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1、精选优质文档-倾情为你奉上 研究生学位论文开题报告学 号：姓 名：马丽娟导师姓名：黄永清研究方向： .口腔颌面外科论文题目：MAFB基因多态性在宁夏人群中与非综合征型唇腭裂的相关性研究院（系）：口腔医学院入学时间：2011年 9月 5日开题时间： 2012年12月18日 二 一二 年 十二 月 十八 日一、立论依据（包括研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）1、选题背景 唇腭裂是人类最常见的一种出生缺陷,其发病率在1/5001/1000之间, 不同种族和地域发病率有很大差异1, 其中美洲印第安人与亚洲人的发病率最高，约1/500 2，高加索人居中，约1/10 00 ，非洲人最低
2、，约1/2 50 0 ，我国发病率为1.82/10003,在我国出生缺陷的发生率中占第一位或第二位, 在宁夏2007年婴儿出生缺陷的发生率中占第一位4，发病率为2.19/1000。 唇腭裂患者不仅存在外形上的缺陷，其饮食、语言等功能也伴有不同程度的障碍，常常造成性格缺陷，影响正常的社会交往，降低生活质量，又因其治疗程序复杂、周期漫长、花费大，给家庭和社会带来沉重负担，严重影响了出生人口素质，因此寻找该病的病因, 进而找到有效的预防手段显得非常重要。 根据全身是否伴发其他畸形,唇腭裂可以分为非综合征型唇裂伴或不伴腭裂 ( non-syndromic cleft lip with or witho
3、ut cleft palate, NSCL/P)和综合征型唇腭裂。大约有20%的唇腭裂与已经发现的400多种综合征有关,这些综合征基本符合孟德尔单基因病遗传模式。大量研究表明NSCL/P 病因是多因素的，可能由某些遗传易感因子和环境危险因子暴露所引起5-7。Ardinger 等8 报道了第1个唇腭裂关联基因TGF-，至今已有20 余年。随着人类单倍型图谱的完成，单核苷酸多态性( sin2gle nucleotide polymorphism, SNP), 即单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性, 因其数量众多和易检测性,成为新的第三代遗传标记。SNPs被认为是最重要的人类基因组变异形式,人
4、类基因组中至少存在1千万个SNPs，平均每300个核苷酸内就有一个SNP,是造成正常表型个体间差异的主要原因9。 很多涉及NSCL/P 遗传学病因的候选基因分子流行病学研究重复性很差，表明NSCL/P 是一种具有复杂遗传异质性病因的疾病。所以，在相对单一遗传学背景的人群中去验证GWAS 研究结果，对于鉴定该人群特有的NSCL/P 易感基因十分必要,目前基因的筛选、定位以及研究分析方法仍然是NSCL/P病因学的研究难点和热点 。 2.国内外研究现状 人类对基因组变异的认识也在逐步深入。1986年,人类基因组的第一个完整的限制性片段长度多态 (restriction fragment length
5、 polymorphism, RFLP)图谱绘制完成,这是人类的第一张分子遗传图谱,标志着人类疾病发生机制的遗传学研究进入了一个新的阶段。而后, 微卫星位点(short tandem repeat, STR)代替了RFLP。此时, 基于家系连锁分析的疾病遗传学机制研究占据了统治地位。1996年, Risch和Merikangas指出, 通过对一般人群进行病例-对照研究,即关联分析,对捕获变异基因具有更高的效力，因而提出了构建人类基因所有变异图谱的全球计划,人类单倍型图谱计划得以启动 目前各种遗传连锁和关联研究，包括全基因组关联分析（genomewideassociation study， GW
6、AS）报道了越来越多的候选基因和染色体区域，如IRF6、FOXE1、BCL3、MYH9、SUMO1、MSX1 和染色体1p22、8q24、10q25、17q22、20q12 等10-14。 2010年Terri H Beaty 等15在多个人群（包括欧洲，亚洲和中国人群）的多中心合作的1965个核心家系样本的GWAS（Illumina HumanHap550 BeadChip）研究也证实了IRF6基因和8q24.21区段与NSCL/P致病有很强相关性。同时还得出了MAFB和ABCA4两个基因与NSCL/P致病有很强相关性。MAFB基因又称为KRML基因，位于20q12，编码亮氨酸拉链转录因子，
7、此因子不仅在红细胞系的生成调节过程中扮演者重要的作用，还作为引起巨噬细胞活化因子表达骨髓瘤细胞的癌基因16.17。动物实验同样表明MAFB 基因可能参与鼠的颅面外胚层发育。Beaty 等18 的原位杂交实验检测到MAFB 基因的mRNA 和蛋白质信号在孕13.5 14.5 d 胚鼠颚板上皮细胞强表达，推测其可能参与了颚板融合过程。假设某些个体存在由SNP 介导的MAFB 基因单倍不足，则可能导致颚板融合障碍，进而导致NSCL/P 发生。GWAS扫描发现在MAFB整个基因内或其附近的237个SNP中有6个SNP（rs，rs，rs，rs，rs，rs）达到了统计学意义（ p5*10.8）。rs在MA
8、FB基因的下游区，外显子测序发现了一个错义突变H131Q,其影响了蛋白结构功能15 Yuan 等19 在拉丁美洲人群重复源GWAS 研究中也证实了另外2 个与rs 存在强连锁的位点rs 和rs，与NSCL/P 存在阳性关联。2011年5月何运辅研究发现华南汉族人群中MAFB SNPs rs 、rs1 78 20943 和rs 以及IRF6 SNP rs 与NSCL/P的发病有显著关联。这些研究结果均表明MAFB 基因是一个可靠的NSCL/P候选基因。 ：我国的人口基数大，唇腭裂患者数量也多，这既是一个有利于研究的条件，也是一个需要解决的问题。随着现在微观领域技术的不断进步，NSCL/P的基因研
9、究已经取得了一定的成果，目前的易感基因一个个被证实，并且新的易感基因也在不断被发现，所以在国内外许多机构、学者都致力于这方面的研究，由于唇腭裂病因的复杂性、遗传模式的不确定性、不同地区甚至不同表型NSCL/P的候选基因座差异性，使研究结果重复性差，出现较多分歧，有的甚至出现背离。这仍是一个亟待解决的问题本研究旨在了解中国宁夏地区回汉族人群中MAFB（rs.rs.rs.rs）与NSCL/P的相关性，探讨在宁夏地区回汉族人群中NSCL/P 发病的可能作用，同时也为宁夏地区人群基因数据库积累资料，不断完善和发展其在唇腭裂发病机制，为临床基因诊断提供理论依据，以及为唇腭裂的产前诊断和预防提供科学依据，
10、对有唇腭裂病人的家庭提供有效遗传咨询，最终达到降低唇腭裂发生率的目的。 参考文献 1.Harville ,E.W.,Wilcox ,A.J.,Lie ,R.T.,etal.,Epidemiology of cleft pa late alone and cleft palate with accompanying defects .Eur JE pidemiol ,2007 .22 (6):p.38 9-95 2.Cooper,M.E.,Ratay J.S.and Marazita M.L.,Asianral-facialcleftbir th prevalence.Cleft Palate
11、Craniofac J,2006.43(5):p.580-9.3黄洪章.唇腭裂病因学研究的新进展.口腔颌面外科杂志, 2007, 17 (3) : 201 - 204.4 Zhou Hou-De LiXiao-Ling Li Gui-Yuan. The reasearch development of Single nucleotide polymorphism. Foreign Med Sci Pathophysial Clin Med ，2003，23(5):4444475 Vieira AR. Unraveling human cleft lip and palate research.
12、 J Dent Res,2008, 87(2): 119-125.6 Murray CJ. Gene/environment causes of cleft lip and/or palate. ClinGenet, 2002, 61(4): 248-256.7 Dixon MJ, Marazita ML, Beaty TH, et al. Cleft lip and palate: understandinggenetic and environmental infl uences. Nat Rev Genet, 2011,12(3): 167-178.（可续页） 8 Ardinger HH
13、, Buetow KH, Bell GI, et al. Association of genetic variation of the transforming growth factor-alpha gene with cleft lip and palate. Am J Hum Genet, 1989, 45(3): 348-353.9.Lander ES, Linton LM, Birren B, et al.Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001, 409(6822): 860921. 10
14、Zucchero TM, Cooper ME, Maher BS, et al. Interferon regulatory factor6 (IRF6) gene variants and the risk of isolated cleft lip or palate. NEngl J Med, 2004, 351(8): 769-780.11 Birnbaum S, Ludwig KU, Reutter H, et al. Key susceptibility locus fornonsyndromic cleft lip with or without cleft palate on
15、chromosome 8q24. Nat Genet, 2009, 41(4): 473-477.12 Mangold E, Ludwig KU, Birnbaum S, et al. Genome-wide association study identifi es two susceptibility loci for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate. Nat Genet, 2010, 42(1): 24-26.13 Alkuraya FS, Saadi I, Lund JJ, et al. SUMO1 haploin
16、suffi ciency leads tocleft lip and palate. Science, 2006, 313(5794): 1751.14 Mangold E, Ludwig KU, Nthen MM. Breakthroughs in the genetics oforofacial clefting. Trends Mol Med, 2011, 17(12): 725-733.15 Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, et al. A genome-wide association study of cleft lip with and wit
17、hout cleft palate identifies risk variants near MAFB and ABCA4. Nat Genet. 2010,42(6): 525529.16Gemelli C, Montanari M, Tenedini E, Zanocco Marani T, Vignudelli T, SienaM, Zini R, Salati S, Tagliaco E,Manfredini R, Grande A, Ferrari S. Virally mediated MafB transduction induces the monocyte commitme
18、nt of human CD34 hematopoietic stem/progenitor cells. Cell Death Differ 2006. 13:16861696.19. Van Stralen E, van de Wetering M, Agnelli L, Neri A, Clevers HC, Bast BJ. Identication of primaryMAFB target genes inmultiplemyeloma. Exp Hematol 2009. 37:7886.17 Van Stralen E, van de Wetering M, Agnelli L
19、, Neri A, Clevers HC, Bast BJ. Identication of primaryMAFB target genes inmultiplemyeloma. Exp Hematol 2009. 37:7886.18 Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, et al. A genome-wide associationstudy of cleft lip with and without cleft palate identifi es risk variantsnear MAFB and ABCA4. Nat Genet, 2010, 42
20、(6): 525-529. 19 Yuan Q, Blanton SH, Hecht JT. Association of ABCA4 and MAFB withnon-syndromic cleft lip with or without cleft palate. Am J Med GenetA, 2011, 155A(6): 1469-1471.二、研究方案1、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题一）、研究内容：(1)标本收集收集300个宁夏地区非综合征型唇腭裂(NSCLP)核心家系【包括大家系和3人核心家系（双亲和患者）】以及300名匹配的正常对照组。按知情同意的原则，填写知情同意书，
21、签字。并详细填写唇腭裂遗传流行病学研究问卷及临床检查表。标本来自宁夏医科大学附属医院以及宁夏各地方的协作医院。(2)进行SNPs位点筛选。(3)对已经确定的候选基因SNPs位点进行基因分型，应用病例对照和传递不平衡检验（transmitted disquilibrium test,TDT）的方法，研究确定的SNPs位点等位基因和单倍型与NSCL/P的相关性。二）、研究目标：通过应用病例对照研究和传递不平衡检验（TDT），比较候选基因SNPs位点等位基因频率的显著性差异，以进一步证实和精确定位与宁夏地区NSCL/P有相关性的SNPs位点，并计算有意义SNPs位点对宁夏地区人群NSCL/P发病的贡
22、献率，发现宁夏地区回汉族人群中这些位点与NSCL/P的相关性，同时也为宁夏地区人群基因数据库积累资料，不断完善和发展其在唇腭裂发病机制，为临床基因诊断提供理论依据。三）、拟解决的关键问题：（1）样本的收集【包括大家系和3人核心家系】及问卷表填写的认真和完善是本研究的根本保证。（2）候选基因有意义SNPs位点的筛选以及基因分型方法的选择和结果的可靠性。（3）TaqMan SNP基因分型技术的学习及掌握。（4）用于遗传统计学分析的软件及其正确的应用。2、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析（1）标本的采集：按知情同意的原则，填写知情同意书，签字。详细填写唇腭裂遗传流行病学研究问卷及临床
23、检查表。采集外周静脉血5ml,加EDTA抗凝剂，20C保存备用。临床鉴别综合征型唇腭裂（SCL/P）和非综合征型唇腭裂（NSCL/P）病例。并进行常规项目的统计、分析，如：NSCL/P类型、性别、年龄，民族及母亲怀孕起始三个月吸烟（分为主动和被动吸烟）、饮酒，维生素补充及使用药物史等流行病学资料。病例组纳入标准 患儿为先天性非综合征型唇腭裂。 患儿不伴有其他系统器官的先天性畸形。 患儿家庭无其他遗传病家族史。 患儿双亲精神正常，能接受调查者。 患儿双亲须是患儿生物学父母。 患儿父母家庭至少三代为宁夏籍贯。 对照组纳入标准健康儿童不伴有系统器官的先天性畸形和疾病。 健康儿童家庭无遗传病家族史。
24、健康儿童双亲精神正常，能接受调查者。 健康儿童双亲须是患儿生物学父母。 。 健康儿童父母家庭至少三代为宁夏籍贯。（2）样本基因组DNA的提取：DNA试剂盒提取法（原理为苯酚抽提法）。抽提好的DNA样本用紫外吸收法测定DNA的纯度和浓度，琼脂糖凝胶电泳技术加以确认，并将样品稀释至20ng/l， -20C冰箱储存备用。（3）应用Primer 5.0软件对候选SNPs位点的引物、内切酶的设计。（4）应用TaqMan SNP基因分型技术进行基因分型。（5）挑选10%的分型结果直接测序，验证基因型的正确率。（6）统计学方法Hard一Weinberg Equilibrium (H一W平衡分析)：指在一个随
25、机婚配的群体中，各基因频率和等位基因频率将保持不变。如p和q分别代表一对等位基因频率，由这两个等位基因构成的基因频率将符合二项分布。候选基因各位点分析前提是基因分型数据必须符合Hardy-Weinber平衡，不符合的将剔除于后分析CASE-CONTROL Comparison（病例对照比较）：根据基因型分别计算病例组和对照组间等位基因频率，采用卡方检验。Transmission-Disequilibrium Testing：（传递不平衡检验）主要针对的是家系样本的分析，可以用来检查家系分型的错误，相当于UNPHASED中的pdtphase模块。该软件的优点是可以计算特别小数目的家系，可以灵活设
26、定遗传的模式种类。HaPlotyPe Association （单倍型分析）：单倍型是同一条染色体上紧密相连的两个或两个以上多态位点的状态组合。以单倍型为基础的分析可以提供更多的信息量。每个等位基因或者突变与一个特殊的历史进化有关，这样将有一个独特的染色体背景或者单倍型。与单个位点分型比较，单倍型分析更有力度。Linkage Disequilibrium calculation,LD(连锁不平衡检验)技术路线图标本的收集基因组DNA的抽取目标序列的常规PCT扩增直接测序验证分型TaqManSNP基因分型病例-对照研究 TDT LD 单倍型及归因危险度的分析检验NSCL/P与SNPs的相关性3本
27、课题的创新之处 首次将本课题所选的4个位点rs.rs.rs.rs（1q20），在宁夏地区回汉人群中进行大样本三人核心家系的NSCL/P相关研究，国内有关NSCL/P的发病与以上四个位点多态性的相关性并未有清楚的研究。4、研究计划及预测进展（1）第一阶段 2012年5月2012年12月：收集宁夏地区回汉族病例组NSCL/P核心家系【包括大家系和3人核心家系（患者和双亲）】以及同期匹配的正常对照组标本；并认真填写唇腭裂遗传流行病学研究问卷及临床检查表。同时尽快成批抽提基因组DNA，详细登记编号，-20储存备用 。进行SNPs位点筛选，在导师帮助下获得最新国外相关文献资料，包括网络资源的利用，最终确
28、定rs.rs.rs.rs（1q20）多态位点。 对已经确定的候选基因SNPs位点进行基因分型预实验，以确定基因分型方法的选择和保证分型结果可靠性的直接测序方法的检验。（2）第二阶段 2012年12月2013年6月：进行候选基因SNPs基因分型。用于遗传统计学分析软件（FBAT）的进一步确定和熟练其正确的应用。（3）第三阶段 2013年6月 2013年10月全面统计分析，查漏补缺，增补实验。统计分析方法的选择： 病例对照的方差分析, H-W平衡检验, 传递不平衡检验，单倍型分析，连锁不平衡检验。（4）第四阶段 2013年10月 2014年2月，论文撰写及修改发表。三、研究基础1、与本课题有关的，
29、前期研究工作积累和已取得的研究工作成绩 （1） 前期导师和师兄进行的基因多态性方面的相关研究，为本试验及后续试验积累 了宝贵的方法和经验。（2）对已收集的标本已经提取出DNA并测定OD值，稀释至相同浓度至20ng/l后-20C冰箱储存备用。相关样本信息已经录入北京国家芯片中心宁夏分中心的样品库。（3）已经初步掌握了基因分型技术及测序技术2、已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（1）本实验所需的病例组和对照组样本均可在安排的时间内完成，所需试剂均已订购到位。（2）北京国家芯片中心宁夏分中心实验室具备本研究所需的主要实验仪器荧光定量 PCR 仪 GeneAmp 7000，美国 PE 公
30、司电泳仪 Model 250/ 2.5 美国 Bio-Rad 公司ABI3730 遗传分析仪 美国 ABI 公司低温冰箱 日本 Sanyo 公司Du640 紫外分光光度计 Beckman Coulter 公司3、近期已发表与本课题有关的主要论著目录*论文：作者题目刊名年份卷（期）页码专著：作者书名出版者年份四、经费预算支出科目金额（万元）计算根据及理由实验室管理费500试验收集标本的储存及保管费用实验材料费45000基因提取试剂盒、引物合成、探针合成等样本收集2000样本收集过程、合作劳务费、问卷调查等论文撰写发表1500论文发表所需评阅费、版面费 总计49000注:预算支出科目按下列顺序填写：1.科研业务费2.实验材料费3.仪器设备费4. 协作费5. 研究组织实施费专心-专注-专业