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1、精选优质文档-倾情为你奉上斑马鱼胚胎整体原位杂交(Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos)北京大学遗传与发育生物学实验室整理者：肖安 版本：V6.22 Build 2006-8-17专心-专注-专业说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。在整个实验中应当注意：(1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过
2、程，必须严格防止污染。操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA在常温或37放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。实验间隙中RNA放置在-20，过夜或更长时间保存在-80。(2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。避免漏加溶液。(3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。(4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。吸时动作要轻。任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直
3、放置让胚胎沉降一会以免吸走。(5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。第一天以下操作需戴乳胶手套。1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。1.1 吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。稀释时间宁长勿短。特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。1.2 PBST处理5分钟，两次。2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。2.1 用蛋白酶K的PBST溶液(
4、在管中原有的约1mLPBST中加入1uL10mg/mL的蛋白酶K，终浓度10ug/mL)常温消化，时间可参考下表：胚胎时期处理时间尾牙期(tail bud stage)前不处理5体节(5 somites, 5s)酌情处理6s30秒16s1分钟18s, 24h2分钟48h(H2O2脱色)4分钟3d(H2O2脱色)10分钟48h(PTU处理)30分钟3d(PTU处理)45分钟5d(PTU处理)1小时消化的目的是使探针更容易进入组织中。应根据胚胎质量、以前原位杂交结果适当增减时间。注意双氧水脱色的胚胎受损害较大，蛋白酶K处理时间应大大短于培育时加入PTU阻止色素生长的胚胎。理论上换新的酶和新胚胎都应
5、该重试处理时间。以下操作室温进行，注意溶液预热。2.2 消化时间到后，先尽快用PBST暂时漂洗，然后PBST洗5分钟，一到两次。在PBST洗后或下一步多聚甲醛固定后可以按照探针将胚胎分管和混合，注意同一管中的胚胎发育时期不宜相隔过近，以免最后观察结果时难以分辨。但若相隔过远，后面的染色时间可能会有很大差异，并且处于发育较早期的胚胎破裂时卵黄可能污染发育较晚期的胚胎。每一时期每一探针需15枚左右(发育早期的胚胎在实验中容易损坏，宜多取一些)。若做正负对照，正对照用已明确的Marker基因探针(反义RNA链)，或者对胚胎进行双染。负对照使用正义RNA链，或者不加探针(如粗略筛选时)。注意及时写上新
6、的标签编号并记录下每个编号对应的各胚胎时期。2.3 4%多聚甲醛(paraformaldehyde, para)固定20分钟。提前解冻，每次实验都尽量用一管新的多聚甲醛，避免RNase污染。未使用完部分可用于固定胚胎。用于原位杂交的胚胎都使用多聚甲醛固定。甲醛苦味酸混合液固定胚胎虽然能更好的保持形态，但将破坏胚胎抗原性，导致零结果。2.4 PBST洗5分钟，两次。以上两步用PBST洗涤也可改为PBT，后者含有小牛血清，对胚胎保护更好。以下65的操作步骤在水浴箱(water bath)或杂交炉(hybridization oven)中进行，注意溶液预热。3 预杂交(Prehybridizatio
7、n)。加入500uL HYB，65预杂交至少4小时。4 杂交(Hybridization)。4.1 RNA探针(RNA probe)以3ng/uL浓度溶于HYB，72温育5分钟，再冰上放置以破坏形成的可能妨碍杂交的二级结构。4.2 吸去胚胎管中的HYB，加入约含至少300ng探针的溶液。实际探针浓度应反复调整至合适。通常加入体积为200uL，不得少于100uL，否则胚胎难以充分接触溶液。4.3 65温育过夜或大约12小时。杂交温度一定不得超过72，否则探针被破坏。温度越低，杂交程度越好，但背景可能越深。这是影响最终结果最重要的决定因素之一。杂交时间不宜超过太多，否则背景容易过深。第二天5 去除
8、探针(Probe Removal)。5.1 吸去探针溶液并重新保存于-20。一般而言探针可重复使用十次左右，能重复使用次数取决于探针质量。使用越频繁，得到的信号越弱。探针的HYB溶液中在-80下至少可保存一年。以下步骤不用戴乳胶手套操作。以下操作步骤仍在65进行，注意溶液预热。5.2 甲酰胺(formamide)溶于SSCT的溶液(最终浓度甲酰胺50%，SSCT 2*)洗30分钟，两次。5.3 2*SSCT洗25分钟。5.4 0.2*SSCT洗30分钟，两次。通常在试验时洗涤到此为止，若背景过深可继续一至多步洗涤，如0.1*SSCT65或室温洗涤15分钟，再0.05*SSCT室温洗涤15分钟。
9、洗涤的目的是洗去残留未特异性结合的探针，留下特异性结合的探针，较高温度(65)或较稀浓度SSCT洗涤可洗得更干净，在降低背景同时也容易使杂交上的探针被洗脱，这是影响最终结果的最重要因素之一。时间要严格控制。实际需要反复探索适合于不同探针、不同时期胚胎的具体条件和时间。第一次试验可只到0.2*SSCT洗涤。从去除探针开始的步骤需要特别保护胚胎，因为胚胎此时非常透明(处于发育较晚期的尤其如此，可能是卵黄较少的缘故)。吸取溶液时先将管竖直，待胚胎沉到管底后再吸溶液，并注意枪头中有没有吸走胚胎。以下步骤(6-7)为针对双染的第一步或针对荧光素标记探针Fast Red染色。若不做此步可直接跳至8。8 地
10、高辛抗体检测(Anti-Dig Detection)8.1 慢摇下用MABT洗5分钟，两次。8.2 慢摇下用阻断溶液(blocking solution，参见现配溶液)阻断一小时。此步可以在解剖镜下将损坏的胚胎清除。若为双染，第二次阻断可略去。8.3 加入新用阻断溶液3000倍稀释的地高辛抗体(digitin antibody, anti-dig)，每管至少加入800uL，4下摇动过夜。注意用于稀释抗体的溶液4预冷，避免抗体降解。抗体不一定是单抗，有可能与胚胎中原有的其它抗原结合，导致背景过深。在对实验结果精度要求较高的情况下，可将抗体与待原位杂交时期的胚胎或胚胎的丙酮保存粉末混合处理(参见现
11、配溶液)，或者加入适当的阻断试剂。第四天以下步骤最好使用另一摇床或停止加热的杂交炉，从4中取出的摇床要等内部凝结的水汽蒸发完后才能再次使用，以保护电路。第四天同。9 碱性磷酸酶底物染色(AP Substrate Stain)9.1 加入到1%热处理羔羊血清(heat treated lamb serum)的MABT溶液中，室温洗25分钟。9.2 MABT洗25分钟，三次。9.3 检测缓冲液(Detection Buffer，参见现配溶液)洗5分钟，二次。胚胎转移到24孔板。在转移之前可再挑一次损坏的胚胎。24孔板孔内不能有灰尘，解剖镜下检查并用脱脂棉蘸乙醇擦干净，用检测缓冲液冲洗两次，一般使用
12、一两次即抛弃。各孔盖上标好探针名。9.4 加入至少300uL AP底物染色缓冲液(参见现配溶液)，室温温育，金属箔片包裹避光。每30分钟检查一次染色情况。万一需要过夜不便检查，4保存第二天再室温放置并检查。尽量避免如此以防染色过度。若染色液变色，说明已光照失效，应适当补充染色液。温度低可以减缓酶促反应速度，而温度高染色快，但会使背景加深。9.5 当目标着色出现后，用PBS洗5分钟，两次，以停止反应。此处PBS和杂交前使用的PBS分开，不加吐温以免干扰。若同一孔中的不同时期胚胎染色情况不一致，可以分开分别终止。10 照相(Photograph)10.1 4%多聚甲醛PBS溶液固定，保存于4。地高
13、辛探针杂交胚胎长期保存可依次用30%, 50%, 70%MeOH的PBS溶液处理后转移到MeOH中，4或-20保存；并不时检查更换变色的MeOH。管的侧面和盖上注明胚胎品系、时期、探针、日期。MeOH可溶解碱性磷酸酶非特异性着色和部分特异性着色，因此保存的胚胎颜色将逐渐变浅；而Fast Red着色在MeOH中将全部脱落，只能保存于多聚甲醛。10.2 照相前将胚胎用用30%, 50%, 70%甘油的PBS溶液处理后转移到甘油中，照相后再梯度转移回4%多聚甲醛或MeOH中。不需保留可丢弃。现配溶液(仅需稀释或混合者略)溶液名后附加的T表示吐温(tween)，用前加入，浓度约为0.1%。吐温的作用是
14、使胚胎不易粘附在枪头内壁上。由于吐温量少且较粘稠，吸取的时候要多等一会让其上升至枪头内，加入后在溶液中吹吸几次。(1)丙酮粉末处理抗体溶液每管800uL抗体溶液：取充分混匀的质量百分比约1%的丙酮鱼粉悬浊液11uL，4000rcf离心2分钟，去除上清。加入500uLPBT洗涤，4000rcf离心2分钟，去除上清。离心速度和时间须适当调整，既要保证沉淀上清分离，又要避免沉淀结合过于紧密无法重悬。加入80uLPBT，震荡成悬浊液。加入羔羊血清至2%终浓度(1.6uL)。加入1/300的抗体，即得10*抗体溶液。使用前用阻断溶液稀释至1*，即1/3000抗体溶液。(2)阻断溶液(blocking s
15、olution)每1mL 10%热处理羔羊血清或100uL血清原液；2mL 10%阻断试剂(blocking reagent)；用MABT补至10mL。1%热处理羔羊血清的MABT溶液类似，仅不加阻断试剂；可共用同一容器。两种溶液若剩余均须丢弃，防止血清变质。(3)检测缓冲液(detection buffer)又称AP缓冲液(AP Buffer)每50mL溶液：100mM NaCl(1mL 5M)；50mM MgCl2(2.5mL 1M)；100mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl(5mL 1M，pH9.5)；0.1% Tween-20；1mM 左旋咪唑(levamisole)(50uL
16、 1M)。左旋咪唑的作用是抑制胚胎组织内源性碱性磷酸酶，若不加左旋咪唑，可以增强信号，不过同时背景也会增强。而若最终结果染色过浅，可能是左旋咪唑抑制了抗体结合碱性磷酸酶，应调整浓度。(4)Fast Red染色液每片Fast Red片剂加到2mL 0.1M Tris-HCl(pH8.2)，加入0.1%吐温。锡箔包裹避光剧烈摇动溶解，用注射器过滤板过滤。(5)碱性磷酸酶底物染色缓冲液(AP substrate staining buffer)每1mL 检测缓冲液加入：4.5uL NBT3.5uL BCIP又称X-磷酸盐(X-phosphate)加入左旋咪唑(levamisol)至终浓度5mM(再加
17、入4uL 1M)两种染色液配制后均需避光。保存溶液若无说明，溶液4保存。HYB及之前的溶液用DEPC水配制，之后的溶液可用去离子水配制。(1)DEPC水(DEPC water)去离子水(dH2O)在通风橱中加入0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)，37磁力搅拌过夜。灭菌，用来配试剂；或不灭菌，用来泡容器。(2)10*PBS每1L溶液：1.37M(mol/L的简写) NaCl(80g)；27mM KCl(2g)；43mM Na2HPO412H2O(15.4g)或无水Na2HPO4 (6.1g)；14mM KH2PO4(1.9g)；DEPC水或dH2O稀释到1L，调节pH为7.3。或直接用购买的PBS
18、袋装固体粉末按说明溶解于DEPC水或dH2O得1*PBS。需用DEPC水和dH2O配置两种PBS。(3)PBT(洗涤用PBST替代品，丙酮粉末处理抗体溶剂，可选)每1L溶液：1*PBS(100mL 10*PBS)；0.2% 小牛血清(BSA，2g BSA-V)；0.1% Tween。不可用于稀释甲醇，否则BSA变性。(4)4%多聚甲醛(paraformaldehyde，para)多聚甲醛以4%浓度(2g/50mL)溶于1*PBS，加热到65，均匀混合使其溶解，放置约40分钟，-20保存。调PH到7.4才能溶解。(5)HYB每100mL溶液：50%甲酰胺(formamide，Sigma公司产品，
19、超纯级)(50mL)；5*SSC(25mL 20*SSC)；50ug/mL肝素(heparin)(100uL 50mg/mL)；5mM EDTA(1mL 0.5M，PH8.0)；0.05mg/mL核糖体RNA(ribosomal RNA，Sigma 公司产品)(100uL 50mg/mL)；920uL 1M柠檬酸(citric acid)；0.1% Tween。-20保存。甲酰胺浓度增加将使探针更不易结合。(6)20*SSC每1L溶液：3M NaCl(175.3g)；0.3M柠檬酸钠(Na citrate)(88g二水合物)；DEPC水或dH2O稀释到1L，调节pH为7.0。最好用DEPC水和
20、dH2O配置两种，前者用于配HYB。(7)MAB100mM顺丁烯二酸(马来酸，maleic acid，Sigma公司产品)(11.69g/L)；150mM NaCl(8.89g/L)；用NaOH颗粒或浓溶液调节pH至7.5。(8)热处理羔羊血清(heat treated lamb serum)57化开，分装，-20保存。(9)10%阻断试剂(blocking reagent)4g/36mL溶于MAB，灭菌，-20保存。(10)NBT(四唑硝基靛蓝，nitro blue tetrazolium)50mg NBT 溶于0.7mL二甲基甲酰胺(dimethyl formamide)和0.3mL水中，
21、分装保存。常用保存在-20，长期保存在-80。(11)BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐，5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate；又称X-磷酸盐，X-phosphate)50mg BCIP溶于1mL二甲基甲酰胺(dimethyl formamide)。避光保存，常用保存在-20，长期保存在-80。NBT和BCIP亦有最终浓度的成品溶液出售(Promega公司)。(12)其他溶液0.5M EDTA，PH8.0；1M柠檬酸；50mg/mL肝素；50mg/mL核糖体RNA；均DEPC配置，用于配置HYB。5M NaCl；1M MgCl2；1M Tris-HC
22、l，pH9.5；1M左旋咪唑；用于配置检测缓冲液。0.1M 或 1M Tris-HCl，pH8.2，用于配置Fast Red染色液。0.1M 甘氨酸-盐酸(glycine-HCl)，pH2.2，用于终止Fast Red 显色。附：探针合成1 带有目的插入片段的质粒线性化。选择处于插入片段正义链5端酶切位点的酶(合成反义RNA探针)或3端酶切位点的酶(合成正义RNA对照)。电泳检验。一般取不多于10uL酶，使用100uL或200uL体系，线性化产物电泳检验需要用原质粒稀释液比照。注意酶切位点和RNA聚合酶的选择：从一端切开，选用另一端的启动序列开始转录。以下使用酚、氯仿的步骤在通风橱中操作。2
23、线性化产物纯化。纯化前稀释到200-500uL，以减少操作中的损失。2.1 加入等体积Tris饱和酚，震荡混匀，放置10分钟，4，12000rcf离心10分钟。小心吸出上层水相至另一管中。取上清操作最好不使用1000uL移液器，以免动作过大。切勿弄混界面。下同。吸出水相时不可带入有机相，界面处的蛋白也不能吸上来。2.2 加入等体积的氯仿:异戊醇=24:1的混合液，震荡混匀，放置10分钟，4，12000rcf离心10分钟。小心吸出上层水相至另一管中。不可带入有机相。以上两步有机溶剂体积可略少，过多可能溶解部分质粒DNA。2.3 加入1/10体积的3M乙酸钠，2倍体积的乙醇，震荡混匀，-20充分放
24、置沉淀。沉淀时间从半小时到过夜不等。2.4 4，12000rcf离心10分钟，弃去上清。2.5 加入300-500uL预冷的70%乙醇洗涤，4，12000rcf离心2分钟，弃去上清，并用真空泵吸干液体，37烘几分钟至无酒精味。此步谨防真空泵吸走质粒。温箱中放置时间不宜太长，否则质粒难以溶解。2.6 加入约30uLddH2O，震荡溶解质粒DNA。0.5uL左右电泳检验。此步电泳检验可以不用原质粒稀释液对照。3 合成RNA探针。3.1 20uL反应体系中含：5*转录Buffer 4uL；100mM DTT(二硫苏糖醇，维持还原性体系保护酶中巯基) 2uL；DNA模版1-10uL(尽量达到1ug)；
25、用于补齐20uL体系的适量DEPC水；40U/uL Rnasin(Promega公司的RNA酶抑制剂)0.5uL；10*NTP标记混合物(Roche公司产品)2uL；17U/uL RNA聚合酶(polymerase)1.5uL。37至少温育2小时，视情况可适当延长1-2小时，中可补加约1uL聚合酶后。若模版DNA放置时间太久或为PCR产物应适当增加用量。原位杂交探针模版一般应长于200bp才能比较特异性的结合和方便提纯，通常不超过2000bp。NTP标记混合物中，只有约1/3的UTP是被标记的。用于未知基因原位杂交一般选用地高辛(digitin)标记UTP，用于双染的Marker基因一般选用荧
26、光素(Fluorencein)标记UTP。反应体系中通常先加入水溶液体系的Buffer和DTT，再加入Rnasin，然后为DNA、水，最后加入冰上化冻的NTP和聚合酶，以防环境RNase干扰和聚合酶失活。3.2 电泳检验产物。以下步骤包括离心均为常温操作，否则产物将和柱结合无法洗下；宜尽快完成。4 提纯探针(RNeasy Mini试剂盒法)。4.1 用RNase-free水将样品稀释到100uL，加入350uL含1%-巯基乙醇的RLT溶液，混匀。-巯基乙醇为易挥发神经毒剂，在通风橱内操作。4.2 加入250uL乙醇，吹吸混匀。4.3 将溶液加至带有收集管的RNeasy Mini柱，8000rc
27、f以上离心30秒，弃去溶液和收集管。4.4 柱放入另一个收集管(试剂盒提供)，加入500uL1:4的RPE乙醇溶液，8000rcf以上离心30秒，弃去溶液。4.5 再加入500uL1:4RPE乙醇溶液，8000rcf以上离心2min，弃去溶液和收集管。此步后可将柱放入另一离心管，用最大速度离心1分钟以除尽液体。4.6 柱放入一1.5mL离心管(试剂盒提供)，加入20-40uL RNase-free水，轻关上盖，稍等一会。8000rcf以上离心1分钟。用离心液加回柱中再次溶解，再次离心。4.7 电泳检验产物。提纯探针是为了去除多余的游离地高辛或荧光素结合UTP，后者在原位杂交SSCT洗脱时无法洗去，容易造成染色无特异性。