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1、理学其它相关论文 -青枯菌病害的研究进展 摘要：细菌性青枯病危害多种作物 ,抗病育种是病害防治最为可行的途径 ,分子标记研究是深化作物青枯病抗性遗传改良的重要方面。生防研究近几年也取得了较大的进展，本文着重从这两个方面对青枯病的研究做一综述。 关键词：青枯菌 生化变种 致病机理 分子标记 青枯病是一种由青枯菌 (Ralstonia dolaanacearum)引起的毁灭性土传病害，发病植物茎叶萎蔫下垂直至全部枯死，是世界上危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物病害之一，至今尚没有有效的化学农药和其他防治办法。因此青枯病被称为植物的“癌症”。植物青枯菌 R. dolaanacearum 可侵染
2、 40 多个科200 多种植物 , 仅次于农杆菌 (Agrobacterium tu me faciens)。是番茄、马铃薯、花生、甘薯、烟草、辣椒、茄子、生姜、草莓、香蕉以及一些贵重药材和花卉植物许多植物生产的重要 限制因素 ,世界各地均有分布。青枯病菌是一个复杂的群体，有明显的生理分化，不同地区和不同寄主来源的菌株，在寄主范围、致病力、生化型、血清型等细菌学特性上差异很大，因此增加了对此病害防治研究的难度。近几年来许多科研工作者从不同的角度不同方法对青枯菌进行了多方面的研究。 1 青枯菌菌系的组成 青枯菌生理生化复杂，各国的科学家都对其进行了种以下的分类或分型的各种尝试。有两个亚分类系统已
3、被国际所公认。一是按不同来源菌株对不同植物种类的致病性差异，将青枯菌划分为不同的生理小种（ Race）。 60 年代已命名 4 个小种：小种 1 号（可侵染茄科植物和其他科植物），小种 2 号（只侵染香蕉、大蕉和 Heliconia），小种 3 号（只侵染马铃薯，偶尔侵染番茄和茄子），小种 4号（只对姜致病力很强）。另一个亚分类系统是根据不同菌株对三种双糖（麦芽糖、乳糖、和纤维二糖）和三种乙醇（甘露醇、山梨醇和卫矛醇）氧化产酸能力的差异将青枯菌化分为 4 个生化变种：生化变种 1（不能氧化 3 种双糖和 3 种乙醇），生化变种 2（只能氧化 3 种双糖，不能氧化 3 种乙醇），生化变种 3（能
4、氧化 3 种双糖和 3 三种乙醇），生化变种 4（只能氧化 3 种乙醇，不能氧化 3 种双糖）。生理小种和生化变 种的关系是这样的：生理小种 1 号中包含生化变种 1、 3 和 4。生理小种 2 号中包含生化变种 1 和 3。生理小种 3 号中包含生化变种 2。生理小种 4 号中包含生化变种 4。但是，从桑树分离的一些菌株与以往确定菌系种力不同，其对几种代表行茄科植物的致病力很弱或不致病，而且它们具有氧化 3 种双糖和甘露醇的能力，因而鉴定为一种新菌系，命名为小种 5号和生化变种 5 号。 1 国内现在只发现小种 1 号和小种 3 号。小种 1 号是我国长江流域及其以南地区的优势菌系，小种 3
5、 号是危害我国马铃薯的优势菌系，对我国的马铃薯生产产生重大的威胁。对大量青枯菌的检测 结果表明，青枯菌存在菌细单抗特异性，但目前还不能根据这种单抗特异性对青枯菌菌系间进行实质性的亲缘关系的亚分类和分群模式。 2 2 青枯菌的致病机理 研究证明，青枯菌通常可从植物根部或茎部的伤口侵入，引起发病。但在天然条件下，也能从没有受伤的次生根的根冠部位侵入。植物生长时在次生根的根冠和主根的表皮间形成鞘，青枯菌能穿过这层鞘，侵入皮层细胞间隙生长，破坏细胞间中胶层，使细胞壁分离，变形，形成空腔，继而侵染，木质部薄壁组织使导管附近的小细胞受刺激形成侵填体，并移入侵填体，侵填体破裂后继被释放进入导管，并在 导管内
6、大量繁殖和快速传播扩张，从而引起植株萎蔫死亡。植物病害生理研究证明：青枯菌在导管中生长时可产生大量的胞外多糖，其影响和阻碍植物体内的水分运输特别是容易对叶柄结和小叶处较小孔径导管穿孔板造成堵塞。因而引起植株枯萎 ;同时，青枯菌还可以分泌于细胞外多种细胞壁降解酶（如果胶酶类和纤维素酶类）其可能也在破坏导管组织。青枯菌在人工培养时还能分泌一些生长调节物质如 IAA， CTK 和 Eth 等但现有资料表明它们在植物体内的产量有限。对植物死亡方面的作用尚不清楚，而且研究也少。国外的研究大量集中在胞外多糖，果糖酶和纤维素酶 在致病过程中的作用。美国威斯康星大学 Sequeira实验室（ 1991） 报道
7、克隆出了控制胞外多糖和脂多糖的基因簇 eps A-D 或ops-A-D。佐治亚大学 Denny 实验室克隆出了控制胞外多糖等表型转变的基因phc A。后证明是复合调节网络（ Complex regulatory networks,CRN）控制胞外多糖的产量，控制对某些环境或信号的反应还可控制其他致病因素。黄勇和 Sequeira报道了从青枯菌株 K 60(小种 1号 ,生化变种 1)分离到 hrp基因簇，目前，还未能从寄主植物上找到跟 hrp 相对应的抗病基 因。 3马庆生等克隆出了青枯菌对花生的专化性基因。 4最近又有报道已经克隆出了青枯菌的抗病基因。 3 青枯病抗性的分子标记 3 1 茄科
8、蔬菜的青枯病抗性 茄科植物受青枯病危害最重 ,涉及的作物种类最多 ,从世界范围内的寄主植物看 ,有关青枯病研究工作开展最多的也是茄科植物 ,尤其以番茄和马铃薯青枯病的研究最为普遍 ,其次为烟草。但是茄科蔬菜类及马铃薯作物等目前发现的青枯病抗性种质较少而且抗性水平不高 ,抗性表现受环境影响较大 ,抗病品种选育受到限制 ,是国内外面对的一大难题。在番茄中至今没有发现显性寡基因控制的青枯病抗性 ,已有抗性种质的抗性多表现为数量遗传特性 ,抗性位点多造成了抗性遗传的复杂性。 5 3.1.1 番茄的青枯病抗性分子标记 目前关于植物青枯病抗性分子标记的报道主要是对番茄的研究。尽管番茄栽培品种之间的 DNA
9、 多态性不高 ,但番茄具备良好的遗传系统 ,易于操作 6。在番茄的青枯病抗性研究中 ,既发现了广谱性位点 ,也发现了对某些菌系具有专化性的抗性位点。 Danesh 等研究认为在番茄第 6、 7、 10 染色体上存在与青枯病抗性相关的数量性状位点 7。亚洲蔬菜研究与发展中心 (AVRDC)Wang 等研究证实了 Hawaii7996(番茄中广泛应用的抗源 )在第 6 条染色体上的抗性标记 ,并发现在第 3 和第 8 条染色体上存在抗性位点 ,还发现了一个未定位的 RAPD 标记 4 8。 Yui 等研究获得了 Hawaii7996 青枯病抗性的 4 个 RAPD 标记 ,在 99个 2 植株中鉴
10、定出 32 株具有全部 4 个 RAPD 标记 ,其中 2 个标记(RA12-12450 和 RA12-291600)被认为与抗性主效基因连锁 9。 Mangin 等研究认为在番茄第 6条染色体上至少有 2个独立的位点与青枯病抗性有关 10。 3.2 花生青枯病抗性种质研究 花生在青枯菌寄主植物的抗性遗传 多样性中有特殊地位。到 2000 年 ,世界范围内鉴定出高抗青枯病的花生地方品种超过 120 个 ,二倍体野生花生中也发现了20 多份抗青枯病材料 ,这是其它茄科植物不可比拟的 ,就数量而言 ,花生属植物抗性种质的遗传丰富性居青枯菌寄主植物首位。自 20 世纪初印度尼西亚首次发现抗青枯病花生
11、种质以来 ,历经近 100 年 ,这些最早发现的抗病材料仍然具有很高的抗性 (群体存活率 )。与茄科作物相比 ,花生的青枯病抗性水平不仅更高 ,而且稳定性更强 11。 3.2.1 花生青枯病抗性遗传及 DNA 标 3.2.2 记研究 据现有研究结果 ,花生青枯病抗 性在遗传上受寡基因控制 ,如珍珠豆型花生的抗性受 2 对主效基因控制。育种实践表明 ,花生青枯病抗性容易在品种间转移 ,也易于从二倍体野生种转移到四倍体栽培种中 ,如河南省农科院和中国农科院油料所均从二倍体野生花生转移获得了抗青枯病品系。廖伯寿等研究证明花生对青枯菌潜伏侵染反应特性存在遗传分化 11,12。从 2000 年起 ,中国
12、与国际半干旱研究所合作开展了花生青枯病抗性的分子标记及辅助选择技术研究 ,发现了不同花生抗病基因型间的 AFLP 和 SSR 多态性 ,建立了青枯病抗性的重组近交系 (RI)群体 ,将用于绘制遗传连锁图谱和基因 定位。花生青枯病抗性遗传基础较为简单 ,为分子标记的建立乃至基因的克隆提供了可行性。 3.2.3 花生青枯病抗性的利用潜力 由于花生在对青枯病的抗性水平、稳定性和抗性遗传基础上的特殊性 ,研究和分离抗性基因对于其它作物青枯病抗性改良具有重要的潜在作用 ,1997 年在法国召开的第二届国际植物青枯病大会 (IBWS)对此提出了倡议。通过研究建立花生青枯病抗性的分子标记 ,可以明确抗性基因
13、位点 ,估计抗性基因作用、遗传特性及环境影响 ,最终克隆和分离抗性基因 ,对于深化花生乃至其它作物的青枯病抗性育种具有重要的理论和实用意义。国 际花生青枯病工作网 (GBWWG)正利用多边合作关系开展工作 ,以期在花生和其它植物青枯病抗性改良上取得突破。 4 青枯菌生防菌的研究 4 1 青枯生防菌 Bacillus sp 青枯生防菌 Bacillus sp。 B130 菌株是姜瘟灵的主要有效成分，它对包括青枯菌在内的多种植物病原真菌和细菌有明显的拮抗作用 B130 能在 PH5 8 之间较快地生长，以 PH 6 时菌体生长状况为最佳，抑菌活性亦最强培养初期抑菌活性随培养时间而增长，但 36 h
14、 后呈下降趋势。对蛋白粗提液等的研究表明，B130 的抑菌物质成分复杂，但主 要活性部分是蛋白和多肽类物质 13 4 2 青枯病生防菌 ANTI 8098A 福建农科院研究员刘波博士主持的农作物青枯病生防菌 ANTI 8098A 的研究与应用项目经过 8 年努力，筛选获得了具有自主知识产权的植物青枯病生防菌株 ANTI 8098A，经德国菌种保存中心鉴定为蜡状芽孢杆菌。在完成菌株的生物学特性研究的基础上，项目组自行设计并完成了生防菌剂中试规模的网络监控生物反应系统，建立了菌剂生物测定的标准化方法，成功研制出生防菌的存活基质、菌剂生产工艺和保质技术，解决了菌剂田间定殖难题。经科学测定，ANTI
15、8098A 青枯病生防菌剂几年来在福建不同地区的茄科作物上推广面积达 5.6 万亩次，对番茄、茄子、辣椒、花生、烟草、生姜等作物青枯病田间防效高达 75 85，与普通化学农药相比，价格低，效果好，不造成药害，不污染环境，农药残留不超标，经济、生态和社会效益良好。专家认为，这项研究首次发现了 ANTI 8098A 对青枯菌的致弱现象，即将青枯雷尔氏菌强致病力菌株转化为无致病力菌株，从而抑制病害。项目组对致弱机理进行了探索性研究，建立了 PCR 电泳、紫外分光、液相色谱、异源吸附蛋白、 TTC 培养基测定、寄主植物回接等致 弱作用的检测方法，为植物青枯病生物防治机理研究提供了新思路。 14 4 3
16、 eep( export of extracellular proteins)突变体 4 3 .1 eep 缺失突变体的致病力 通过 Tn5 诱变技术，分离了植物青枯病菌生理小种 1 号、 3 号的胞外蛋白输出功能丧失突变体。由于 Tn5 在其基因组单一的 eep 位点的插入，突变体失去了向培养液分泌产生胞外酶和胞外蛋白质的能力。用碱性磷酸酯酶基因 PhoA 作为报导基因，研究这些胞外蛋白穿越突变体细胞内膜，结果表明， 16这些胞外蛋白质可以穿过其内膜， 但失去了穿越其外膜的能力。胞外多糖在植物体内和体外的产生没有受到 eep 基因位点突变的影响。该突变体失去了对番茄植株的致萎能力。 4 3
17、.2 eep 突变体防治番茄青枯病的研究 室温内，采用土壤接种的方法将野生型青枯菌 AW 和 PO41 接种于竞争其灭菌的土壤内（ AW 、 PO41 菌悬液 3 108 细菌 /ml）。同时采用浸苗法，分别把突变株 AD4、 AP7 和荧光假单胞菌菌株 JF1 接种番茄幼苗。结果表明在接种初期，菌株 AD4、 AP7 和 JF1 都有防治番茄青枯病的能力，但在接种 20 天后，只有 eep 突变体 AD4 具有生防效果。 15 不同菌株室温内防治番茄青枯病结果（病株率 %） 菌株 移栽后天数 5 10 15 20 30 AD4 AP7 JF1 CK 0 0 0 30 15 30 20 75
18、20 65 80 100 20 35 70 80 100 100 100 100 在田间， AD4 对番茄青枯病的防治效果不如室温明显，但在接种后的 1 个月内仍有一定的防治效果，随着时间的延长，效果下降。 AD4 同以往各类青枯菌的不同点，在于它在失去对寄主的致病力后仍具有较好的寄主亲和力。这为生物防治提供了很好的微生物资源。 5 展望 相对于其它许多植物病害而言 ,植物青枯病抗性的 DNA 分子标记研究较少 ,除番茄之外 ,其它作物处于起步阶段。由于众多茄科作物中发现的高抗种质很少 ,发掘新的基因和实现不同抗性位点的聚合是提高抗性水平的重要方面。花生抗青枯病资源丰富 ,抗性的遗传行为较为简
19、单 ,抗性分子标记的建立必将推动花生及其它作物抗性育种的进步。我国具有微生物的资源优势，利用细菌病毒防治植物青枯病害有着美好的 前景，随着生物技术的进一步应用，一批利用遗传工程改造的高效生防菌逐一问世，这将大大推动对植物青枯病害的研究 不久的将来，植物青枯病将不再是植物生长的“克星”。 参考文献： 1 何礼远 .青枯假单胞菌在中国的多样性 , 植物病虫害研究进展 ,74-86. 2 何礼远 ,康耀卫 . 植物青枯菌致病机理 , 植物病虫害研究进展 ,3-12. 3 Huang Y,Xu P,Seqyeira L.In: pseudomona solanacearum.Mol Plant-mic
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