双水相萃取技术(共9页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上双水相萃取技术（two-aqueous phase extraction）一、 前言近年来，随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开，各种高附加值的生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。与上游过程相比，目前作为下游过程的生化分离纯化技术往往存在步骤多，收得率低，处理时间长，重复性差等缺点，这样便严重阻碍了生物技术的工业化发展。因此，就迫切需要一种分离步骤少，收得率高，处理时间短，并且易于放大的生化分离纯化技术，双水相萃取技术就满足了这一需要。特别是基因工程技术的发展，需要从细胞中提取高质量的遗传物质，由于细胞

2、破碎后，在溶液中存在大量的轻质细胞碎片，给遗传物质的提取形成了很大的干扰，通常通过离心分离和溶剂萃取难以得到高纯度高活性的遗传物质，而通过双水相初步提取，可以使目标物和轻质碎片得到很好的分离，且目标物的活性几乎没有损失。因此双水相萃取技术得到了很大的重视，并且在近20年里取得了较大的发展。二、 发展史双水相萃取技术又称之为水溶液两相分配技术（Partition of two aqueous phase system）1、1896年，Beijernek 在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时，发现这种混合溶液能较快地分为两层，他把这种现象称之为聚合物的“不相容性”（incompatibility）体系的

3、发现2、1956年瑞典伦得（Luhd）大学的Albertson发现双水相萃取技术可用于蛋白质的选择分离，但目标蛋白同成相高聚物的分离是影响了其大规模工业应用。发现可以用于分离提纯3、20世纪70年代中期西德的Kula和Kroner等人首先将双水相技术应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，从而大大改善了胞内酶的提取过程，提高了酶的收得率。利用于活性物质的提取4、1989年，Diamond等人以FloryHuggins理论为基础，推导出生物分子在双水相体系中的分配模型，但有局限性，仍需继续探索，不断完善。开始理论研究5、20世纪90年代以来，由于控制和优化技术的发展，将生化分离过程进行集成化（pro

4、cess integration）和将生化反应与分离过程集成化成为了研究热点。集成化研究三、 与传统分离方法的比较在生物发酵产品制备中，细胞和细胞碎片的除去是整个分离纯化的第一步，也是最为关键的一步，它将直接影响到后续工序的收得率。传统的分离方法主要采用离心法及过滤法。这两种方法在实际应用中都有一定缺点，如离心法能耗高，过滤法膜孔容易堵塞。而双水相萃取，整个操作可以连续化，除去细胞和细胞碎片的同时，还可以起到纯化目标物的作用。各种方法的比较见表A，可以看得出，在除去细胞碎片的各种方法中，双水相萃取技术是传统的离心分离和过滤法无法比拟的。和传统的酶粗分离方法，如盐析，有机溶剂沉淀相比，双水相萃取

5、分离技术也有很大的优势。见表B，一般说来，传统的分离方法达到与双水相萃取相同的处理量时，需要比双水相萃取多3到10倍的设备，而且比双水相萃取分离方法放大困难。虽然双水相萃取技术具有很大的优势，但目前真正工业化的例子却很少。主要原因是大规模分离时，双水相萃取的成本较高，使得其技术上的优势大打折扣。大规模分离中，双水相萃取总成本中主要是原料成本（90以上）。原料成本和生产规模成正比，因而随着生产规模的放大，总成本也增加很大。而传统的分离方法中，总成本主要是设备投资，并且设备投资并不与生产规模成正比。因而是的大规模生产时双水相萃取技术没有优势可言。因此降低成相物的成本是双水相萃取技术工业化应用的关键

6、。四、 双水相体系的构成1、 双水相体系的形成A、 高聚物/高聚物体系 作为一种体系，也就是说它是一个系统，在无外界干扰的情况下，系统的能量总要趋向于最低状态。对于双水相体系目前主要有两种解释法：一种认为两种聚合物相互混合时，究竟是否分层还是混成一相，主要取决于两种因素，即分子间作用力和熵的增加。两种物质混和时熵的增加与涉及的分子数目有关，同分子大小无关。但分子间的作用力，可以看作分子中各个基团之间相互作用力的总和，分子越大当然作用力就越大。可见对于大分子而言决定混合的结果主要取决于分子间的作用力，而不是熵增。若两种聚合物分子间若表现为排斥力，即某种分子希望在它的周围的分子系同种分子而非异种分

7、子，则达到平衡后，就有可能分成两相。若存在引力，或同种分子引力或异种分子斥力不够强，则会混容或很难形成两相。另外一种就简单的归结为分子间的空间位阻，即在一定条件下，由于高聚物分子的空间阻碍作用，无法互相渗透形成均相，具有相互分离倾向而形成两项系统。若从混合前后能量的高低来解释就更好理解。假设有两种物质，物质A要进入物质B的体系中，首先要克服它本身分子间的作用力，假设所需能量为E1，然后需要B克服的空间位阻，即B物质要分开留出一定空间来容纳物质A，假设所需能量为E2，混合后，AB物质相互作用，假设释放的能量为E，如果E1+E2E，则表现为不相容，分为两相；若E1+E2E，则表现相容，体系不分层。

8、可以看得出，这很好地从分子间的作用力和空间位阻两个方面解释了双水相体系的形成原理。B、 高聚物/无机盐系统高聚物和无机盐形成两相系统比较一致的解释是盐析作用。C、 生化分离常见的体系 聚乙二醇（poly ethylene glycol PEG）/葡聚糖（Dextran DEX）系统 PEG/DEX硫酸盐系统 PEG/硫酸盐系统 PEG/磷酸盐系统 实验证明这两种聚合物对生化活性物质无毒害作用，反而起到保护作用，使分子结构更稳定。2、 相图（作图说明） A、双节线TCB将单相区和两相区分开，曲线下方是由两种高聚物混合溶液组成的均相体系，曲线上方是由两种高聚物溶液组成的双水相体系。 B、直线TMB

9、称之为系线，系线上的所有点构成的双水相体系的组成相同，但体积比不同。 C、T和B点分别代表上下相两种高聚物的质量百分组成。D、 由于上下两相密度差别不大，则有VT/VB=BM/TME、 C点表示系线长度为零，代表两相差别消失或者说两相即将形成的点，称之为临界点（critical point）或褶点（plait point）F、 双节线的位置和形状与聚合物的分子量有关。聚合物的分子量越高，相分离所需的浓度越低；两种聚合物分子量的差别越大，双节线的形状越不对称。见图B五、 双水相萃取分配理论基础双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同（一个两相都

10、是水溶液，而另一个一相是水溶液，另一相是有机溶液）。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中分配的浓度不同。分配系数等于物质在两相的浓度比，即KC1/C2。（C1一般表示上相，C2一般表示下相）因为各种物质的值不同，可利用双水相体系对物质进行分离提纯。1、 表面自由能的影响众所周知，当体系达到平衡时，分子处于某一相时若能量低，则它会比较集中地分配到该相中。设分子自相2移到相1所需能量为E，则根据相平衡时，化学位应相等的原则，可得到分配系数K应为：式中：k波尔茨曼常数； T温度。设某种被分离物质的分子表面积为A，则

11、在两相中的表面能分别是A1和A2,可得:分析上式可知分配系数主要取决于分子的表面积和表面性质(1)、当分子在两相中的表面性质相同时，可知K1，则这种物质在两相中的分配相同，这种系统不能将该物质提纯浓缩。 （2）、当分子在两相中的表面性质不相同时，则K1，若差别越大，K值就会越小或是越大，即C1和C2的差值就越大，就更有利于该物质的提纯浓缩。 （3）、从表面积来说，A值越大，会导致C1和C2的差值就越大。一般来说，分子量和表面积成正比，所以从理论上来说，利用双水相系统分离大分子物质是很合理的。 （4）、另外，对于一个待分离的混合溶液来说，由于各种物质分子的表面积不同，且在两相中的表面性质也存在差

12、异，所以其分配系数K值也不会一样，从而在双水相体系中能达到提纯的作用。2、表面电荷的影响 对于带电物质的正负粒子，当在两相中分配系数K不相等时，就会产生电位差，称之为道南电位（Donnan potentin） 当两相分配达到平衡时，经推导得到如下式子：可见可以通过加入带电粒子来改变两相的电位差，从而影响物质在两相中的的分配系数。六、 影响分配的因素1、 聚合物的分子量根据表面自由能的理论， 我们知道可以通过改变表面张力的大小来改变分子的分配系数。比如用PEG/DEX系统提取蛋白质，如果想让蛋白质分配在上相，则要求K增大，蛋白质表面积A不变，从而要求1减小2，也就是说要降低蛋白质在上相（主要含有

13、PEG）的表面张力，提高在下相（主要含有DEX）的表面张力。而表面张力的大小同聚合物分子量大小有关，分子量越大，其端基数目减少，导致疏水性增加，从而使表面张力增大。因此需要降低PEG的分子量，增大DEX的分子量。 当聚合物的分子量降低时，蛋白质易于分配富含该聚合物的相中，这是一条普遍规律，不论何种成相聚合物系统，何种进行分配的生物高分子都实用。2、 聚合物浓度的影响 (1)、当聚合物处于双节线以下时，被分离物将均匀分布于溶液中。 （2）、当超过双节线，则形成两相，此时随着聚合物或盐浓度的不同变化，双水相系统的性质将发生较大的变化。因此可以通过改变聚合物或盐的浓度来改变物质在系统的分配系数。一般

14、说来，当系统远离临界点时，系统的表面张力将增加。（画相图解释）？3、盐类的影响由于各种无机离子在PEG/DEX分配系数的不同，当加入无机盐后，将在两相间形成不同的电位差，这对带电生物大分子的分配产生很大的影响。见表C例如：NaCl对卵蛋白和溶菌酶分配系数的影响，（作曲线图解释，见图C）另外，HPO42离子在PEG/DEX系统中的分配系数很小，因而加入PH大于7的磷酸盐缓冲溶液能很方便地改变相间电位差，使带负电的生物大分子移向PEG相。4、pH值的影响 影响所分离分子的离解度，导致分子所带电荷的性质的改变，从而改变了这种分子在两相中的分配系数。影响磷酸盐的离解度，若改变HPO42 和H2PO4

15、之间的比例，使相间电位发生变化，从而影响分配系数。当研究某种分子的分配系数与PH的关系时，如加入不同的盐，则将形成不同的电位差，那么pH与K的关系也会不同。但在等电点时，得到的是不带电荷的分子的分配系数，对于不同的盐类应有相同的K值，因而在不同的盐系统中，分配系数与PH的关系曲线的交点即为等电点。这种测定等电点的方法称之为交错分配（cross partitioning），比如研究血清清蛋白在两种盐中的pH与K的关系（作图说明）D5、温度影响温度主要是影响溶液的粘度，温度身高有利于相分离时间缩短，但影响不大。我们知道高温度对活性大分子有破坏作用，而聚合物对生物分子有保护作用，所以大规模生产中一般

16、采用常温操作，不会引起损失。这样可以节约操作费用。七、 双水相萃取技术的应用目前在国外双水相体系萃取分离技术主要应用于菌体、细胞、细胞器和亲水性生物大分子的分离、纯化。近几年，在亲水性生物小分子物质的分离、提纯应用方面也已开始进行了研究。应用的范围主要包括： (1)、细胞组织的分离，如用三甲胺PEG/DEX体系可分离含胆碱受体的细胞，分配系数=3.64，回收率可达 57%。 (2)、酶的分离、提纯，如用PEG/DEX体系分离过氧化氢酶，2.95，回收率=81 %。 (3)、病毒的纯化，如用PEG/NaDS体系可对脊髓病毒和线病毒进行纯化，回收率可达90 %。(4)、核酸的分离，如用PEG/DE

17、X体系可分离有活性核酸DNA。(5)、生长激素的纯化，如用PEG/盐体系可提纯人的生长激素，分配系数6.4，回收率60 %。(6)、干扰素的分离，用PEG磷酸酯 /盐体系分离 干扰素，630，=97%。用该体系可从重组大肠杆菌匀浆中提取干扰素，1 55，=99.5%，纯度提高 2 5倍。(7)、生物小分子物质的分离，关怡新等人以填料塔为萃取设备，用PEG/(NH4)2SO4体系对青霉素G钠盐在其中的传质性能进行的研究表明，双水相体系萃取分离技术对生物小分子物质的分离也是可以取得理想效果的。 (8)、药物的分离和提纯，如基因工程药物、抗菌素、动、植物药物的提取。也可以利用该技术开发我国传统的中草

18、药。 (9)、在分析检测中的应用，例如可以用PEG（4000）/MgSO4体系对强心药物异羟基毛地黄毒苷进行免疫测定，用PEG（6000）/磷酸钾体系结合循环伏安法可建立一种双水相体系检测螺旋霉素的电化学方法。1、 传统典型的酶提取和提纯双水相萃取开始主要应用于胞内酶的提取，应用这种方法，首先应满足下列条件：A、欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；B、酶的分配系数足够大，经过一次萃取，就能得到高的收率；C、两相用离心分离很容易。由于大规模分离时，原料成本较高（总成本的90），所以一般采用成本较低的PEG/盐系统，典型的流程图（作图解释）分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐（有时也可同时加入少

19、量的PEG）。进行第二次两水相萃取。通常第二步萃取的目的是除去核酸和多糖，它们的亲水性较强，因而易分配在盐相中，则蛋白质就留在PEG相中。在第三步萃取中，应使蛋白质分配在盐相（例如，调节PH值）。使其和主体PEG分离。色素由于其疏水性强，通常分配在上相。主体PEG可以循环使用，而盐相蛋白质可用超滤法去除残余的PEG以提高产品纯度。注意：单位重量的相系统中均浆液的加入量是一个重要参数。从经济上来说，总是希望多加入。但加入过多会影响聚合物的成相体系，改变相体积比和分配系数，反而使收得率降低。一般来说，1千克相系统处理200400克湿菌体为宜。2、 目前双水相萃取技术应用研究热点从生化分离技术的研究

20、发展趋势来看，目前已经实现了观念上的转变，即由过去的局部改进的思路转化成了从全局的高度来看待问题。一般认为生化分离技术的开发可以从两个方面着手：其一，继续研制一些适用于生化工程的新型分离技术，如近年来研究比较多的亲和分离法、逆胶束法、液膜法、各类高效层析法、双水相分配技术及超临界流体萃取等；其二，进行各种分离技术的集成化。根据这一思路这里介绍一下双水相分配技术与相关分离技术(如电泳、层析、温度诱导相分离、渗透释放和亲和技术等)的集成化过程。A、 与温度诱导相分离集成与其他常用的生化分离技术相比，由于成相聚合物的成本等因素，双水相分配技术在经济上缺乏优势，一定程度上限制了其规模化应用。如何使成相

21、聚合物得以有效地循环利用一直受到普遍关注，加入盐形成PEG/盐系统或超滤分离等一般方法均无法迅速有效地回收聚合物。温度诱导相分离技术的引入为解决聚合物回收问题开辟了一条成功的新路子。此类聚合物通常不带电，它在水溶液中的可溶性主要是由于与水分子形成氢键。温度的提高有利于它得疏水作用，使聚合物相互聚集，发生沉淀。这类聚合物通常有临界温度（LCST），在临界温度以上，氢键作用已不足以维持聚合物分子的可溶性，从而产生沉淀。当温度降低低于临界温度时，聚合物有可逆溶解。因此在双水相分离中，我们可以通过改变温度，使富含目标物的聚合物沉淀下来，达到目标物和昂贵得聚合物得分离，使聚合物能够快速得重复利用。可见这

22、种方法即简单又节约了成本。虽然我们常用得PEG也是一种温敏聚合物，但它的临界温度太高（100以上），不可能用于生物活性大分子得分离。在过去得十几年中找到了许多新型的，临界温度大大降低得温敏型聚合物，如聚N异丙基丙稀酰胺、聚N乙烯基己内酰胺或两者得共聚物、甲基纤维素、聚乙烯甲醚、乙基羟乙基纤维素等。氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物（简称EOPO，m（EO）：m（PO）1：1，相对分子质量在4000左右），在0.2mol/L的硫酸钠溶液中的临界温度为40。这种聚合物与DEX或羟丙基淀粉可以形成双水相体系。将含有3磷酸葡聚糖酶的酵母匀浆液加入到此双水相体系中，目标酶转移到聚合物上相，残渣以及其它蛋白质转移

23、到葡聚糖和羟丙基淀粉组成的下相。将上相移出，加热到40，又形成新的两相体系：上相是含有酶的水相，下相的聚合物质量百分比可达到40，冷却稀释后可供下次使用。这个过程3磷酸葡聚糖酶的纯化因子为35，收率为6080。纯化因子（purification factor）：定义和比活有关，比活的定义是每克物质中所含活性产品的重量或单位数，而经过纯化后的比活与纯化前之比称之为纯化因子。Johhansson在EOPO分子上引入一个疏水基团，形成一种新的聚合物（HMEOPO），它的临界温度大大降低（12左右），用来从人血浆和大肠杆菌发酵液中纯化阿朴脂蛋白，发现酶的活性收率接近100，表明此系统操作条件温和，不会

24、造成酶的失活。Presson也对它进行了研究，表明阿朴脂蛋白的纯化因子可达到5.5，收率为78。B、 同亲和沉淀的集成 ？双水相分配具有易于直接处理含细胞碎片等固体颗粒的优点，亲和沉淀则由于引入特异性的亲和作用使得分离效率明显提高，二者相互结合实现集成化，可充分发挥双方的优势，实现优势互补，一方面使双水相亲和沉淀技术能直接处理含固体颗粒物料，另一方面又提高了双水相分配的纯化因子，同时解决了亲和配基与目标物和成相组分的分离问题。Kamihira等人将亲和沉淀与双水相分配技术相结合来纯化重组蛋白质。亲和沉淀载体为一种可逆溶解的聚合物 (Eudragit S100)，用人免疫球蛋白G（Ig）为配基。

25、因Eudragit主要分配在上相，故蛋白质与Eudragit S100IgG络合而萃入上相，分出上相，调节pH值使Eudragit沉淀，再用洗脱液洗脱可得蛋白质，同时上相及载体配基复合物可循环使用。Dong等人利用这一技术从肌肉匀浆液中提取LDH，过程集成之后，既能发挥双水相分配去除细胞碎片的优点，并促使目标蛋白质分配在上相，经亲和沉淀后又可使目标物能与原系统中的成相组分分离，这一新的分离过程更显示出高效和节能的优势。C、 磁场增强双水相分离技术双聚合物双水相系统由于同提取物混合后粘度大、相密度差小，相分离时间一般需要1030min。Flygare等人通过在相系统中添加铁氧颗粒 (即磁铁矿，直

26、径约1m，添加量约1050mg/ml)，利用磁场作用来加速相分离，双水相系统中铁氧颗粒分配于下相，在磁场作用下铁氧颗粒定向移动，带动了包含有铁氧颗粒的下相小液滴聚集成相，从而缩短了相分离时间。对PEG/PES系统相分离时间可缩短到原所需时间的 1/100，对PEG/磷酸盐系统也可缩短为1/10，一般可在1min内完成相分离，并可克服因细胞匀浆的加入引起的相分离时间的增大。实验表明，铁氧颗粒的加入并不影响酶的分配系数，有人用3.3cm x 30cm的分离柱进行了实验室规模的分离，从酵母细胞中亲和提取磷酸果糖激酶、乙醇脱氢酶等，结果表明磁场加强相分离是切实可行的。D、 与生物反应的集成 生物转化过

27、程一般都存在着一定程度的产物抑制，且对于规模化生产还有细胞或酶的循环利用问题。目前主要采用膜分离和固定化技术，但对某些特殊底物 (如木质纤维素 )，如果采用固定化技术则底物的转化率很低，而膜分离技术又难以操作。将双水相分配与生物转化相结合，形成双水相生物转化，为解决这一问题提供了新的思路。双水相系统对菌体或酶通常没有毒性，选择适当的分离条件，可以使菌体细胞或酶分配在下相，而转化产物分配于上相，这样转化过程中由于产物被萃取入上相而消除了产物抑制作用，同时分布于下相的细胞或酶得以循环使用 (作图说明，见)很明显，将双水相分配与生物转化相结合，同时解决了产物抑制和生物催化剂回收利用两方面的问题，为生

28、物转化赋予了新的内涵。Tjerneld等人利用双水相生物转化，将木质纤维素经过酶水解生产乙醇，效果很好。Bartlett等人实现了在双水相系统中-甘露糖苷酶催化糖基转化合成低聚糖。Andersson等人研究了PEG/DEX系统中利用枯草杆菌进行流化发酵生产淀粉酶，比普通发酵的酶产率提高了63%。他们还将这一技术应用到青霉素酰化酶的生产中。 另外还有胞内释放和双水相分离的耦合、电泳技术与双水相分离的集成、与超声波技术的集成、与气溶胶技术的集成、与层析分离技术的集成等等。七、双水相萃取技术展望(1)、廉价可成相聚合物的开发我们知道影响双水相技术大规模工业应用的主要因素就是成相聚合物的价格太高，工业

29、应用同其它技术没有优势可言。如果降低了聚合物的成本，则它的优势就可以显示出来。科研人员也在这一方面做了许多工作。Krone（1981）首先利用粗DEX取代DEX，Folke（1987）用变性淀粉PPT取代DEX，David（1988）用麦芽糊精取代DEX，Alka（1989）利用阿拉伯树胶取代DEX，Skuse（1992）利用羟丙基纤维素取代PEG都获得了一定的成功。再加上新功能聚合物的开发，比如温敏性聚合物，这样可以大大降低聚合物的成本。（2）、集成技术技术的应用我们知道，有相分离时间长的缺点，与温度诱导相分离、磁场作用、超声波作用、气溶胶技术等实现集成化，可以改善了分相时间长的问题，为双水相分配技术的进一步成熟、完善并走向工业化奠定了基础。双水相萃取界面张力小(10-710-4/)，有助于强化相际间的质量传递。但是，较小的界面张力会导致乳化现象的产生，使相分离时间延长，分离效率不高。另外，双水相体系的粘度较高，造成了生物转化过程的氧传递速率降低，这也在一定程度上限制双水相技术同生化发酵反应相结合的应用。这也可以通过对温度诱导相分离、磁场作用、超声波作用、气溶胶技术集成化得进一步研究来得到解决。专心-专注-专业