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1、精选优质文档-倾情为你奉上羊的胚胎移植一、胚胎移植概述二、胚胎移植原理三、胚胎移植技术程序一、胚胎移植概述1.胚胎移植的发展历史2.胚胎生物技术的研究意义及其在畜牧生产中的应用3.胚胎移植目前存在的问题4.影响胚胎移植的主要因素5.胚胎移植的经济效益6.胚胎移植的发展前景1.1国外胚胎移植发展史 George是世界上第一个提出动物胚胎移植的人。1890年4月，Walter Heape用兔作为实验动物，成功地获得了世界上第一个动物胚胎移植后代。Heape兔胚胎移植的成功，极大的影响着繁殖生物学和畜牧业的发展。1900年，Heape的杰出接班人FHA Marshall和John Hammond总结
2、了他的主要工作内容，提出了哺乳动物性季节的概念，也就是现在所说的发情周期。1911-1913年，奥地利维也纳的Biedl等进行了兔的胚胎移植实验，但由于战争，直到1922年才报道了其研究结果。虽然他们做了70多个实验，但由于把输卵管的胚胎移植到子宫，结果只有一只受体兔妊娠，这充分证明了胚胎和受体的同步性是非常重要的。1932年和1933年，Warwick,Berry和Horlache第一次把胚胎移植技术用在绵羊和山羊上，Dr. Berry也因此成为了第一个国际胚胎移植协会先驱奖的获得者。1948年，张明觉用超数排卵技术从2只母兔获得88枚受精卵，给7只受体母兔移植，成功地产出76只小兔，这次试
3、验的成功具有划时代的意义。1950年12月19日，33岁的美国人Elwyn Willed成功地获得了世界上第一头胚胎移植牛犊。60年代初，全部采用的是手术回收胚胎和移植，1964年Mutter等和1965年Sugie相继报道了非手术移植胚胎获得成功。70年代中期，牛的非手术移植完全取代了手术移植. 1974年，成立了国际胚胎移植协会(IETS )，随后相继成立了美国胚胎移植协会、加拿大胚胎移植协会、欧洲胚胎移植协会1.2 国内胚胎移植发展史 我国的胚胎移植研究起步较晚，于20世纪70年代初才开始。1973年首先在家兔上获得成功。1974年，中科院遗传所在绵羊胚胎移植上取得成功。1976年郭志勤
4、、谭丽玲等在家兔胚胎和绵羊胚胎低温(100C)保持1天和10天后移植成功。手术法和非手术法牛胚胎移植在1978年和1980年也相继成功。1980年中国农业科学院畜牧所在绵羊胚胎超低温保存后移植产羔。20世纪80年代，胚胎移植进入了实验阶段，掀起了全国的研究高潮，20几个省近30个单位相继开展了胚胎移植研究工作。20世纪90年代初期，我国的胚胎移植工作逐渐进入了生产应用初始阶段。生产应用比较好的地区主要是内蒙古、新疆和黑龙江、北京1.3 羊的胚胎移植发展历史羊胚胎移植的商业化应用已有近40年的历史。在国际上，胚胎移植以牛的比例最大，其次为绵羊和山羊，其它家畜和动物胚胎移植(猪、鹿、马等)的研究相
5、对较少，但近些年来也逐渐成为一个比较热的研究方向。在国内，羊的胚胎移植起步较发达国家要晚一些，近十几年来，才逐渐推广开来，前几年由于波尔山羊的大量引进而使山羊的胚胎移植研究也相对多了起来。全国二十多个省进行了波尔山羊的快繁技术项目的实施。2003年我国共生产波尔山羊、良种肉用绵羊胚胎40000枚左右，移植受体30000只以上。2.胚胎生物技术的研究意义及其在畜牧生产中的应用（1）超数排卵技术能充分利用优秀种母畜的繁殖潜力，几十倍或成百倍地提高母畜的繁殖效率和后代的增长速度。（2）克隆技术可实现同卵双生、同卵多生动物或无性繁殖后代，快速增加良种动物的数量，或为育种提供材料。（3） 可使优秀种畜遗
6、传资源得到充分利用，加速育种速度和畜牧良种化进程。(4）能用胚胎代替活畜运输，可在世界范围内实现品种交流，节约运输费用，减少疫病传播。（5）用于建立胚胎库或基因库，使畜禽良种、珍稀物种(基因)能长期保存，对利用、保存优良基因或拯救濒危灭绝动物具有重大意义。（6） 可用于治疗动物和人类的不育。如：体外受精技术，特别是显微受精技术。3.胚胎移植目前存在的问题（1） 胚胎来源限制了NT的效率和实际应用（2）缺乏熟练操作技术人员及我国优秀畜种比例低 （3）ET费用高，人力和时间耗费大，条件严格制约了其推广应用（4）胚胎冷冻保存任存在很多问题（5）胚胎采集和移植主要采用手术法的畜禽易造成粘连，受体重复使
7、用受限制（6）超排效果不够稳定 、移植成功率低 、超排效果不够稳定 4.影响胚胎移植的主要因素（1）超排技术：超数排卵是胚胎移植的关键技术之一，可以为胚胎移植受体提供优质、丰富的胚源，保证优良母羊发挥最大的繁殖潜能。但影响超排的因素也很多，如超排使用的药物种类，来源，生产厂家，使用剂量，操作程序等（2）移植胚胎的质量：胚胎质量的好坏是胚胎移植能否成功的关键因素。通过胚胎鉴定，要选择具有形态结构完整紧凑、轮廓清楚、呈球形、分裂球大小均匀、色调和透明度适中及无附着的细胞和液泡等特征的一级（ A 级）、或二级（ B 级）胚胎进行移植。（3）供体、胚胎与受体的同期化程度：供、受体之间的子宫内膜要与胚胎
8、的发育相同步，这是胚胎从体外培养环境到体内并发生妊娠必须具备的重要条件之一。这就要求供体与受体在发情时间上要同期，或移植的胚胎日龄与受体发情时间是同步，一般供、受体发情同步差为24h以内最理想。同步差越小，越有利于胚胎的发育，移植成功率越大（4）移植胚胎的数目：一般认为，妊娠率与移植高质量的胚胎数成正相关，移植1枚、2 枚和3 枚胚胎受体的妊娠率差异不显著，但产羔率却依次增加。也有研究报道，当移植胚胎数超过6 枚时，妊娠率反而下降。据研究单侧移植: 2-3 枚效果最佳，进行大规模的胚胎移植时，还要考虑受体羊的体况、产羔时繁重的接羔任务及产后受体羊的哺乳能力等。（5）操作技术：胚胎移植的每个操作
9、环节在实际操作中都十分复杂，都直接影响胚胎移植的成败。尤其手术操作要求熟练、稳重、轻巧、速度适宜。向宫腔内注入移植液和胚胎时速度不能过快，否则胚胎会随移植液进入输卵管而发生异位妊娠；如果速度太慢，子宫、输卵管等暴露于空气时间过长，增加污染率，同时也增加了胚胎的损伤率。术者手、臂、手术器械等对子宫的强烈刺激，对输卵管进行强拉硬拽都会产生不良影响（6）其它：受体本身的黄体发育与孕酮含量、解冻剂与脱防冻剂的类型、胚胎移植的季节、供体年龄及营养状况等因素都不同程度影响胚胎移植的成功5.胚胎移植的经济效益胚胎移植是一个技术过程复杂，各个环节环环相扣，任何一个不能出现失误的系统工程。影响胚胎移植成功率的因
10、素很多，同时，其运作成本较高。这使其应用中存在经济效益上的高风险。如果不是基于急需扩群、供体高经济价值、育种目的，一般尽量采用自然繁殖。在特殊情况下，如供种初始阶段，少量优秀个体的扩增，胚胎移植可创造较好的经济效益。6.胚胎移植的发展前景胚胎移植技术虽然已较成熟，但对不同种属、不同品种和不同个体的动物如何改善超排效果，简化技术操作过程，提高移植妊娠率方面还有很多工作要做。畜牧业的发展和动物胚胎工程技术研究的深入为胚胎移植技术提供了广阔的市场和美好的前景。绵羊胚胎移植技术的研究已经逐步由试验研究向商业化生产阶段转变。这一技术在生产中的广泛应用，充分发挥了优良绵羊品种的遗传优势，较快地实现在短时间
11、内提高绵羊的良种化程度，不仅促进养羊业的发展，也为当地经济繁荣带来广阔前景。对绵羊胚胎移植产业化进行研究，必将对肉羊新品种的引进和肉羊生产开发产生积极的推动作用。各种胚胎工程技术的研究和发展都需要胚胎移植技术作为必要的技术手段，所以动物胚胎移植技术的应用前景十分广泛第二节：胚胎移植的原理1. 胚胎移植的生理学基础2. 胚胎移植的基本原则1. 胚胎移植的生理学基础1.1 同种动物的供、受体的生殖器官的生理变化是相同的，为供体胚胎移入受体提供相同的生理环境。1.2 早期胚胎在一定时间内处于游离状态，为胚胎的收集提供了可能。1.3 受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，为胚胎在受体内的存
12、活提供了可能。1.4 供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受任何影响 2. 胚胎移植的基本原则2.1. 胚胎移植前后所处环境的一致性： 是供体和受体种属上的一致性。即二者属于同一物种，但这并不排斥种属不同但在进化史上血缘关系较近、生理和解剖特点相似个体之间胚胎移植成功的可能性。 是生理上的一致性。即受体母畜和供体母畜在发情时间上的同期性。一般相差不超过24h，否则移植成功率显著下降。 是胚胎收集和移植部位的一致性。即从供体输卵管内收集到的胚胎应该移植到受体的输卵管内，从供体子宫内收集到的胚胎应该移植到受体的子宫内。2.2. 胚胎发育的期限：从生理学的
13、角度讲，胚胎收集和移植的 期限不能超过周期黄体的寿命，最迟要在周期黄体退化之前数日以及胚胎附植之前进行。因此，胚胎收集多在发情配种后的38天内进行，受体在相同的时间内接受胚胎移植。2.3. 胚胎的质量。在胚胎移植的操作过程中，胚胎不应当受到任何不良因素(物理的、化学的、生物的)的影响，移植的胚胎须经过鉴定确认是发育正常的.第三节：胚胎移植技术程序1. 供体和受体的选择2. 同期发情和超数排卵处理3. 供体母畜的配种4. 胚胎的收集5. 胚胎的检查6.胚胎的保存与培养7.胚胎的移植8.供体和受体的术后观察1.供体与受体的选择供体羊：选择经济价值较高，应以品种优良、生产性能好；遗传性能稳定、谱系清
14、楚；体质健壮、繁殖机能旺盛，无遗传病、生殖道疾病和传染性疾病。年龄在2.56岁以内为宜；产羔历史清楚、性周期正常；产羔60天以上，经观察至少有两个以上正常发情周期的母羊。与之交配的种公羊要求：谱系清楚，检疫合格，遗传性稳定，生产性能优良，符合本品种特征，精液品质良好 。 受体羊：繁殖性能良好、发情周期正常、无繁殖机能疾病，经检疫无传染疾病，健康、膘情在7成以上；年龄在1.5-6岁之间；经观察有两个正常发情周期的母羊。2.同期发情和超数排卵处理绵羊同期发情(synchronization of estrus)是利用某些外源激素人为地控制并调整一群母羊发情周期的过程。其药物机理一是对群体母羊同时使
15、用某种激素，抑制卵巢上卵泡的生长发育，经过一定的时间后停药，使卵巢机能恢复正常，引起同期发情。其实质是延长了发情周期，推迟了发情期。二是使用性质完全不同的另一种激素，抑制黄体，加速其消退，缩短黄体期，为卵泡期提前到来创造条件。黄体退化将导致母畜发情。其实质是缩短了发情周期，使发情期提前到来。主要方法有：PG二次注射法、CIDR+PG法、MAP（甲羟孕酮）法.通常使用氟孕酮阴道海棉栓埋植或埋植CIDR，被认为是控制母羊同期发情最可靠、最准确的方法。超数排卵（superovulation）：是在母羊发情周期的适当时间，注射外源促性腺激素，使卵巢比在自然状态下有更多的卵泡发育并排卵的技术，简称超排。
16、主要应用于牛、羊，效果明显，对于多胎的猪意义不大，母马则很难产生反应。应用超排技术可使羊每次排卵由1-4个增加到10-20个或者更多。作用：发挥母畜优良繁殖潜力；促进家畜改良速度，加快遗传进展。常用的激素有FSH、LH、PMSG、hcG、PGF2、PGc和孕激素等。影响超排效果的因素造成超排效果(获卵率和可用的胚胎数) 不稳定的因素主要有两大类:一类是动物因素,包括个体和遗传的差异、生理和营养状态、开始超排的日期、季节及其它影响动物的环境因素;另一类是药物因素,包括激素的半衰期、激素制剂中的FSH/ LH 比例、给药途径、剂量和频率等常用的超排方案：（1）FSH法：FSH+PG法、CIDR+F
17、SH+PG等（2）PMSG法：PMSG+hcG或PG研究表明，PMSG超排后适时给予APMSG，可显著改善羊卵巢反应，增加可用胚胎数(武浩，1997)。（3）FSH预处理. Rejamahendran等在发情周期的第3d和第4d给予2.5 mg FSH作预处理，结果比正常FSH程序回收到的卵子多4枚(P0. 05)，每头母牛回收的优质胚胎增加1.6枚。但试验表明排卵数并未提高(Lussier, 1989) 。目前羊超排多用FSH多次注射法，超排效果稳定，一般不会出现卵巢囊肿和持续发情等现象，但多次注射费人、费力，而且易引起剂量和时间的误差。而PMSG使用方便，仅需注射1次，价格相对低廉，对动物
18、刺激性小。然而超排后残余的PMSG会导致第二次排卵波的出现，使超排个体往往存在较大的卵泡和一部分退化黄体，这些大卵泡的存在会引起体内雌激素水平增高，从而对卵子成熟、受精和胚胎的发育产生不利影响。故一般不采用PMSG对家畜进行超排处理.由于PMSG的半衰期较长，可以弥补FSH作用时间短的影响，PMSG不仅具有FSH的作用，而且也具有LH(促黄体素)的作用，由此通过FSH和PMSG的综合作用可以互取FSH和PMSG作用的方法以取得更好的试验结果(刘忠华，贺桂馨，李孝娟等，2001)，以对胚胎移植等工作做好良好的铺垫，但是应该注意实际应用中由于其他的超排因素所产生的影响，所以对于FSH和PMSG的半
19、衰期应该认真掌握，从而得到令人更加满意的试验结果。有人采取PMSG和FSH相结合的方法，用PMSG代替部分FSH进行超排处理。第1次注射FSH的同时，加注PMSG200IU显著超过了单纯使用FSH处理(岳奎忠，于元松，2000) .Pintado等(1998)用PMSG替代部分FSH，获得了和单纯使用FSH一样数量的可用胚，大大降低了超排的成本(杨梅，王旭光，施巧婷，2003).应用同一种超排方法，不同的个体之间超排结果差异较大，除了个体本身的因素外，激素的应用也起着很大的作用。激素剂量过大，卵巢上发育的卵泡数和排卵数量过多，会导致卵巢体积的异常增大和卵子接受过程的机械障碍，经输卵管伞接收到的
20、卵子数量却有限。剂量不足，则达不到预期的超排效果。杨梅等(2003)，桑润滋等(2003)等多人对激素的最佳剂量进行了研究，但由于激素的生产厂家、生产批号不同，供体的状况也有差别，因此不能得到统一的标准。Moor等(1984).提出，激素制剂中FSH/ LH的比例在刺激卵巢反应中起着重要作用。Amstrong等(1984)用FSH / LH比例最低的FSH制剂对绵羊和山羊进行超排，结果超排率和胚胎产量提高。激素注射途径的不同也影响着供体的超排反应。贵州大学羊超排方案流程发情周期内任意一天阴道埋CIDR 记为第1d第10d换第二个CIDR第16d、17d、18d，早晚分别注射FSH（间隔12h）
21、，剂量逐步递减第19d取CIDR，早晚分别注射FSH 24-48h发情，配种或输精 记为0d第4d注射progestin第6d冲采胚3.供体母畜的配种超数排卵的母羊可以使用自然交配或人工授精配种，人工授精胚胎可用率略低于自然交配，一般建议以自然交配为好，在种公羊不够的条件下，可以采用采集鲜精进行人工授精，配种前最好进行精液品质检查，对于精液活力差、浓度太稀的种公羊不建议使用。自然交配以试情发情后配2次，每次间隔12h，为保险起见，可以配种至不接受爬跨为止，每次配种完成后要仔细检查是否交配成功。人工授精要严格按照操作规程进行，一般每只羊输0.2ml，无菌操作很关键，每只羊输2次，每次间隔12h，
22、也可以输精至不接受爬跨为止。在配种时注射半支 A3有助于卵母细胞集中排出受精，可提高胚胎发育的同期率。4.胚胎的收集1.胚胎的收集是指用冲卵液将胚胎从生殖道冲出，收集在器皿中的过程。2.冲卵液：现在多采用PBS、Brinsters medium-3、SOF、Whittens medium、Hams F-10及TCM199等，在使用时一般需含1% 5% 的犊牛血清或0.3%1%的牛血清白蛋白。3.收集时间：以母羊接受爬跨发情的当天作为发情的第0d，在第6d进行胚胎移植在胚胎收集，可获得较多的致密桑葚胚，第7d多为囊胚或扩张囊胚、孵化囊胚。第5d以16-32细胞期、桑葚胚为主，一般第6d胚胎移植受
23、胎率高于其他天。收集时间不应早于排卵后的第一天即最早要发生第一卵裂之后，否则不易辨别是卵子是否受精。一般在配种后38天。4.收集方法：手术法和非手术法手术法收集：输卵管冲胚：供体羊发情后2-3天，就可采用输卵管冲胚法，分顺向冲胚和逆向冲胚；子宫角冲胚：供体羊发情后6-7.5天，采用子宫法采卵。非手术法收集：主要用于大家畜在配种后6-8天进行。分二路法和三路法。手术法采胚：输卵管冲胚：将冲胚管一端由输卵管伞部喇叭口插入约2-3cm 深处（ 打活结或用钝圆的夹子固定），另一侧接集卵皿。用注射器吸取37 的冲卵液5-19ml，在子宫角靠近输卵管的部位，将针头朝输卵管方向扎入，一只手的手指在针头后方捏
24、紧子宫角，另一只手推注射器，冲卵液由宫管结合部流入输卵管，经输卵管流入集卵皿。此法胚胎回收率高，冲卵液用量少，检卵省时间。但容易造成输卵管及伞部粘连。子宫冲胚：将子宫暴露于创口表面后，用套有胶管的肠钳夹在子宫角分叉处，注射器吸入冲卵液20-30ml（一侧用50-60ml），冲卵针头（ 钝形）从子宫角尖端插入，当确认针头在管腔内，进退通畅时，将硅胶管连接于注射器上，推注冲卵液。当子宫角膨胀时，将回收卵针头从肠钳基部的上迅速扎入，冲卵液经硅胶管收集于集卵皿内，最后用两手拇指和食指将子宫捋一遍。另一侧子宫角用同样的方法冲胚。进针时避免损伤血管，推注冲卵液时力量和速度不宜太快。子宫法对输卵管损伤很小，
25、但回收率较输卵管法低，用液较多，检卵时用的时间较多。非手术法采胚：常用于大家畜的胚胎收集如牛的非手术法收集胚胎，将冲洗液通过内管注入子宫角内，然后到处冲洗液，外端前段连接气囊，当将冲卵器插入子宫内时，充气使气囊胀大，堵住子宫经内口以免冲洗液经子宫颈流出。只能当胚胎进入子宫角后进行。5.胚胎的检查收集到的冲洗液，须静置，带胚胎下沉后，移去上层液，在放解剖镜下，检查胚胎数量和发育情况，开始捡胚。将胚胎移植培养液中。胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别。主要分：A、B、C、D四级。A、B级胚胎可以冷冻保存。6.胚胎保存保存是使胚胎在体外一定条件下（降温）停止发育
26、，延长其在体外生存时间，当需要时，升温后可进行移植胚胎常规保存：采集到的胚胎，如果不能立即移植给受体羊，可经短期或长期保存。生产上进行鲜胚移植时，一般上午采集的胚胎，下午移植，或将胚胎净化后，在胚胎保存液（ 国产或进口）中室温条件下短期培养4-5 天对胚胎的存活影响不大。据报导，将绵羊胚胎在0-13 、保存10 天仍然能移植成功（ 谭丽玲，1978），在冰箱中4-6 . 的条件下保存- 天，胚胎存活率也很理想（ 丁红，1995）。胚胎的冷冻保存：目前应用胚胎冷冻技术已经能够长期保存绵羊胚胎，并向着实用易行的方向发展。常用的绵羊胚胎冷冻方法有：慢速冷冻快速冷冻法一步细管法玻璃化冷冻三步平衡冷冻法
27、7.胚胎的移植移植时间：鲜胚移植供体羊与受体羊要求发情同步，即供体羊和受体羊同一天发情供体羊配种，受体羊发情待移植，鲜胚移植待发情后4860小时进行手术移植（早则胚胎细胞分裂不明显、卵巢黄体出血多易造成粘连；迟则胚胎进入子宫角），供、受体羊同步率不能超过12小时，否则影响受胎率。 受体羊的手术部位、方法与取卵时相同。移植分为输卵管移植和子宫移植两种。移植部位：一般把受精卵和桑椹胚移植到输卵管，把致密桑椹胚阶段以后的胚胎移植到子宫角前1/3处。每只受体移植胚胎数鲜胚1-2 枚，解冻胚3-4 枚，观察受体卵，把胚胎移入有黄体一侧的子宫角（1）手术法移植：在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察
28、黄体发育情况，用注射器或移植管将胚胎注入到同侧子宫角上端或输卵管壶腹部内（以胚胎发育阶段而定）只需吸取少量的冲洗液连同胚胎一起注入（2）非手术移植：主要对于大家畜如牛的非手术移植，将一只手深入直肠，先检查黄体位于哪一侧和发育情况，后握住子宫颈（与人工受精操作一样），另一只手将移植管插入与黄体同侧的子宫角内，注入胚胎。8.供受体的护理与观察（1）术后供受体的抗炎处理（2）健康状况检查（3）返情状况的检查（4）妊娠检查及妊娠确定术后供、受体羊放人羊舍后，观察24 h。24 h后可随群放牧，细心照料。供体羊待9 d后用PG进行消换处理，每只羊2 mL，发情后配种。受体羊对复情的进行配种，对未复情的确
29、定妊娠后，除了加强饲养管理和护理外，避免应激，做好保胎防流工作。引用文献1郭志勤等编着.家畜胚胎工程M.中国科学技术出版社，1998: 362 Sugie T. Successful transfer of a fertilized bovine egg by non-surgical techniques J.J Reprod Fertil,1965, 10: 1972013 Brand A, Drost M. Embryo collection by non-surgical methods. Betteridge KJ (Ed.),EmbryoTransfer in Farm Anima
30、ls: A Review of Techniques and ApplicationsC. Monograph No.16Canada Department of Agriculture, Ottawa, 19774 Rhind SM, Robinson JJ, Chesworth JM, etc. Effects of season, lactation and plane of nutrition on the reproductive performance and associated plasma LJ-I and progesterone profiles in hormonall
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