《β-catenin在bmsc参与hp慢性感染致胃癌发生中的作用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《β-catenin在bmsc参与hp慢性感染致胃癌发生中的作用.pdf（40页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、分类号学号M2 0 1 0 7 5 4 7 0学校代码1 0 4 8 7密级硕士学位论文硕士学位论文硕士学位论文硕士学位论文 - c ate n i n 在 BMS C 参与 H pH H H 慢性感染致胃癌发生中的作用学位申请人 ： 王园园学 科 专 业 ： 消化内科指 导 教 师 ： 朱良如 副教授蔺 蓉 副教授答 辩 日 期 ： 2013年 5 月A Di s s e r t a t i o n S ub mi t t e d i n P a r t i a l F ul f i l l me nt o ft he Re qu i r e me n t s f o r t he De g
2、 r e e o fMa s t e r o f me di c i n eTh e e f f e c t s o f - c a t e ni n i n B MS C pa r t i c i p a t e H pH H H c hr o ni ci n f e c t i o n i n d u c e d g a s t r i c c a nc e r sCa nd i d a t e : Yua ny u a n Wa ngMa j o r : G a s t r o e nt e r o l o g yG G GS up e r v i s o r : As s o c i
3、a t e P r o f . Li a ng Ru Zh uAs s o c i a t e P r o f . Ro n g Li nH u a z h o ngH H H Un i v e r s i t y o f S c i e n c e a nd Te c hno l o g yWu h a n, H u b e iH H H 4 3 0 0 7 4 , P . R. Ch i n aMa y , 2 0 1 3独创性声明独创性声明独创性声明独创性声明本人郑重声明 ， 本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结 。 尽我所知 ， 除文中已经标明引用的内容外
4、， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果 。 对本文的研究做出贡献的个人和集体 ， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留 、 使用学位论文的规定 ， 即 ： 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 ， 允许论文被查阅和借阅 。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 ， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文
5、。保密 ，在 _年解密后适用本授权书。本论文属于不保密 。（请在以上方框内打 “ ” ）学位 论文作 者签名 ： 指导 教师签 名：日期 ： 年 月 日 日期 ： 年 月 日目目目目录录录录摘 要 1AB S TR ACT 3引 言 5材料和方法 7结 果 12讨 论 15参考文献 18综 述 21附 录 34致 谢 35华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文1- c a t e ni n在在在在BMS C参与参与参与参与H pH H H慢性感染致胃癌发生中的作用慢性感染致胃癌发生中的作用慢性感染致胃癌发生中的作用慢性感染致胃癌发生中的
6、作用华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科硕士研究生： 王园园指 导 教 师 ：朱良如 副教授蔺 蓉 副教授摘摘摘摘要要要要【目 的 】 Wn t 信号 参与胃 癌发生 的过程 ， 其中 - c a t e n i n / T c f 4 / F z d 5 是经 典Wn t 信号 传导通路 中的关键 蛋白 , 骨髓 基质干细 胞 ( B o n e m a r r o w s t r o m a lc e l l s , B MS C ) 被认 为参与 胃癌的 发生 ， 但具 体机制 尚不清 楚 。 本课 题以 Wn t信号 传导通 路为靶 点 ， 通 过 s h R N A 技术 干扰
7、小 鼠骨髓 基质干 细胞 - c a t e n i n表达，探求 B MS C 在幽门螺杆菌（ H e l i c o b a c t e r p y l o r i ， H p ）慢性感染致胃癌 发生过 程中的 可能机 制。【方 法 】 构建 含有 - c a t e n i n - s h R N A 的 特异 性真核 表达载 体 。 B MS C 用 含1 0 % F B S 的 D ME M 培养 液培养 , 按 2 1 0 5 / 孔的 浓度接 种 于 T r a n s w e l l 上室 ,3 7 、 5 0 m L / L C O2 培 养 箱 中 培 养 2 4 h ,
8、待 细 胞 贴 壁 率 达 到 6 0 %后 , 用L i p o - f e c t a m i n e 2 0 0 0 进行转染 。 - c a t e n i n - s h R N A 处理组为 实验组 , s h R N A错义 序列 处理 组为阴 性对照 组。 测定 转染率 ，转染 4 8 h 后， 采用 We s t e r nB l o t 方法检测 B MS C 中 - c a t e n i n 的表达。然后按照 B MS C、小鼠胃癌细胞（ MF C）、 H p 超声粉碎物 ( 1 : 1 0 : 1 0 0 ) 比例建立体 外 T r a n s w e l l 共培养
9、体系， 培养箱中 共培养 2 4 h 后， 采用 R e a l - t i m e P C R 方法 和 We s t e r n B l o t方法 检测 MF C 中 - c a t e n i n m R N A 和总 蛋白的 变化。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文2【 结果 】 - c a t e n i n - s h R N A 转染 B MS C 4 8 h 后， B MS C 中 - c a t e n i n 蛋白表达下 降 。 B MS C、 MF C、 H P 超声粉 碎物 共培养 2 4 h 后 ， 与阴
10、性 对照组相 比 ， s h R N A 干 扰 MS C 后 ， MF C 中 - c a t e n i n 总 m R N A 表 达 下 降（ 0 . 4 8 8 0 . 1 2 0 1 . 0 2 6 0 . 0 5 7 P 0 . 0 5 ） , - c a t e n i n 蛋 白 表 达 亦 下 降（ 0 . 6 8 7 0 . 1 0 7 1 . 0 6 0 . 1 1 3 P 0 . 0 5 ） 。【结 论 】 B MS C 参与 调控 H p 慢性 感染致 胃癌发 生早期 事件 Wn t 信号 通路的过 程 。 B MS C 作为 一种良 好的基 因工程 细胞 ， 可为
11、 今后胃 癌的治 疗提供新的 思路和 方法。【关 键词 】 - c a t e n i n ， Wn t 信号 ， R N A 干扰 ， 骨髓 基质干 细胞 ， 胃癌华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文3Th e e f f e c t s o f - c a t e ni n i n BMS C pa r t i c i pa t e H pH H H c hr o ni c i nf e c t i o ni nduc e d g a s t r i c c a n c e r sAbs t r a c tAi ms ： Wn t
12、 s i g n a l i n g i s i n v o l v e d i n t h e p r o c e s s o f g a s t r i c c a n c e r , t h e - c a t e n i n / T c f 4 / F z d 5 i s a k e y p r o t e i n i n t h e c l a s s i c Wn t s i g n a l i n gp a t h w a y , B MS C a r e t h o u g h t t o b e i n v o l v e d i n g a s t r i c c a n
13、c e r , b u t t h em e c h a n i s m s a r e u n c l e a r . T h i s t o p i c t a k e s Wn t s i g n a l i n g p a t h w a y a s a t a r g e t , b yt h e t e c h n o l o g y o f s h R N A i n t e r f e r e n c e t h e m o u s e b o n e m a r r o w s t r o m a l s t e mc e l l s ( B MS C ) a n d d e
14、 t e r m i n a t i n g t h e - c a t e n i n p r o t e i n e x p r e s s i o n o f B MS C , t oe x p l o r e t h e m e c h a n i s m o f B MS C i n H p c h r o n i c i n f e c t i o n i n d u c e d g a s t r i cc a n c e r s a f t e r - c a t e n i n - s h R N A t r a n s f e c t e d B MS C .Me t ho
15、 ds : B u i l d i n g t h e s p e c i f i c e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r c o n t a i n i n g t h e - c a t e n i n - s h R N A . B MS C w i t h a 1 0 % F B S - c o n t a i n i n g D ME M c u l t u r em e d i u m , a c c o r d i n g t o a c o n c e n t r a t i o n o f 2 1 0 5 /
16、 w e l l s e e d e d i n a T r a n s w e l lu p p e r c h a m b e r , i n c u b a t e d f o r 2 4 h i n 3 7 C a n d 5 0 m L / L C O2 i n c u b a t o r . Wh e nt h e c e l l a d h e r e n t r a t e o f 6 0 % , t r a n s f e c t e d w i t h t h e L i p o - f e c t a m i n e 2 0 0 0 . T a k et h e - c
17、a t e n i n - s h R N A t r e a t e d a s e x p e r i m e n t a l g r o u p , s h R N A m i s s e n s es e q u e n c e t r e a t e d a s a n e g a t i v e c o n t r o l g r o u p . D e t e r m i n e t h e e f f i c i e n c y o f t h et r a n s f e c t e d B MS C , A f t e r 4 8 h , d e t e c t e d t
18、 h e - c a t e n i n e x p r e s s i o n o f B MS C b yWe s t e r n B l o t . P r o p o r t i o n o f B MS C , m i c e g a s t r i c c a n c e r c e l l ( MF C ) , H Ps o n i c a t i o n m a t t e r ( 1 : 1 0 : 1 0 0 ) t o e s t a b l i s h T r a n s w e l l i n v i t r o c o - c u l t u r e s y s t
19、 e m .I n c u b a t e t h e c o - c u l t u r e s y s t e m f o r 2 4 h i n t h e i n c u b a t o r , D e t e c t e d t h e - c a t e n i nm R N A a n d p r o t e i n c h a n g e s i n t h e MF C b y R e a l - t i m e P C R m e t h o d a n dWe s t e r n B l o t .华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位
20、位位位论论论论文文文文4Re s ul t s : - c a t e n i n - s h R N A t r a n s f e c t e d B MS C a f t e r 4 8 h , t h e - c a t e n i n p r o t e i ni n t h e B MS C w a s d e c r e a s e d . B MS C 、 MF C 、 H p c o - c u l t u r e d f o r 2 4 h ,C o m p a r e d w i t h t h e n e g a t i v e c o n t r o l g r o
21、u p , t h e - c a t e n i n m R N A i n MF Ce x p r e s s i o n w a s s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d ( 0 . 4 8 8 0 . 1 2 0 1 . 0 2 6 0 . 0 5 7 P 0 . 0 5 ) ,t h e - c a t e n i n p r o t e i n e x p r e s s i o n w a s a l s o d e c r e a s e d . ( 0 . 6 8 7 0 . 1 0 7 1 . 0 6 0 . 1 1 3 P
22、 0 . 0 5 ) .Co nc l us i o n: B MS C a r e t h o u g h t t o b e i n v o l v e d i n t h e p r o c e s s o f H p c h r o n i ci n f e c t i o n i n d u c e d g a s t r i c c a n c e r s e a r l y e v e n t i n t h e Wn t s i g n a l i n g p a t h w a y .B MS C a s a g e n e t i c a l l y e n g i n e
23、 e r e d c e l l s , t o p r o v i d e n e w i d e a s a n d m e t h o d s f o rt h e t r e a t m e n t o f g a s t r i c c a n c e r i n t h e f u t u r e .K e yK K K wo r ds ： - c a t e n i n , Wn t s i g n a l , R N A i n t e r f e r e n c e , B MS C , g a s t r i c c a n c e r .华华华华中中中中科科科科技技技技大
24、大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文5 - c a t e ni n在在在在BMS C参与参与参与参与H pH H H慢性感染致胃癌发生中的作用慢性感染致胃癌发生中的作用慢性感染致胃癌发生中的作用慢性感染致胃癌发生中的作用华中 科技大 学同济 医学院 附属协 和医院 消化内 科硕士 研究生 ：王园 园指 导 教 师 ：朱 良如 副教 授蔺 蓉 副教 授引引引引言言言言胃癌 是发病 率较高 的消化 系肿瘤 ， 但其 发病机 制尚不 完全明 确 ， 其中幽门 螺杆菌 ( H e l i c o b a c t e r p y l o r i ， H p ) 慢性 感染导
25、致胃癌 发生是 目前被 普遍接受的的研究结果 。 2 0 0 4 年， H o u g h t o n 等首次提出 H p 感染相关性胃癌起源 于骨髓 源性细 胞而非 胃上皮 细胞的 观点 ，但 具体机 制尚不 清楚 1 。 骨髓基质干细胞（ B o n e m a r r o w s t r o m a l c e l l s , B MS C） 参与 H p 慢性感染致胃癌 发生这 一观点 的提出 不仅更 新了传 统肿瘤 发生的 概念 ， 还可 以对肿 瘤干细 胞的细 胞源性 进行解 释。B MS C 是一 种较原 始的成 体干细 胞 ， 具有 自我更 新能力 和多向 分化潜能，近期有 研
26、究表明正常情 况下其低表达多种 Wn t 信号通路蛋 白，并以自调控的方式成为 B MS C 静息和增殖分化的必需调控途径 , 该途径的异常激活会导致 B MS C 静息和增殖分化失 衡 2 。其中 - c a t e n i n 是经典 Wn t信号 传导通 路中的 关键蛋 白 ， 阻断 其在干 细胞内 过量表 达对于 干细胞 自身静息 和增殖 分化调 控有重 要意义 3 。研究 表明 Wn t 途径 参与肿 瘤发生 ， 正常 情况下 在成熟 机体中 该途径 是华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文6关闭 的 , 体内 几乎没 有 W
27、n t 信号 。 但是 在胃癌 发生过 程中 ， Wn t 通路 的激活从 发生胃上 皮不典型 增生开始 就可以 检测到 4 ， 那 么 Wn t 途径 激活同时作为 B MS C静息 与增殖 分化失 衡的调 控信号 和胃癌 发生的 过程 ， 在两 者之间起 着怎样 的作用 ， B MS C和胃 癌发生 又有着 怎样的 联系呢 ， 尚有 待进一步研 究 。 本实 验以 Wn t 信号 传导通 路为靶 点 ， 通过 s h R N A技术 干扰小 鼠骨髓基 质干细 胞 ( B MS C ) - c a t e n i n 表达 ， 并建 立 B MS C、 MF C ( 小鼠 胃癌细 胞 ) 、
28、H p 超声粉碎物体外共培 养体系，通过 检测 MF C中 - c a t e n i n m R N A 和总蛋白的变 化以 探求 B MS C在幽门 螺杆菌慢性 感染致胃癌 发生过程中 的可能机制 。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文7材料和方法材料和方法材料和方法材料和方法1 . 材料小鼠 B MS C、 MF C 均来自武汉协和医院消化内科胃肠实验室保存 。 - c a t e n i n - s h R N A 及 其 错 义 序 列 由 湖 南 长 沙 赢 润 生 物 公 司 合 成 ，L i p o f e c t a
29、 m i n 2 0 0 0 购自 I n v i t r o g e n 公司 ， N C B S（ 新生 牛血清 ） 和 F B S（ 胎牛血 清 ） 购自 G i b c o 公司 ， D ME M（ 一种 含各种 氨基酸 和葡萄 糖的培 养基 ）和 1 6 4 0 （ 含体外细胞培养 的各种营养成分及无机盐等 ） 购自 G i b c o公司 ， T r i z o l 试剂 盒购自 G i b c o 公司 ， R I P A 裂解 液购自 武汉 博士德 生物工程有限公司， M- ML V 逆转录试剂盒购自 I n v i t r o g e n 公司 ， - c a t e n i
30、 n 基因引物由 I n v i t r o g e n 公司合成 ， - c a t e n i n 一抗购自 C e l l S i g n a l i n g 公司。内参 - a c t i n 一抗 购自 C e l l S i g n a l i n g 公司 。2 . 方法2 . 1 细胞培养 复苏所冻存的小鼠 B MS C、 MF C， 方法如下 ： 取 7 5 %酒精擦洗超 净台台面并紫外线 消毒至少 3 0 m i n ；从液氮 灌中取出所需细胞冻存管直接放入 3 7 - 4 0 水浴箱中 ， 快速摇晃直至完全 融化 ； 在超净台中打开冻存管，用吸管吸出适量细胞悬液移入培养瓶
31、中，加入适量培养液即可 。 MF C 用 含 1 0 % N C B S 的 1 6 4 0 培养液培养 ， B MS C 用 含 1 0 % F B S的 D ME M 培养 液培养 ， B MS C、 MF C 均在 3 7 、 5 0 m L / L C O2 恒温培养箱中培养 ； 4 h 后更换细胞培养液 ， 再根据细胞生长状 态适时更换培养液。2 . 2 - c a t e n i n - s h R N A 转 染 B MS C 按 2 1 0 5 / 孔的 浓度 接种 于 T r a n s w e l l上室 ， 3 7 、 5 0 m L / L C O2 恒温 培养箱 中培
32、养 2 4 h , 待细 胞贴壁 率达华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文8到 6 0 % 后 ， 用 L i p o - f e c t a m i n e 2 0 0 0 进 行 转 染 ， 转 染 按 照L i p o - f e c t a m i n e 2 0 0 0 试剂 盒说明 书进行 ，具体 操作如 下：常 规超净 台紫外 线 消 毒 至 少 3 0 m i n ； 按 照 比 例 D N A : L i p o - f e c t a m i n e 2 0 0 0 = 1 : 3 . 5（ u g : u L ）
33、 ， 取 1 . 5 u g D N A 加入 1 2 5 u L O p t i - ME M 中轻 轻吹打 混匀 ， 5 . 2 5u L L i p o - f e c t a m i n e 2 0 0 0 加 入 1 2 5 u L O p t i - ME M 中轻 轻吹打 混匀室 温下孵育 5 m i n 后将 D N A 液及 L i p o - f e c t a m i n e 2 0 0 0 液混 匀 ， 室温 下孵育 2 0 m i n后 加入 各孔 中后 放入 细胞 培养 箱 中， 5 h 后 更换 为 1 0 % F B S 的 D ME M培养 液 ， - c a
34、 t e n i n - s h R N A 处理 组为实 验组 ， 序列 为 G G A A G A A G A T G TT G A C A C C ； s h R N A 错 义 序 列 处 理 组 为 阴 性 对 照 组 ， 序 列 为G A C T T C AT A A G G C G C AT G C。转 染 4 8 h 后， 提取 B MS C 中总 蛋白 ， 采用 We s t e r n B l o t 方法 检测转 染后 4 8 h B MS C 中 - c a t e n i n 的表 达 ， 判断 所构建 质粒是 否达到 干扰效 果。2 . 3 提取 H p 超声 粉碎
35、物 将 H p 接种 于放有 液体培 养基的 2 个烧 瓶中 ，放入摇床中培养 2 4 h 后取出烧瓶。将液体分装于无菌离心管中，每管 约8 m L , 4 、 4 0 0 0 转 / 分离 心 1 5 分钟 后去适 量上清 后将离 心管置 于 - 8 0 冰箱中，约 1 5 - 2 0 分钟后待离心管中液体冻存后取出再置于 3 7 水浴箱中解冻 ， 反复 冻融 3 次 。 将上 述冻融 后的液 体置于 超声粉 碎探头 中 ， 开启 按钮 ，粉碎 3 0 秒 ， 停顿 2 0 秒 ， 如此 反复共 5 分钟 后即可 ， 粉碎 过程需 在冰浴 中进行。 4 、 4 0 0 0 转 / 分离心 1
36、 5 分钟后取上清，无 菌过滤器过滤至 1 0 m L无菌 玻璃中 ，记好 标记后 置入 - 2 0 冰箱 中保存 。2 . 4 R N A 提取 和 逆转 录 按照 2 1 0 5 / 孔的 浓度将 B MS C 接种 于 6 孔板 ，3 7 、 5 0 m L / L C O2 培养 箱中培 养 2 4 h 后进 行转染 ， 转 染 4 8 h 后 ， 按 B MS C、小鼠 胃癌细 胞 （ MF C） 、 H p 超声 粉碎物 ( 1 : 1 0 : 1 0 0 ) 比例 建立体 外 T r a n s w e l l华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学
37、学位位位位论论论论文文文文9共培 养体系 ， B MS C 在 T r a n s w e l l 上室 ， MF C、 H p 超声 粉碎物 在 T r a n s w e l l下室 ， 共培养时均使用 1 0 % F B S 的 D ME M 培养液，共培养 2 4 h 后收 集MF C。用 T r i z o l 提取 上述所 收集 MF C 中总 m R N A ，提 取方法 按照 T r i z o l 试剂盒 中说明书 ，并将提 取的总 m R N A 进行 逆转录， 逆转录的 c D N A 置于- 2 0 中保 存 。 具体 操作如 下 ： 用氯 仿 - 异丙 醇 - 7 5
38、 %乙醇 法常规 操作法 提取MF C 中总 m R N A ，将提取的 m R N A 逆转录成 c D N A ， - a c t i n 前引物 为5 - C G T G C G T G A C AT C A A A G A G A A - 3 ，后 引物为 5 - G G C C AT C T C C T G CT C G A A - 3 ； - c a t e n i n 的前引物为 5 - G C C C C C A G G T G AT AG C A A - 3 ，后引物 为 5 - C C T AA A G G A C G AT T T AC A G G T C A G T A
39、 - 3 。 按照 M- MLV 逆转录 酶说明 书操作 ，在 2 0 u L E p 管中 加入 1 u L o l i g e （ d T） 1218 基因 引物 ，1 u L 1 0 m M d N T P， 1 u L 总 R N A，然 后加入 D E P C 水至 1 2 u L 混匀 后 6 0 加热 5 m i n ，然后 迅速置 于冰上冷 却，短暂 离心加入 4 u L 5 第一链 合成缓冲液 、 2 u L 0 . 1 M D T T 、 1 u l R N A 核酸 酶抑制 剂 ， 3 7 孵育 2 m i n ， 室温 下加入 1 u l M- MLV 逆转 录酶 ，
40、3 7 孵育 5 0 m i n ， 7 0 加热 1 5 m i n 终止 反应即可。2 . 5 蛋白 提取和 测蛋白 浓度 采用 上述同 样的方 法收集 MF C， 采用 R I PA裂解液提 取细胞总蛋白 ，具体操 作如下： 用 P B S 缓冲液轻 轻冲洗 6 孔板底两 次 ， 用细 胞刮轻 轻刮去 孔底细 胞收集 在 1 . 5 m L E p 管中 ； 4 、 1 2 0 0 0转 / 分离 心 1 0 m i n 后弃 上清 ； 往 E p 管中 加入适 量 R I P A 裂解 液 ， 混匀 后于震荡 器上震 荡约 3 0 m i n （震 荡 8 s ，停 5 m i n 裂
41、解 液浓度 为 1 ： 1 0 0 ） ； 4 、1 4 0 0 0 转 / 分离 心 1 5 m i n 后取 上清即 为所提 取蛋白 ， 加入 适量蛋 白缓冲 液后将蛋 白保存 于 - 8 0 冰箱 中。华华华华中中中中科科科科技技技技大大大大学学学学硕硕硕硕士士士士学学学学位位位位论论论论文文文文10所 提取 蛋白 采 用 B C A 法 测蛋 白浓 度 ， 具体 操作 如 下： 按照 5 0 ：1 （ A 液 ： B 液 ） 的 浓度 配适 量 工作 液 ； 取 9 6 孔 板 ， 第 一孔 空白 调 零 ，取 2 5 u L P B S 一 次加 入 2 ， 3 ， 4 . . 孔
42、中， 第 2 孔 加入 标准 蛋 白 2 5 u L ，按 照倍 比稀 释 依次 加入 2 ， 3 ， 4 . . 孔 中 ， 至 最后 一孔 取 出 2 5 u L 弃 去 ；各 孔依 次加 入 2 0 0 u L 工 作液 ， 待 测样 本孔 中 则各 加入 2 4 u L P B S 、 1 u L待 测样 本及 2 0 0 u L 工 作液 并混 匀 ； 3 7 温 箱中 孵育 3 0 m i n ； 分 光光 度仪 测 O D 值 ， 根 据标 准 蛋 白 浓 度 于 E x c e l 表 中 计 算所 测 样 本 的 蛋 白 浓度 。2 . 6 R T - P C R P C R
43、 扩增 - a c t i n （ 内参 ） 、 - c a t e n i n ， 以上 述保存 的 c D N A为 扩 增 模 板 。 反 应 体 系 为 2 0 u L , 即 上 引 物 和 下 引 物 各 1 u L , c D N A 1 u L ,S Y B R G r e e n m i x e d b u f f e r 1 0 u L ， d d H2 O 7 u L ， 扩 增 的 反 应 条 件 为9 5 1 0 m i n 、 9 5 1 5 s 、 6 0 1 m i n ， 4 0 个循 环。2 . 7 We s t e r n B l o t 根据 上述所 测
44、的蛋 白浓度 计算上 样体积 ， 每孔 按 3 0 u g蛋白 量点样 1 2 %和 5 %于 S D S - P A G E（十 二烷基 硫酸钠 聚丙烯 酚胺凝 胶 ）凝胶 中 ， 1 2 0 V 电泳 2 h , 2 0 0 m A P V D F 转膜 6 0 m i n , 然后 将 P V D F 膜放 入含相应 抗 体 的 含 8 % 脱 脂 奶 粉 非 特 异 性 封 闭 液 中 封 闭 1 小 时 ， 加 入 一 抗（ - c a t e n i n 一抗 浓度 1 : 6 0 0 ， - a c t i n 一抗 浓度 , 1 : 3 0 0 ） ， 4 孵育 过夜 ， 次 日T B S T 缓 冲 液 漂 洗 1 0 m i