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1、精选优质文档-倾情为你奉上第三章 应用遗传学生物工程发展的第一步通常是寻找合适的有机体。这种有机体期望能够创造一种产品或者服务从而给其工业带来商业回报。实际中，遗传学家必须选择一个有机体，这个有机体能够生产出想要的产品。一旦找到合适的有机体，在可能发生诱导遗传变化的地方利用传统育种和诱变方法就可以生产出更多的想要的产品。对改造过的有机体的选择工作是乏味而耗时的，并且直到最近遗传学家能够采用的大部分方法都还涉及试验和错误。然而，新的基因技术，例如原生质体融合和重组DNA技术的使用使得通过采用新方法就能将有用的遗传特征直接插入到所选择的有机体中。这样，就能够设计建造出完全新的性能（capabili
2、ties），而且尤其是微生物以及小部分植物和动物细胞就超越了它们天生所赋予的遗传能力而生产物质。当应用遗传学家对一个潜在的工业有机体进行操作的时候，生产能力的提高并不是唯一的目标。因此，对病毒的防御能力和提高的遗传稳定性可以被引入到有机体内，从而缺少它们，就能减少或消除有害的副产品的形成并且可以除去令人不快的味道、颜色或者粘质物。一个成功的工业化培养物应该最终具有大部分或者全部下列特点：这个培养必须是纯培养物，遗传稳定；容易繁殖；具有快速生长的特点；具有良好的产品形成速度；不产生有毒的副产品；并且能够行基因操作。工业上所用的培养物通常有三种应用：（1）作为一种研究培养物对它进行研究已寻找一种有
3、用的产品；（2）作为一种发展培养物一个研究培养物获得了重要性；和（3）作为一种生产培养物一个研究培养物现在实际上用来进行工业化生产。最终的培养物可以与原始的研究培养物相同，但更常见的是，将它经过一系列的处理，以提高产率。这个最终的工业有机体将被进行遗传设计，从而使它的代谢功能远超过野生型的代谢功能。这个只能通过在生产过程中对有机体的生长进行最大的控制得以实现。从一个野生型发展到工业有机体需要改变它的遗传信息，消除不要的特点或者甚至是引入整个新的遗传信息。寻找所要的有机体并且提高它的性能（capabilities）是目前大部分生物工程过程的最基本的方面（图3.1菌株改造流程图）3.1 选择与筛选
4、在生物技术的所有方面中，最主要的精力都用在了筛选程序（progaramme）上, 以通过突变或者杂交程序（progaramme）包括遗传设计的途径，从天然资源或者已经建立的培养物中生产出新的有机体。这些有机体必须经过筛选来获得有用的产品并且可以进行足够大规模的生长以生产和提取所期望的产品，然后对这个产品进行鉴定评估（evaluation）。筛选可以定义为利用高效选择程序从庞大的微生物与代谢物中只检测和分离那些有益的微生物与代谢产物。对分离物进一步的改进包括对培养物的改造与保存。然而，对充分利用这个能力来说最大的障碍是适宜的筛选程序的可行性，这个筛选程序能鉴别所必需的产物，尤其在存在培养基组分的
5、情况下。现在生物工程中利用的主要的生物群体是微生物。所述的筛选方法也主要集中于这类群体。在从环境中为生物工程寻找新的微生物的过程中，一般有三种可行性的选择；它们包括取样点的选择，分离出想要的微生物的物理分离过程以及实现选择的方法的选用，这个过程大多数情况下要进行富集培养（表3.1生产微生物的创造）。尽管许多新的生产微生物是野生型而且已经从自然环境中分离出来，但是通过实验操作从现存的基因组制造新的基因组同样花费了大部分的精力。通过突变、重组、转化、转导和基因克隆的单一处理过程或者联合处理过程可以对有机体进行改造（表3.1生产微生物的创造）。通过自然选择，尤其更多的是基因操作，所有工业重要的微生物
6、都将经过某些形式的筛选。筛选程序的设计对实现最大程度的认知新基因性来说是很重要的。筛选可分为两个基本形式：（1） 无选择的随机筛选 对所有分离物进行单独检测，以获得所要的性质（2） 比率筛选 在这个过程中，会进行某些方面的预筛选。随机筛选将是非常耗时的，因为每个分离物都要进行仔细的研究。在抗生素生产的研究中，成千上万的摇瓶培养的单一孢子分离物进行有规律的使用。Agar disc琼脂板 技术加快了这个过程，但这个方法最好是用作在使用摇瓶之前作为一种最初的筛选。大量的分离物或者突变体现在就可以平铺开来，暴露于广泛的环境条件下，同时任意时间段的反应就可以通过电视监控或者计算机控制而被自动记录下来。相
7、反的，比率筛选更多的是利用了特定产物形成的生物化学知识，建立一个选择过程，这个过程利用了所要的基因型的一个特点，这个特点不是特定的有益的那一个，但必须是很容易进行评价scored或者assayed化验。比率筛选应该有选择的杀死所有不需要的基因型从而允许routinely检测更多的分离物。因此，最近已表明in Cephalosporium acremonium抗生素的生产与蛋白水解活性proteolytic activity 相关,这说明了进行筛选一个可能的基础。当筛选过程完成以及有潜在价值的微生物分离后，效率的最终证明来自生产条件。从新的或者现存的微生物进行产品的优化也涉及到最佳培养条件的选择
8、，固体或者液体、分批或者连续发酵。繁殖微生物的培养基类型对于形成产物的表型表达有着重要的影响。因此，培养基的组成能够影响生物体的浓度、形成产物的特定速率specific rate、产物形成的持续时间、产物的降解速率及生产微生物（生产菌）的稳定性。然而，生产环境是不稳定的，成功的生产也需要对培养基和环境控制参数进行改造。菌种的退化是生物工程中普遍遇到的一个问题。稳定性是由基因控制的，可以通过环境因素的特定控制进行改变，比如改变培养基或者通过阻止导致不稳定的遗传事件的发生。3.2 菌种保藏通过自然选择或者基因操作产生一个新的微生物，这个新的有机体就必须进行储藏或者保藏以使遗传性能发生最小的退化。有
9、机体的保藏、制备和繁殖必须达到一定标准的重复性。一个工业微生物的保藏过程生物工程基础结构的整体特征。所有的工业没有一个共同的方法。特定的工业微生物保藏技术作为商业机密而被很好的保守。实际上，大部分工业微生物通过下列的程序被保存的：（1） 在琼脂培养基上进行规律性接种；（2） 利用还原性代谢产物矿物油的覆盖、冷藏或者冷冻储存；（3） 干燥干燥的沙子、硅胶或者滤纸；（4） 冷冻干燥由于与前面方法相比更加方便而且稳定性高所以被广泛采用；（5） 在超低温下冰冻保存（-70-196是一个高成本的方法但是适用范围广而且存活率高）。在全世界范围内，菌种收集对于生物工程大范围的纯种微生物的供应正扮演着越来越重
10、要的角色，这些微生物有着过去、现在或者潜在的价值。重要的操作菌株必须处于可进行繁殖与生产的条件下。尤其是，很多新的基因操作有机体都有不同程度的不稳定性而且保藏必须以获得最小的菌种漂移为目标。这章余下的内容将较具体的讲述目前应用遗传学家可用的对工业重要有机体进行改造的各种各样的技术。3.3 诱变作用一旦一个有用的有机体经过最初的筛选被分离出来，那么对提高生产力的一些选择条件就可以使用了，包括对培养基和发酵条件的改变，诱变（自然发生或者是诱导发生）和杂交。既然诱变是所有遗传变化的根本来源，那么它就成为了在工业微生物学中有着根本重要性的一个话题。而且，这些工业中使用的很多重要的微生物没有正常的性特征
11、，因此不易进行杂交。基于这个原因，各种各样的诱变技术就被大量采用以生产许多目前在使用的生产菌株。对于很多工业化过程，诱变程序确实代表着提高生产力所主要采用的方法。诱变剂诱导提高生产力或者滴度的方法长期以来都在使用，青霉素、Cephalosporuim 和Streptomyces的抗生素生产，有机酸生产与用Aspergillus species 生产酶，用各种菌种生产氨基酸以及其他大量的工业微生物。诱变作用还无法被更新的基因工程技术所代替。现在已经认识到，提高一个发酵产物产量最有效的方法是利用诱导突变和其后对改变菌株的筛选。最困难的是突变发生的频率低而且还必须从庞大的没有突变的菌株中进行选择。有
12、许多关于经重要突变所生产的改造工业菌株生产出更有效验的产品的例子。四环素的生产菌株Streptomyces在这方面尤为重要。发现S.aureofaciens 的突变株S-604可以合成6-demethyltetracycline脱甲基四环素，而不是由亲代生产菌株合成的。这个突变现在是一个重要的商业化程序。尽管如此，很少的突变能够成为改造菌株的主要方法。这种突变通常对形成产物带来小的改变（5%-10%）而没有任何表型表现。连续的利用小的突变可能导致负责原始基因型生产力的遗传因素的增加。生产头孢菌素的有机体与生产青霉素的Penicilliium chrysogenum 菌株一样有着特殊的价值。诱变
13、剂的选择 尽管诱变剂分为物理和化学来源，但是对于工业遗传学家来说这没有多大的联系。选择的主要理由是所选择的技术能够生产尽可能大范围的突变异种以供选择。许多诱导的突变作用不是DNA损伤类型的直接结果而是细胞DNA修复过程作用于损伤处使其在碱基序列上发生了固定的改动的结果。能够导致这种现象发生的诱变剂包括紫外线、离子射线、胸腺嘧啶饥饿和某些化学诱变剂，例如丝裂霉素C、5-溴尿嘧啶、甲基甲烷磺酸酯、氮芥子气和硝基呋喃。关于诱变剂特异性的分子基础是不完整的，但很大程度上取决于诱变修复过程。实际上，生产菌株对于一个特定的诱变剂的作用可能会难以控制的，轮流使用一些诱变剂是明智的，这些诱变剂经历不同的修复过
14、程而发挥作用。而且，突变剂的正确选择可以大大提高在诱变体中我们想要的诱变体的产生的频率，经过这样的方式，当对整个群体进行筛选的时候，鉴定的机会就会增加。诱变率是基因控制的而且能够通过增变或者减变基因进行改变。这些基因能够影响自发的或者诱导的突变性或者两者都有影响。在筛选过程中，增变菌株是重要的由于其中有些增变菌株在诱变作用后能够使在每个存活的菌株中的诱变菌株的频率增高，这将提供了一个有效的输入。在诱变作用后，环境条件能迅速影响整个的诱变频率和特异性。因此，在诱变作用后在完全培养基上进行生长而不是基本培养基将会增大诱变体的产量。大部分生物有一种机制就是与其他相似的但是基因不同的单体进行核物质交换
15、，从而所形成的后代的基因型均不同于其亲代。这个过程就是杂交，是促进可能的基因物质进行重组的一种重要方法。诱变改变了一个有机体的基因，而重组或者杂交又重新安排了基因或者部分基因，而且将从一个或者两个有机体而来的遗传信息带到一个单独的有机体中。杂交在植物和动物育种中广为采用，最近又被用来为很多生物工程过程生产改造的微生物。原则上，杂交有两种表达方式：真核生物的有性生殖和原核生物的准性杂交，对于一个特定的真核生物和大多数真核组织培养物不是纯性别的。在生物工程背景下，真菌和细菌是杂交的主要对象。3.4 有性杂交在有性杂交过程中，来自相反配体类型的单倍体核子被带入到一个细胞中（核配）：核子最终融合形成一
16、个二倍体核子然后经历减数分裂。在减数分裂过程中，染色体被重新安排和组织从而使遗传元素重组（图3.2真核生物的减数分裂）。这个同源重组对于产生新的基因型来说是很有效的。这样，如果两个有机体有不同的n个基因，则发生在它们基因间的重组就会产生2n个基因型。如果这两个菌株在上亿个碱基对中的只有12个分散在其上的碱基对是不同的，那么将会产生212个或者是4096个基因型。在许多生物体中，存在的繁殖系统使有性杂交变得复杂，这个繁殖系统通过阻止自体受精的近系繁殖调节一个群体的远系繁殖。通过这样的方式，繁殖系统促进了适宜遗传物质的不断混合。繁殖系统对许多高等子囊菌纲和担子菌纲来说已有文件证明并且已被广泛用来蘑
17、菇的商业化生产：。通过现代化工厂工艺，不同酵母菌株的有性杂交已被用来快速生产面包，提高蒸馏液体的酒精浓度和酿造特殊的啤酒，其中几乎所有的可溶性碳水化合物都被除去了。 3.5 准性过程目前在生物工程中应用的重要的有机体几乎没有明显的有性重组能力。然而，通过准性机制可实现有限的重组。准性过程包含在营养细胞中所有不进行减数分裂的基因重组过程。准性过程利用许多细胞机制把不同来源的遗传物质带到一起。这个机制在生物工程中有着实际的应用包括接合、转导、转化、有丝分裂重组和原生质体融合。细菌中的接合是将遗传信息通过细胞与细胞的联接从一个细胞转移到另一个细胞的过程。接合也能发生在真核生物中，这时单倍体配子融合形
18、成二倍体合子（图3.3(a)准性过程机制）。它是最为适用的转移方法之一并且对于种内和种间遗传转移来说是非常有用的。在细菌中，这个过程通常是以质粒为中介的，甚至在涉及高频率重组株和相关菌株的例外情况下，一个外来遗传元素一旦是质粒，它就整合到染色体上。接合转移伴随着DNA的复制并使转移的DNA整合到受体的基因组上。尽管接合作用是革兰氏阴性菌的特征但是在革兰氏阳性菌中也证明有接合作用。发现最早的细菌接合系统是大肠杆菌的两个不同菌株细胞间的联结和遗传物质经过性纤毛或者两个配子的一个所形成的微管进行转移。形成纤毛的细胞包含有额外的遗传元素，F因子或者质粒，它们将环状的细菌DNA开裂并向另一个菌体细胞移动
19、，在这个细胞里，两个基因组之间进行重组。利用多种宿主的质粒就可以在大范围的革兰氏阴性菌之间进行基因的转移。接合作用发现对于生产抗生素的Streptomyces和Nocardiaju菌株的改造有着很多实际应用。转导是通过病毒载体将遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞并通过重组进行随后的合并（图3.3(b)准性过程机制）。溶源性噬菌体将部分细菌基因组整合到自身的基因组上，转移这个细菌基因到另一个宿主细胞中并在合适的条件下，这个细菌DNA在新的细胞中进行表达。英国皇家化学机构成功的利用转导作用对参与生产单细胞蛋白的Pruteen process的细菌进行改造。对于动物细胞获得了感兴趣的猿猴病毒40（S
20、V40）和鼠多瘤病毒而植物细胞是一种病毒传递物质，它有着特殊的价值。这就是花菜花斑病毒（CMV），它是一个双链DNA分子，其宿主限定为十字花科。还没有期望这个病毒系统在植物生物工程中有重要的应用。转化，或者是遗传物质的单向转移，在这个过程中，来源于一个细胞的DNA被吸收并且被另一个细胞稳定的维持，转化在细菌中有广泛的作用（图3.3(c)准性过程机制）。酵母和Streptomyces的转化正在广泛并迅速的发展，但是到现在为止在丝状真菌和植物与动物细胞中只有有限成功的转化。转化的DNA可以经过体外处理或者操作包括诱变作用再导入到细胞中。转化的一个主要的缺点是对于大多数细菌来说，一个群体中只有一小部
21、分能够进行转化（大约为大肠杆菌的0.1%，高于大肠杆菌10-100倍的B.subtilis）。在大肠杆菌中已经表明与小分子相比，大的质粒DNA分子的转化效率较低。转化已成为基因工程的一个主要的方法，其利用质粒作为运输工具，将在本章的后面内容中进行讨论。有丝分裂重组对于丝状真菌有着特殊的价值。对于某些真菌，无性噬菌体是单倍体，少量的核子可以融合形成二倍体。真菌无性循环过程中的二倍体菌体是无性核子在杂合条件下融合的结果。这个过程由下列阶段组成：在两个单倍体菌丝体之间形成异核体（一个单独的细胞质含有两个或多个不同的核子）；少数相反核子发生细胞核融合（频率为10-6）；在二倍体核子中进行有丝分裂交换使
22、染色体间发生交换（频率大约为10-2每细胞核分裂）；当二倍体核子被还原到单倍体状态下的时候，以大约每细胞核分裂10-3的频率进行单倍体化（图3.4有丝分裂性重组过程）。这种有丝分裂性重组可进行可能的基因分析并在无性循环的有机体中进行可控制的育种。对于重组的效率，与有性重组相比，有丝分裂性重组的效率很低。已知这种形式的准性杂交在许多工业真菌中都有发生包括Penicilliium chrysogenum 、Aspergillus oryzase 和Cephalosporium acremonium。由于商业机密的要求，这个系统在工业实践中使用的广泛性如何是难于了解的。然而，不容置疑的是它在柠檬酸与
23、青霉素生产菌中已得到成功的应用。在高等植物与动物细胞组织培养物中也记录有有丝分裂性重组。实现准性杂交最主要的就是将所要的细胞进行融合。由于同种和异种间的不相容性存在有很多的障碍，然而通过特殊的试验程序，这种不相容性与物种障碍在如今的许多情况下将被克服，这些特殊的试验程序使细胞的原生质直接融合或者通过转化的方式用已分离的DNA感染细胞。原生质融合 细胞壁常常是不同有机体间发生重组的天然障碍。如果通过制备原生质将这个障碍除去，并且认识到细胞膜相对含有类似的组成成分，那么就可以方便的对不同种生物的细胞质诱导融合并形成一个杂交细胞，以这样的方式使它们的基因进行重组。微生物原生质的诱导融合这个领域具有很
24、大的发展空间，在基础研究与应用研究方面已有快速积累的数据。目前真菌和植物与动物细胞原生质融合与再生技术的成功使用，要感谢the calier 的许多研究工作，这个研究建立了原生质释放与细胞再生的技术基础。现在就可以从大部分微生物细胞中常规制备原生质。尽管已经有用机械和非酶催化的方法制备原生质的报道，但是研究的主要方向倾向利用溶菌酶进行原生质的分离。这个snail消化的主要组成是酶、渗透稳定剂（osmotic stabilizer）和有机体。 酵母原生质体可以用蜗牛消化液的商业制品作为蜗牛酶或者硫酸酯酶来进行生产。通常，多数溶菌酶商业制品对于从丝状真菌中制备原生质来说不是很有效的。然而，许多其他
25、的有机体，尤其是Streptomyces spp.和某些丝状真菌能够产生高效的溶真菌的活性。在大多数情况下，生产菌消化细胞壁合成的酶复合物需要生长培养基中有诱导物质存在。一种生产消化细胞壁酶的新方法是让生产菌在含有低于正常水平碳水化合物如葡萄糖和蔗糖的培养基上生长，但这个培养基要含有相对纯化的目标有机体的细胞壁。生产菌的成功生长需要有合适的消化酶的产生，从而生产出重要的低分子量能量物质。总体上，处于指数生长期的细胞比处于衡定生长期的细胞更容易生产原生质体，这说明在生长周期中细胞壁的化学成分发生了变化。化学稳定剂也是重要的，在除去细胞壁后，它给原生质体提供渗透支持。无机盐、糖和糖醇都被成功的用于
26、维持被释放出的原生质体的完整性。没有渗透稳定剂的话，被释放出的原生质体将很快破裂（burst）。大部分原生质体能够生产出新的细胞壁，随后就能完全回转进行正常生长。这样，如果在分离的融合原生质体间发生了有丝分裂性重组，那么随后的的回复就会导致一个遗传改变的和可进行繁殖的有机体。相似或者不同菌株间天然原生质体融合的发生频率很低。然而，引入作为促溶剂的聚乙二醇（PEG），融合的频率就可提高至少1000倍。对PEG诱导的真菌原生质体的融合方法学研究表明在浓度为25-40%的溶液中用分子量为4000或6000 的PEG是进行融合的最佳条件。 Ca+离子的存在对于获得高频率的融合来说是关键的。实际上，融合
27、作用起始于原生质体的凝集，这是由大量的（extensive）水解过程和聚集物（aggregate）的形成引起的。随后原生质体收缩并高度变形。 在靠近的位点上，内膜蛋白粒子转位，随后聚集。脂与脂的相互作用发生在表面去除了蛋白质的相邻膜之间，而且在钙离子的参与下脂分子又被重新组合。这使得联结的膜的一小部分发生融合，小细胞质桥形成并不断扩大直至两个原生质体完全融合。最近发展了一种细胞质融合的新的电子融合技术。电子域的融合是一个快速并温和的过程，常常类似于细胞融合到巨大细胞中、无关的细胞融合到杂交细胞中及将物质包裹到细胞中那样。细胞暴露在低水平、异种、高频电子域中，使细胞排成链。采用直流电流在邻接的细
28、胞膜打开微孔，使细胞物质混合，细胞融合。这个过程还可改变允许物质通过的细胞外膜的渗透性，所包裹的基因的大小。 当来源于不同菌株的两个原生质体发生融合，所合成的细胞就是异核的由于所含有的核子来自不同的遗传物质。在异核细胞中，不同基因型的单倍体细胞核之间会发生细胞核的融合或者二倍体化，这也发生在相同基因型的细胞核之间。 前者形成了一个二倍体杂合子而后者形成一个二倍体纯合子（homozygous）。这个混合有单倍体和二倍体细胞核的融合原生质体就可以通过正常的繁殖过程再生出一个生长的有机体。在生长期，这个二倍体细胞核分裂期间伴随偶然的（occasional）有丝分裂交换。结果就会发生新的组合和连结，这
29、些重组将赋予有机体正常性特征的某些优点。通过这种准性过程产生了含有以前单倍体有机体的新二倍体菌株。然而，常常会发生二倍体克隆的单倍体化。由于有丝分裂性重组产生新的联接基团，一些新的单倍体菌株的基因型与它们亲代的任一方都不相同。在丝状真菌中，在分生孢子形成过程中常会发生单倍体化，这时（where）分生孢子单体是单核的而且是单倍体。 当原生质体融合被用来对工业菌株进行改造，那么就会发生三个事件：（a） 产生可变的原生质；（b） 高频融合；（c） 融合的原生质再生为进行生长的克隆，实现二倍体化和单倍体化。原生质融合看起来是改造Streptomyces菌株和其他抗生素生产菌的一种最令人信服的方法。它可
30、以生产出新的抗生素结构并且增加提高产量的基因的库容量。最近两种类型的酵母进行了融合，再生的细胞经过繁殖以用作雪梨酒的生产。由于大量的基因参与了这种改造，所以对这个系统来说，原生质融合技术比DNA重组技术更为可信。在丝状真菌中的原生质融合及种间的原生质融合已成功的完成了菌株改造。原生质融合好像是获得种间异核细胞的唯一途径，而丝状真菌中的重组不具有可以证实的有性循环。从很多植物中都可以制备原生质，但是只有有限数量的原生质能够再生出细胞壁，进行分裂，最终分化为正常的植物。许多重要的农作物（crop plant）都属于后者。通过分离的植物原生质进行新的体细胞杂交体生产被认为是植物学的一个重要的技术改进
31、。在实际中，随着诱导融合，液体培养基中的原生质再生出细胞壁，并经过有丝分裂产生一个混合群体，这个混合群体由母细胞、同核融合产物和异核融合产物或者体细胞杂交体组成。一般可通过遗传标记的表达、生理生长需求或者显微操作，对体细胞杂交体进行鉴定和恢复。不同物种间的原生质融合有时候会产生杂交体但是这些杂交体是不能繁殖的，这个无法改变，它不能被整合到一个育种程序中。如果这个杂交体能够进行传统的育种程序的话，体细胞杂交体在农作物改造中的作用才能实现。原生质融合技术在农业实践中还没有带来新的变化。然而，这必将在不远的将来实现而且打开了有创造的与有益的农业革新的新领域。动物细胞也可以进行原生质融合，但是有机体无
32、法完全生长。尽管如此，原生质融合对于植物与动物组织培养物来说是改变遗传染色体的一种有价值的方法。在基因间与区域间发生不常见的原生质融合，例如：酵母原生质与鸡红细胞、动物与真菌异核体以及病毒与酵母。然而，从这些实验中还没有获得有价值的遗传结果，但是它们确实暗示了未来可以将分类上距离较远的细胞进行融合使得特殊的遗传元素得到转移的可能。细胞融合 直接的细胞融合为单克隆抗体的形成建立了基础是新型生物工程中最为活跃和成功的领域之一。单克隆抗体是指从单一来源或细胞克隆获得的抗体，它只识别一种抗原。卫生保健 一直以来的一个领域就是制备疫苗以抵御疫病。疫苗使机体建立起抵御屏障，如建立足够水平的抗体，当病菌以病
33、毒的形式出现的时候待命的细胞进行生长并且产生抗体。疫苗是一个复杂的实体由抗体混合物组成，这个混合物过于复杂无法通过化学方法进行合成。当把一个外源物质或者微生物（抗原）引入到一个脊椎动物体内，这时通过形成浆细胞，免疫应答反应发生（来自B-淋巴细胞），浆细胞分泌的（secrete）抗体能够以高度特异性识别、中和并且消除这个抗原。这些抗体是无法分离的，所以传统的抗血清含有抗体的混合物。然而，现在已经知道每个抗体来源于不同的B-淋巴细胞线和由它们衍生的浆细胞。这样，如果一个细胞线能被克隆，那么将有可能只产生一种抗体。不幸的是，浆细胞是不能进行培养的。1975年，Kohler and Milstein
34、在他们如今著名的实验中证明了生产抗体的淋巴细胞可以与恶性快速增殖的骨髓瘤细胞进行融合，这个杂交骨髓瘤细胞或者杂交瘤细胞能够体现淋巴细胞产生特异抗体的性质，也能体现骨髓瘤细胞不断增殖的特性。这样单克隆抗体就产生了。单克隆抗体的形成是通过给鼠或者兔注射抗原，除去脾，然后将脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合这样进行的（图3.5通过细胞融合形成产生抗体的杂交瘤细胞的示意图）。大约1%的脾细胞是分泌抗体的浆细胞，10%的最终的杂交瘤细胞由分泌抗体的细胞构成。每一个杂交瘤细胞都只能产生一种抗体，发展的筛选技术对它们进行鉴定，然后进行进一步的繁殖或者克隆。来源于单克隆抗体杂交瘤细胞的克隆要冷冻保存，注射到动物体内或
35、者在培养液中进行生长从而产生大量的抗体。大多数这些克隆是遗传不稳定的，染色体丢失而变得较稳定，但是常常是丢掉的这个染色体编码我们所想要的那个抗体。作为各种药物产品，例如多肽、蛋白质和荷尔蒙的一种精确和敏感的分析试剂，单克隆抗体有着广阔的应用范围。对许多医疗目的而言它们还是重要的诊断试剂，包括从用于输血的血液样品中筛选出不要的成分。基因操作与单克隆抗体技术的联合将会产生一种高效生产病毒、细菌和寄生虫抗体的新方法。其他重要的应用包括组织定型、体内肿瘤定位、临床诊断与治疗包括化疗试剂的靶定位。肯定的是融合技术在生物利用方面做出了巨大贡献，不仅是原核和像酵母那样的简单真核生物和丝状真菌，还有正在它们中
36、寻找特殊的产物的高等植物和动物组织培养物。3.6 重组DNA技术遗传物质的分析和操作通过体外克隆技术的发展而被革新，体外克隆使得几乎来自任何有机体的几乎任意一个DNA片断在适宜的生物系统中得到分离、纯化和扩增。由于DNA的删除不包含相关的基因，因此基因克隆使分析和操作方法主要针对于所感兴趣的基因区域。从而大大提高了所用方法的效率并且简化了对新的改造衍生物的鉴定过程。原生质体融合涉及大部分或整个基因组的混合而且感兴趣的特征常常由大量的基因所控制（例如，抗生素），于这个相比，重组DNA技术主要关控制已知基因产物的少数的个别基因（例如，蛋白质、多肽等等）。1978年的基因操作规则定义基因操作“是将通
37、过任何体外方法分离核酸分子而得到的遗传物质新连接到任何一种病毒、噬菌体或者其他载体上，使得它们整合到宿主中，在宿主细胞中它们不能自然发生却可以进行连续不断的繁殖” 。这样定义的基因操作不包括例如单克隆抗体操作、通过传统基因技术改造微生物菌株和动物体外受精或者克隆技术。基因操作技术虽然是一种重要的技术但是目前它对生物工程的研究和应用的贡献还很小。在过去的十年里，分子生物学有很多重要的发现使得重组DNA技术得到了迅速的发展。特别重要的是不能分解或者限制外源DNA导入到细胞中的大肠杆菌突变株的分离，以及限制性核酸内切酶的鉴定，限制性核酸内切酶在特定位点能够断开双链DNA分子。通常，这种DNA片断在宿
38、主细胞中不能有效地进行转化或者复制。这个问题的大部分已经得到了解决，把DNA片断插入到载体上，这个载体能够进入到宿主细胞中，并使相关的信息的到表达。载体通常为细菌质粒、噬菌体或者酵母2DNA。将DNA片断共价连接到载体上的过程是由DNA连结酶实现的。新合成的载体或者嵌合DNA分子通过转化导入到宿主细胞中例如大肠杆菌、Bacillus subtilis or Saccharomyces。同时随着宿主细胞的生长繁殖，载体也就进行复制并扩增外源DNA。完整的基因组是有可能克隆的，这样就产生了一个庞大的DNA群体或者独立DNA分子的文库。一个基因组文库包含生物体基因组的全部序列，而且原则上其中的任何一
39、个基因都是可以分离的，这样就可以获得对其进行检测的特异性探针。如果一个克隆序列的平均大小为20kb，那么一个完整的人类基因组文库就需要大约克隆单体。基因操作技术提供了新的功能，由于它操作迅速，可以广泛应用、对操作过程可以实现高程度的控制以及最为重要的是，形成前所未有的新基因组合，可以通过实验室手段进行筛选。重组DNA技术已成为生命科学中发展最快的领域之一。这个新技术的核心是克隆这个概念，它被Timmis（1981）定义为“一个单个组分的分离和个体繁殖，这个单个组分能够从相似组分的混合体中进行繁殖。”实际中，通过营养的方式，克隆长期以来都被用来扩增病毒、细菌和植物的纯培养物，从而确保了生物体基因
40、组的准确连续（图3.3克隆）。如今，这个术语也包含单个自主基因组分的分离和维持，例如质粒和隐性病毒基因组。细胞有机体的克隆只需要一个营养培养基；病毒和质粒的克隆则需要一个特定的宿主细胞和一个营养培养基，而基因的克隆需要一个载体的复制子、一个特定的宿主细胞和一个营养培养基。所有克隆类型在生物工程中都有重要的角色；从而，在生物工程中所用的所有的微生物、植物和动物细胞都需要在一个纯的恒定状态下进行维持和繁殖，而尤其是病毒和质粒的繁殖或扩增被认为是新生物工程中的一个强有力的工具。基因克隆或重组DNA技术的原则将通过大肠杆菌K-12质粒载体系统的例子来进行简短的讨论。尽管基因克隆技术所用的病毒载体在具体
41、上有所不同，但原则是相似的。图3.6和3.7描述了在宿主细菌细胞中对外源DNA进行体外转移和表达的最基本要求，可以归纳如下：（1） 分离的环状质粒DNA分子，这个DNA分子必须含有一个位点，这个位点上整合的外源DNA不会破坏主要的功能。（2） 利用限制性核酸内切酶生产出适合克隆的DNA片断。这个插入的片断或许是原核或者真核微生物的一个染色体片断，或许是动物或植物的一个染色体片断，或者是一段化学合成的DNA序列。（3） 将外源DNA分子拼接到载体上的方法。（4） 将杂交的DNA重组体导入到宿主细胞。（5） 转化体表达，这个转化体要含有重组质粒。这个新基因技术的最主要的特征就是，它可以实现对DNA
42、片断克隆过程相当大的控制，并且可用于任何有机体的任意DNA片断。质粒 这个新技术的基础是质粒。质粒是不需要连接到染色体上就能够进行稳定遗传的基本分子。由于它们能够对人和动物的病原体产生抗生素抗性并且编码增加这些病原体毒性的毒素和其他蛋白，因此，它们在医药业与农业中是重要的。它们还重要的原因是某些质粒参与了Rhizobium sp.中氮的固定，而另一些则编码许多代谢活动使某些细菌能够降解有可能成为环境污染物的化合物。质粒是双链DNA分子，在宿主细胞中以共价闭环分子（CCC）的形式存在。质粒的分子质量范围大约为1106到200106。Conjugative共轭质粒可以转移自身的拷贝从一个细菌到另一
43、个细菌中而且能够通过细菌之间的染色体DNA碎片。质粒还可携带有插入序列和转座子。质粒还可用作DNA克隆的载体。携带抗生素抗性基因的质粒被称为抗性（R）质粒，有些大肠杆菌质粒被用作质粒载体。其中最为常用的克隆大肠杆菌基因的质粒是PBR322，它们赋予了氨苄青霉素和四环素抗性。质粒DNA的分离可以通过溶解细胞并且在含有溴化乙锭的氯化铯梯度中从染色体DNA上分离质粒DNA。一些比较小的质粒像Col E1在宿主细胞中维持高的拷贝数，这样就能合成大量的质粒编码的蛋白质，因为每个细菌携带有感兴趣基因的多个拷贝。当细胞经过选择性抑制染色体DNA复制的氯霉素处理，就会进一步大量的（ substantial）有
44、选择的扩增质粒DNA。质粒PBR322含有Col E1相关质粒PMB1的复制功能基因，质粒R1（Tn3）的氨苄青霉素抗性基因和质粒pSC101的四环素抗性基因最为选择标记。质粒PBR322含有至少十个内切酶的单一切割位点。限制性核酸内切酶 微生物可以区分自身的DNA和其他来源的DNA。这个系统发展为依靠细胞中的两种类型的酶实现自身和非自身的区分：修饰性甲基化酶和限制性核酸内切酶。甲基化酶以一种特定的方式（fashion）把甲基添加到初期的双链DNA上的各种核酸残基上。这个识别序列的长度通常为4-7个碱基对而且是回文的，即（duplex）DNA一条链上的序列与互补链上的相同。大部分有机体都有许多
45、不同的修饰甲基化酶。限制性核酸内切酶与修饰酶鉴别相同的序列，但是不是进行甲基化，而是切割序列上的DNA。然而，核酸内切酶不切割自身序列而是降解外源 DNA。这种识别和切割双链DNA上特定序列的特性是切除许多类型有机体DNA片断的基础。出现的不同类型的限制性核酸内切酶命名为型、型、型和型。只有型对这个新的DNA技术而言是重要的。限制性核酸内切酶型有着特殊的重要性，因为它们是序列特异的而且能够在双链DNA上的准确位置进行双链断裂。通过这样的方式，它们把长的外源DNA分子分解为小的片断同时在质粒插入DNA片断的位点上进行单一断裂。利用其中的一些酶，分解产生了单链末端，对于用一个给定的限制性核酸酶产生
46、的所有片断，这些末端的碱基序列是相同的。通过这样的方式，任何经过特定的核酸内切酶产生的片断都将和用相同核酸内切酶切割的另一个任意的片断碱基配对，这样退火生成一个杂交分子。由于许多来自细菌的限制性核酸内切酶都可以被利用，那么就采用了一个命名标准。宿主有机体的属名和种名与属的第一个字母和种的前两个字母组成了一个以斜体形式简写的三个字母相一致。例如，E.coli、Eco.Strain 或者类型用非斜体符号表示而核酸内切酶的序号用罗马数字表示EcoR。不同的核酸内切酶用于生成经过不同的3-或者5-四个核苷单链的延伸而产生的不同大小的DNA片断。然后就可以通过电泳纯化DNA片断。EcoR水解PBR322
47、上的单一靶位点或者用有单一作用靶位点的任何其他的一种限制性核酸内切酶来进行水解，将环状质粒转化为线性DNA分子。被大部分限制性核酸内切酶型识别的位点有一个2倍对称轴：它们可以是4-、5-或者6-核苷序列。经过酶切割的DNA会产生钝端或者粘性末端，在粘性末端中，少数不配对的核苷以3-羟基或者5-磷酸基团结尾project from the ends。很多限制性核酸内切酶识别4-或者6-核苷回文位点。这样，在一个6个碱基对序列的中间位置进行切割的Hinc酶，形成钝端DNA分子，只能用DNA连结酶以低效率进行连接。EcoR的切割位点远离中心而且由于酶识别位点的回文性质产生具有单链末端或者粘性末端的双
48、链DNA片断。当这些片断的混合物混合在一起的时候，单链序列上的互补碱基间的氢原子进行键合，末端就连接在一起了。平均每4096个碱基对出现一个6-核苷序列。识别4-核苷酸序列的核酸内切酶所产生的片断，其平均长度应为256个碱基对：说明用来编码一个分子质量为35000典型的蛋白质所需要的DNA数量大约为1000个核苷酸长。用来克隆的DNA片断也可以不通过限制性内切酶的作用而获得：这些方法包括机械剪切、声处理、化学合成或者通过用逆转录酶从真核生物信使RNA模板合成copy DNA（cDNA）。最后一种方法克服了内含子或者干扰序列这个高等真核生物的大部分基因的特征。在细菌体内，这种内含子在真核生物DN
49、A转录过程中不能被除去而在真核生物表达系统中，它们可以被除去，经过拼接基因主要的RNA转录产物。连接到载体 可以通过许多方法把DNA片断插入和连结到质粒载体上。用E.coli或者噬菌体T4 DNA连结酶处理DNA片断混合物就会在克隆载体与DNA分子之间产生共价连接。在这些片断之间就会形成共价的磷酸二酯键，这些片断通过粘性末端退火。一个非常低效的连接是“钝头”或者“平头”（图3.8（a）。在这种情况下，DNA分子没有单链DNA而且需要高浓度的DNA末端和酶来进行有效的连接。尽管如此，这种方法确实允许使用广大范围的核酸内切酶以提高所研究的DNA的范围。当这样的一个杂交分子形成，它不能被任何一种用来产生原始DNA片断的核酸内切酶切割。这种潜在的缺点