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1、精选优质文档-倾情为你奉上血液样品预处理的标准操作一、目的规范色谱分析中血液样品预处理的操作。二、职责1. 实验室分析测试人员对本规程的实施负责。2. 对于每一项具体的研究课题，具体的操作步骤应由实验室负责人负责制定，并由实验室分析测试人员严格实施。3. 实验室负责人负责对本规程的修订。三、血液样品预处理的标准操作1. 实验仪器与设备的准备1.1 试管 一般采用有盖子和刻度的尖底试管，要求密封性好，编号清楚准确，并摆放整齐。1.2 EP管 一般采用的规格有1ml、1.5ml、2 ml。要求密封性好，编号清楚准确，并摆放整齐。1.3 移液器 要求定量准确，重复性好。1.4 其它 涡流混合器、离心
2、机、真空泵、烧杯、量筒、记号笔、试管架、标签纸等。 2. 样品的均匀化 2.1 将装有血浆（血清）样品的EP管放置在冰箱冷藏室内，缓慢解冻为血浆（血清）溶液。2.2 然后取出放置至室温，置涡流混合器上混匀或往复振摇亦可到达均匀的目的。3. 液液提取 3.1 提取溶剂的准备 3.1.1 常用的溶剂有乙酸乙酯，乙醚，环己烷等。3.1.2 提取溶剂可以是一种也可以是几种溶剂的混合溶液，目的是调整提取溶液的剂性，既保证待测样品被充分萃取进入提取溶剂，同时又有很好的选择性。3.2 根据待测样品的需要用移液器（移液枪）定量吸取血浆（血清）至试管中。3.3 必要时调整血浆（血清）溶液的pH值，根据待测样品的
3、性质加入酸、碱或缓冲溶液，然后涡旋混匀。3.4 用移液器定量吸取提取溶液至装有血浆（血清）的试管中，盖好试管塞。3.5 溶液的混匀 涡流混匀 将试管置于涡流混合器上进行旋涡，并保证样品溶液旋涡充分混匀，旋涡时间一般为2-3分钟。3.6 样品的离心 将试管置于离心机中，分离过程中一般采用4000r/min。离心之前注意要平衡，加速时应注意缓慢逐步加速，以防加速过快试管炸裂，离心时间一般为10分钟。3.7 离心分离后试管中样品分为上下两层，用移液器吸取上层有机相，转移至另一试管中。3.8 溶剂的挥发 3.8.1 自然挥发 将样品溶液放置在室温下挥发，有时还可适当加热，加速溶液挥发。3.8.2 氮气
4、吹干 氮气流能防止发生氧化，为了加快挥散速度，将样品溶液置于氮气流下吹干。3.8.3 减压蒸发 在密闭容器内，通过抽真空以降低液体表面的压力，使其沸点降低，样品溶液很快挥发，减少了蒸发过程中样品与空气的接触，避免由此引起的分解等副反应，适于热不稳定的样品。3.9 样品的复溶 用于样品溶液残渣复溶的溶液通常采用流动相或其它有机溶剂。用移液器准确定量吸取，并且复溶样品应充分混合均匀。3.10 预处理样品的储存 预处理后的样品应保存在冰箱冷藏室，样品应竖直放置、排列整齐、编号准确清楚。待样品进样分析以前取出，以保证样品的稳定。3.11 乳化现象3.11.1防止乳化 可增加有机溶剂的体积，避免猛烈振摇
5、或加入适当的试剂改变其表面张力等方法防止乳化。3.11.2 破乳 若已发生严重的乳化现象，应采取适当的方法消除乳化。3.11.2.1 离心 可将试管置于离心机中离心消除乳化。3.11.2.2 冷冻 可将试管置于冰箱中冷冻消除乳化。3.11.2.3 加入电解质。3.11.2.4 加入适当的稀释液稀释。4. 去蛋白处理 4.1 有机溶剂的准备 甲醇与乙腈是反相液相色谱法中常用的蛋白沉淀剂，因为它们与流动相的组成相同。甲醇沉淀蛋白的优点是上清液清澈，沉淀为絮状易于分离；乙腈与之相反，产生细的蛋白沉淀，但沉淀效率较甲醇高。4.2 根据待测样品的需要用移液器定量吸取血浆（血清）至试管中，盖好试管塞。4.
6、3 必要时调整血浆（血清）溶液的pH值，根据待测样品的性质加入酸、碱或缓冲溶液。4.4 用移液器定量吸取有机溶液至装有血浆（血清）的试管中，盖好试管塞。4.5 溶液的混匀 有机溶剂使蛋白质变性而析出沉淀，从而把与蛋白质结合的药物解离出来。与此同时待测样品大部分被萃取进入有机溶剂。4.5.1涡流混匀 将试管置于涡流混合器上进行旋涡，并保证样品溶液旋涡充分混匀，旋涡时间一般为2-3分钟。4.5.2 摇床混匀 将试管置于摇床上往复振摇，振摇时间一般为5-10分钟。4.6 离心去除蛋白 将试管置于离心机中，分离过程中一般采用3000-4000r/min。离心之前注意要平衡，加速时应注意缓慢逐步加速，以
7、防加速过快试管炸裂，离心时间一般为15-20分钟。4.7 离心分离后变性蛋白质沉淀于试管底部，用移液器吸取上层有机溶液，转移至另一试管中。4.8 过滤 经过去蛋白处理后的样品溶液用0.45m的滤膜过滤。4.9 高速离心 将过滤后的样品溶液转移至EP管中，采用25000-30000 r/min。离心之前注意要平衡，加速时应注意缓慢逐步加速，以防加速过快试管炸裂，离心时间一般为5-10分钟。4.10经过以上处理后得到的样品溶液，如果待测物的浓度在定量限以上，而且溶剂对HPLC系统没有干扰，就可以直接进样分析。如果需要除去溶剂，即浓缩甚至干燥样品，方法同3.8-3.9。4.11 预处理样品的储存 预
8、处理后的样品应保存在冰箱冷藏室，样品应竖直放置、排列整齐、编号准确清楚。待样品进样分析以前取出，以保证样品的稳定。5. 固相萃取5.1 固相萃取柱的准备5.1.1 柱管 由血清级的聚丙烯制成（也有由玻璃制成的），一般为注射器性状。柱管下断有一突出的头，尺寸已标准化。5.1.2 烧结垫 聚乙烯是常见的烧结垫材料，对于特殊要求也可采用特氟隆或不锈钢片。5.1.3 SPE固定相 根据样品溶液的性质和组成选择不同类型和重量的固定相。SPE固定相最常见的是键合的硅胶材料，一般采用孔径60A不规则形状的40硅胶微粒作为原材料，然后将各种官能团键合上去。5.1.3.1 正相 CN、DIOL、Si、NH2等可
9、作为正相固定相，用来保留极性物质。5.1.3.2 反相 C18、C8、C2、CH、PH等可作为反相固定相，用来保留非极性物质。5.1.3.3 离子交换 5.2 固定相活化 5.2.1 净化固定相 将第一溶液加入到固定相，真空抽滤，倒掉洗脱液。用量约为1-2ml/100mg固定相。5.2.2 将终溶剂加入固定相，真空抽滤，倒掉洗脱液。用量约为1-2ml/100mg固定相,终溶剂应该与样品溶剂性质相似。5.2.3 在活化的过程中和结束时，固定相都不能抽干,因为这将导致填料床出现干裂，如果在活化步骤中出现干裂，所有活化步骤都要重做。5.3 根据待测样品的性质将酸、碱或缓冲溶液加入到血浆（血清）溶液中
10、，溶解稀释血浆（血清）溶液并且调整pH值。5.4 上样 将样品溶液加入到固相萃取柱，然后真空抽滤，使样品进入固定相，倒掉洗脱液。5.5 淋洗 样品中分析物得到保留后，将淋洗液加入到固相萃取柱进行淋洗，真空抽滤，倒掉淋洗液，以洗掉干扰组分。溶液体积可为0.50.8ml/100mg固定相。5.6 洗脱 将洗脱液加入到固相萃取柱进行洗脱，真空抽滤，并收集洗脱液。洗脱液一般为0.5-0.8ml/100mg固定相。5.7 经过以上处理后得到的洗脱液可以直接进样分析。如果需要除去溶剂，即浓缩甚至干燥样品，方法同3.8-3.9。5.8 预处理样品的储存 预处理后的样品应保存在冰箱冷藏室，样品应竖直放置、排列整齐、编号准确清楚。待样品进样分析以前取出，以保证样品的稳定。5.9 注意事项 5.9.1 在上样、淋洗、洗脱时注意溶剂极性的选择。可以是一种也可以是几种溶剂的混合溶液。5.9.2 溶剂的互溶性 后一种流过柱床的溶剂必须与前一溶剂互溶。如果使用互溶的溶剂有困难，就必须干燥柱床。干燥的方法是让氮气或空气通过柱床1015min；或把SPE在10001500r/min离心5min。专心-专注-专业