL1-GFP融合基因融合基因( (简称为甲简称为甲),),并将其插入质粒并将其插入质粒P0,P0,构建了真核表达载体构建了真核表达载体P1,P1,其部分结构和酶切位点的示意图其部分结构和酶切位点的示意图如下如下, ,图中图中E1E1E4E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题回答下列问题: :(1)(1)据图推断据图推断, ,该团队在将甲插入质粒该团队在将甲插入质粒P0P0时时, ,使用了两种限制酶使用了两种限制酶, ,这两种酶是这两种酶是_。使用这两种酶进行酶切是为了保证。使用这两种酶进行酶切是为了保证_,_,也是为了保也是为了保证证_。(
46、2)(2)将将P1P1转入体外培养的牛皮肤细胞后转入体外培养的牛皮肤细胞后, ,若在该细胞中观察到了绿色荧光若在该细胞中观察到了绿色荧光, ,则说则说明明L1L1基因在牛的皮肤细胞中完成了基因在牛的皮肤细胞中完成了_和和_过过程。程。(3)(3)为了获得含有甲的牛为了获得含有甲的牛, ,该团队需要做的工作包括该团队需要做的工作包括: :将能够产生绿色荧光细胞将能够产生绿色荧光细胞的的_移入牛的移入牛的_中、体外培养、胚胎中、体外培养、胚胎移植等。移植等。(4)(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中, ,某同学用某同学用PCRPCR方法进行鉴方
47、法进行鉴定定, ,在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的_(_(填填“mRNA”“mRNA”“总总RNA”RNA”或或“核核DNA”)DNA”)作为作为PCRPCR模板。模板。【解析解析】(1)(1)将甲插入质粒将甲插入质粒P0P0时时, ,为了保证甲为了保证甲(L1-GFP(L1-GFP融合基因融合基因) )的完整性的完整性, ,应该应该选择选择E1E1和和E4E4两种酶切割两种酶切割, ,并且把目的基因插入启动子和终止子之间并且把目的基因插入启动子和终止子之间, ,从而使其从而使其能在受体细胞中表达。能在受体细胞中表达。(2)(2)在牛皮肤细胞中观察到了绿
48、色荧光表明基因已表达在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光表明基因已表达, ,而基因的表达包括转而基因的表达包括转录和翻译两个过程。录和翻译两个过程。(3)(3)由由(4)(4)题意可知题意可知, ,获得含有获得含有L1-GFPL1-GFP融合基因融合基因( (甲甲) )的牛为克隆牛的牛为克隆牛, ,需要用核移需要用核移植技术植技术, ,即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入去核卵母细胞中。即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入去核卵母细胞中。(4)(4)检测甲是否存在于牛的不同组织细胞中检测甲是否存在于牛的不同组织细胞中, ,可以采用可以采用PCRPCR技术扩增技术扩增, ,再用再用DNADNA分分子杂
49、交技术来检测子杂交技术来检测,PCR,PCR技术中模板是技术中模板是DNA,DNA,并不是并不是RNARNA。答案答案: :(1)E1(1)E1和和E4E4甲的完整甲与载体正确连接甲的完整甲与载体正确连接(2)(2)转录翻译转录翻译(3)(3)细胞核去核卵母细胞细胞核去核卵母细胞(4)(4)核核DNADNA【素养新命题素养新命题】(1)(1)目的基因在受体细胞中正常表达需要基因表达载体具备哪些结构目的基因在受体细胞中正常表达需要基因表达载体具备哪些结构?(?(生命观生命观念念: :结构与功能观结构与功能观) )提示提示: :目的基因表达需要在目的基因前端有启动子目的基因表达需要在目的基因前端有
50、启动子, ,末端有终止子。末端有终止子。(2)(2)如何检测目的基因是否导入受体细胞如何检测目的基因是否导入受体细胞?(?(科学思维科学思维: :归纳与演绎归纳与演绎) )提示提示: :采用采用DNADNA分子杂交技术分子杂交技术, ,即将转基因生物的基因组即将转基因生物的基因组DNADNA提取出来提取出来, ,在含有目在含有目的基因的的基因的DNADNA片段上用放射性同位素等作标记片段上用放射性同位素等作标记, ,以此作为探针以此作为探针, ,使探针与基因组使探针与基因组DNA DNA 杂交杂交, ,如果显示出杂交带如果显示出杂交带, ,就表明目的基因已插入染色体就表明目的基因已插入染色体D