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1、精选优质文档-倾情为你奉上实验二：食品中对羟基苯甲酸酯类的检测方法8 2010级食品营养1班 杨柳对羟基苯甲酸酯类是食品中常用的防腐剂，广泛存在于酱油、醋、化妆品中。对羟基苯甲酸酯类有：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯。对羟基苯甲酸酯类以丁酯的防腐作用最好，由于对羟基苯甲酸酯类都难溶于水，所以通常是将它们先溶于乙酸、乙醇、乙腈等强极性溶液中，然后使用，为更好发挥防腐作用，最好是将两种或两种以上的该酯类混合使用。虽然在限量范围内食用上述防腐剂对人体影响不大，但若大量摄入，则会危害人体健康。各国都对食品中可以使用的防腐剂
2、种类和用量有严格的要求，如中国的GB2760食品添加剂使用卫生标准明确规定了使用范围和最大使用量。不同商品中的最大限量：对羟基苯甲酸甲酯1g/kg（中），乙酯0.1-0.25g/kg（中），丙酯0.012-0.2g/kg（中），丁酯0.25g/kg（日），异丁酯0.25g/kg（日）。1 实验目的1.1学习高效液相色谱外标法定量定性分析方法；1.2熟悉超高压液相色谱的分析操作规程；1.3学习高效液相色谱检测食品中的防腐剂的方法。2 实验原理高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法和气相色谱的基础上发展起来的，(经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重
3、力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气象色谱原理类似，流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配合程序升温可分析高沸点的有机化合物。)弥补了经典液相色谱和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适合于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。由于80%的有机化合物都可以用高效液相色谱法分析，目前已经广泛应用于生物工程、制药工业、食品工业、环境检测、
4、石油化工等行业。在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有多种酯类，它们都是强极性化合物，可采用超高压液相色谱进行分析。以对羟基苯甲酸酯类标样保留时间定性，采用外标法定量对羟基苯甲酸酯类含量。X=(A2C)/A1（其中：X为样品中对羟基苯甲酸酯类的含量，单位为ug/mL；A1为标样对羟基苯甲酸酯类的峰面积；A2为样品中对羟基苯甲酸酯类峰面积；C为对羟基苯甲酸酯类标准液质量浓度。）3 实验材料与仪器3.1材料：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、乙腈、甲醇（均为分析纯）、超纯水3.2仪器：Waters超高压液相色谱仪（ACQUITY UPLC）、超声波清洗仪、超纯水制备仪、万分之一天平4
5、实验方法按照GB/T5009.232003的方法测定食品中对羟基苯甲酸酯类的含量。4.1标准液的制备标准混合使用液：精密称取对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯各0.01g，用一只100mL容量瓶以乙腈：水1:1中定容，吸取1mL，于25mL容量瓶中水定容，配制浓度均含4gmL-1 的酯类混合物的标准溶液，混匀备用。4.2样品的处理 称取5g样品，加入40mL乙腈，用超声波萃取30min，过滤，用微孔滤膜抽滤待测。4.3实验条件的选择(1) 色谱柱 (2) 流动相 乙腈：水（50：50），流量0.3mLmin-1(3) 监测器 紫外光度监测器，254nm，灵敏度0.04(4)
6、记录仪 量程5mV，纸速480mmh-1(5) 进样量 2L(6) 柱温 404.4测定(1) 将配制好的流动相乙腈、超纯水置于超声波发生器上脱气15min。(2) 根据实验条件，将超高压液相色谱仪按照操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡时，记录仪基线呈平直，即可进样。(3) 依次分别吸取2L的标准混合使用液和未知试液进样，记录各色谱图，在每次进样后，于进样信号附近标明进样溶液的名称。5 实验结果及分析5.1根据标准品色谱图中的保留位置，找到并标出样品色谱图中的对羟基苯甲酸酯类的色谱峰位置，得出峰面积。如图1。图1 实验结果（液相色谱图）样品保留时间（分钟）面积 微伏/秒15.
7、13127.422311.699标品保留时间（分钟）面积 微伏/秒14.95927.147311.2645.2以对羟基苯甲酸酯类标样保留时间定性，采用外标法定量对羟基苯甲酸酯类含量。数据处理结果如表1。表1 数据处理表序号标样保留时间（min）标准液质量浓度C（ug/mL）标样的峰面积A1（微伏/秒）样品的峰面积A2（微伏/秒）样品中对羟基苯甲酸酯类的含量X（ug/mL）14.95942.077627.14742.0178311.26441.97855.3标准曲线的绘制，如图2图2 样品中对羟基苯甲酸酯类的含量标准曲线6 实验结果讨论及思考6.1高效液相色谱仪使用注意事项：（1）对色谱柱来说，
8、在通常的分析条件下，可长时间使用，但如发生杂物吸附或由微粒引起的堵塞时，则其性能大大降低，为延长色谱柱寿命建议使用保护柱。（2）若直接注入浑浊的试样或含有微粒的试样，则会成为流路或色谱柱堵塞的原因，请用0.20.5um左右的圆盘过滤或离心沉淀来去除杂物。（3）在流动相水溶液中含有眼睛所看不到的很多离子及微生物，如在此状态下直接使用时，则会造成过滤器及色谱柱的堵塞以至压力上升或色谱柱劣化，无法进行良好的分析，建议将流动相水溶液用0.22um的膜滤器减压过滤后使用。（4）压力不能太大,最好不要超过30Mpa,防止过高压力冲击色谱柱。（5）每次使用后要冲洗干净进样阀中残留的样品和缓冲盐,防止无机盐沉
9、积和样品微粒磨损阀转子;使用完毕后须在记录本上记录使用情况。色谱柱若不用,在卸下前必须洗去缓冲液,并用大于10%的有机溶剂充满整个色谱柱,卸下柱后,用柱堵头将色谱柱首尾密封。6.2本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。答：流动相极性大于固定相极性的色谱称为反相色谱，反之称为正相色谱。本实验所用样品均为极性化合物，依据“相似相溶”原则，宜选用极性固定相、非极性的流动相，即选择正相色谱。但是，高效液相色谱的可贵之处是它的分离效能很高，对于极性化合物往往用反相色谱也能实现很好的分离，而且，反相色谱的流动相通常使用甲醇和水，价格远低于正相色谱通常使用的正己烷。6.3高效液相色谱分析的流动相为何要脱
10、气，不脱气对实验有何妨碍？答：流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作；另外，如果在检测器中产生气泡，会造成基线波动或异常出峰。6.4高效液相色谱与气相色谱的主要区别(1)进样方式的不同，高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；(2)流动相的不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小45个数量级；(4)由于流动相的化学成分可进行广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色
11、谱的分辨率（柱效能）；(5)高效液相色谱采用510Lm细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；(6)高效液相色谱是在液相中进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等；(7)液相色谱与气相色谱相比较，高效液相色谱同样具有高灵敏度、高效能和高速度的特点。高效液相色谱的定性和定量分析，与气相色谱分析相似，在定性分析中，采用保留值定性，或与其他定性能力强的仪器分析法连用；在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色谱在分离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被广泛使用。专心-专注-专业