质粒构建流程(共6页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)，4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前

2、后顺序。一般选择三个保护碱基。7）引物设计完成，送公司合成。二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒 离心柱型（裂解液RL 4、漂洗液RW -20保存）准备：冰盒、4预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1） 将1000l裂解液RL加入细胞中，混合5min。2） 加200l氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。3） 4，12000rpm离心10min。4） 最上层水相转移至新EP管中（体积约550l）5） 加入1倍体积（550l）70%乙醇，混匀6） 全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4，10000rpm离心45s7） 弃废液，重套收集管，

3、加500l去蛋白液RE，12000rpm离心45s8） 弃废液，重套收集管，加700l去漂洗液RW，12000rpm离心60s9） 弃废液，重套收集管，加500l去漂洗液RW，12000rpm离心60s10） 弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11） 吸附柱放入新EP管，加50l RNase free water于膜上，室温放置2min12） 4，12000rpm离心60s13） 点样：5l RNA+ 1l 10buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。14） -20保存2. RNA反转录试剂盒：TaKaRa primescript RT reage

4、nt kit with gDNA eraser（-20保存）准备：冰盒，取出解冻，为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1） 基因组DNA去除（10l体系） 5gDNA eraser buffer 2l gDNA eraser 1l Total RNA 4l(可根据RNA浓度调整) RNase free water 3l PCR仪中进行，程序：42，2min4注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2） 反转录反应（20l体系） 5primerScript buffer 2 4l primerScript RT enzyme mix I 1l RT primer mix 1l RN

5、ase free water 4l 1）反应液 10l PCR仪：37，15min85，5s4注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中3）1.5mlEP管收集，-20长期保存3. PCR扩增PCR程序：95 5min95 30s56 30s 35cycle72 1min72 10min注：可根据不同基因调节退货温度，延伸时间，循环数。高保真酶primerstar扩增，50l体系如下：5PS buffer 10ldNTP 4ldH2O 32.5lPrimerstar 0.5lcDNA 1l(可变)R-primer 1l F-primer 1l 点样：5l PCR产物+ 1l 6buff

6、er，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，15min4. PCR产物纯化1） 液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol(OMEGA bio-tek) D6293-01 将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积buffer CP，混匀。 转移至HiBind MicroElution DNA 柱（套收集管），室温离心10000g，1min。 弃废液，加700l DNA wash buffer（含乙醇）到柱子，室温离心10000g，1min。 弃废液，重复 弃废液，空管离心13000g，1min 柱子放入新EP管，加10-

7、20l Elution buffer到膜上，室温孵育3-5min，离心10000g，1min 电泳检测2） 割胶回收（产物电泳结果含杂带） 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。 加等体积（1g=1ml）binding buffer（XP2）,60金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min 溶液加入离心柱，离心10000g，1min，废液倒回再离一次 弃废液，加300l binding buffer（XP2），离心10000g，1min 弃废液，加700l SPW washing buffer，离心10000g，1min 重复 空管离心13000g，

8、2min，弃废液，柱子转移到新EP管加入30-50l elution buffer于膜上，室温孵育1min，离心13000g，1min 电泳检测三、 双酶切Vector 12l 10M/L/K buffer 3l 3dH2O 13l 酶A 1l 酶B 1l 30l 反应体系如下：PCR纯化产物 15l 10M/L/K buffer 3l 3dH2O 10l 酶A 1l 酶B 1l 反应条件：takara酶30水浴1h65金属浴10min终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择，见附表四、 连接1） 双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2l 2） 酶切产物液相纯化PCR产物 6.3l

9、pcDNA3.1 0.7l 10T4buffer 2l T4 ligase 1l 3dH2O 10l 3） 20l 连接体系（皆可）PCR产物 5l pcDNA3.1 2l 10T4buffer 2l T4 ligase 1l 3dH2O 10l PCR仪中进行：22，30min4冰箱过夜注：连接产物-20可长期保存五、 转化准备：碎冰，灭菌EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热421） 将感受态细胞置于冰上，待其融化2） 超净工作台中，将连接产物10l 加入100l 感受态细胞，或质粒1-3l 加入100l 感受态细胞3） 轻混匀，冰浴30min4） 热击水浴

10、42，45s，冰浴1min5） 加900l LB空培养基，摇菌150rpm，37，1h6） 浓缩离心13000rpm，1min，上清液留约200l 重悬菌体，部分涂板（50-100l ）7） 完全吸收后，37倒置培养12-16h六、 菌落PCRPCR程序：95 5min95 30s56 30s 35cycle72 1min72 10min注：程序与DNA扩增一样1）以rTaq酶50l 体系配制PCR反应液，每个PCR管分装15l，体系如下：3dH2O 35.7l 10buffer 5l MgCl2 3l dNTP 4l rTaq 0.3l R-primer 1l F-primer 1l 2）

11、灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。新划的板37倒置培养12-16h。3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。七、 测序1. 摇菌1） PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌2） 三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基3） 用10l 枪头挑起选择的菌落打到培养基中4） 37。250rpm摇菌12-16h2. 送样每瓶取1ml箘液，送华大基因测序3. 比对将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。（注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）八、 菌种保存菌

12、种比对成功，则可保存菌种备用。1） 超净工作台中取1.5mlEP管，加200l 80%灭菌甘油。2） 再加入800l 箘液，轻混匀。3） 液氮冻存。（一个基因冻2管即可）九、 质粒提取菌种比对成功，冻存菌种后，箘液用于提取质粒。试剂盒：AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep 操作步骤：1） 取3-5ml箘液，室温下离心10000g，1min2） 弃上清，加250l solution I/ RNase A 重悬菌落，混匀3） 加250l solution II，倒置轻混匀，孵育2min。（整个裂解反应不超过5min）4） 加入250l solut

13、ion III，立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。5） 室温离心13000g，10min6） 上清液小心转入HiBind miniprep column(有套管)，室温离心10000g，1min7） 弃废液，加500l buffer HB，室温离心10000g，1min8） 选择性步骤：重复第7步9） 弃废液，空管室温离心13000g，2min10） 柱子转入新EP管，加30-50l elution buffer或3dH2O到膜上，室温孵育1-2min11） 室温离心13000g，1min12） 提取的质粒-20保存备用附：感受态制备方法（皆采用LB空白培养基）：1. 菌种活化1） 用接种环

14、直接取冻存的E.coli/ DH5菌种，在LB平板上划线，37倒置培养16h2） 挑单菌落转到2-10ml LB液体培养基中，摇菌37，250rpm，12-16h3） 取1ml箘液加入到100ml LB液体培养基，摇菌37，250rpm，3h4） 检测箘液OD600 0.5（0.3-0.4）2. 感受态制备准备：0.1M CaCl2灭菌，50ml离心管灭菌，冰水，1.5ml离心管冰上预冷，离心机4预冷。步骤：1） 将箘液用50ml离心管分装，调平，4离心3000rpm，8min2） 弃上清，0.1M CaCl2 10ml重悬（冰水中进行，动作轻），两管合成一管3） 冰上放置一段时间，4离心25

15、00rpm，8min4） 弃上清，0.1M CaCl2 10ml重悬，4冰箱过夜沉淀5） 上清液取出8ml，剩2ml，加670l 80%甘油（箘液：80%甘油=3:1），轻混匀6） 1.5mlEP管分装，每管分装100l ，液氮冻存。试剂配制：1. 琼脂糖凝胶（1.2%）琼脂糖粉 0.6g1TAE 50ml 微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1l gold view核酸染料，混匀，倒板2. 电泳缓冲液TAE（50）2mol/L tris-碱 242g1mol/L 冰醋酸 57.1mlEDTA(pH8.0) 18.622g二蒸水 至1L用NaOH调节pH至8.6，常温储存。用时稀释成1溶液使用。3. LB培养基Yeast extract（酵母提取物） 1gTryptone 2gNaCl 2gAgar powder（琼脂粉） 3g（配1.5%固体培养基时加入）二蒸水 200ml灭菌20min，冷却后加入抗生素。4. CaCl2（0.1M）CaCl2 1.47gH2O 100ml 专心-专注-专业