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1、细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告线粒体的活体染色与观察【实验目的】掌握线粒体活体染色原理及方法。观察和了解动物细胞内线粒体的形态、结构与分布特点。【实验原理】线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（JanusgreenB）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。不同细胞中线粒体的形态
2、和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿B染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。活体染色是指用染料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。活
3、体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿B、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹钠斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。詹纳斯绿B这种碱性染料是活体染色中重要的材料，对线粒体的染色有专
4、一性，可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基。【实验用品】材料小白鼠器材解剖盘、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、滴管、双凹片、小烧杯、显微镜。试剂1/500詹纳绿B染液、Ringer试剂（NaCl：0.85%；KCl：0.03%；CaCl2：0.033%）。【实验步骤】用断头法处死小白鼠，置于解剖盘中。剪开腹腔，取出肝脏，选取边缘较薄的肝组织0.5cm3，放入小烧杯中，用Ringer液冲洗去血污。滴加1/500詹纳绿B溶液于双凹片的凹穴中，再将上述洗净的肝组织移入染液中
5、，染色20-30min。以组织块边缘被染成蓝绿色为准。吸去染液，将肝组织重置小烧杯中，滴加Ringer溶液0.5ml，用剪刀将组织充分剪碎制成悬液。取上述细胞悬液滴片，加上盖玻片，在高倍镜下观察。【实验结果】第1页细胞生物学实验报告结果小鼠肝细胞质中的线粒体被染成蓝绿色（理想状态下），且分布均匀。图像【分析与讨论】结果分析在理想状态下，小鼠肝细胞质中的线粒体应该被染成蓝绿色，但是在实际观察中，线粒体呈浅绿色甚至无色。可能原因有：染色时间不够，使染色不够充分。肝组织块剪得太大太厚了，使得染料透过速度太慢，最终使得大部分的细胞未染上色。根据实验原理要求，染色剂的浓度要求极稀。这本身就让染色过程具有
6、了一定难度。在显微镜下观察时，可以看到红细胞数量远远多于线粒体的数量。出现这种情况可能的原因有：在处死小鼠时，放血不够充分，导致大量血液淤留在了肝脏中，使最终视野中红细胞过多。取出肝组织块后，用Ringer液未将血污冲洗干净，使其部分残留在肝组织块表面，并最终混在了细胞悬液内。讨论使用肝细胞的缘由线粒体含量较多，每个肝细胞有1000-2021个线粒体。长度适合观察，约5m。肝脏较软，易于破碎，并且适于快速提取，因而利于保持线粒体活性。但就以上某一条而言，均有其他部位可以替代肝脏，但若全面比较三个条件，则肝脏为最佳。注意事项在从小鼠体内取肝组织块时要尽量快，从而能够保证它更高的活性。染色时要使组
7、织块上面部分半露在染液外，不可完全淹没，以便使线粒体酶系得到氧化。在选取肝组织片时要在处于边缘，且为由薄到厚的地方选取。染色结束后，加入的Ringer液的量不能太多，只需要刚盖过肝组织块即可。如果量太多，则在剪组织块的时候会造成其上浮，从而不易剪碎。观察前要将肝组织充分剪碎，制片时要吸取上悬液，使游离的细胞或细胞群留在载玻片上，而要避免吸取稍大的组织块。【拓展实验】人口腔黏膜上皮细胞线粒体的活体染色与观察.取干净的载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上，滴两滴1/500詹纳斯绿B染液。.实验者用牙签在自己口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的黏液状物放入载玻片上的染液中，染色10-15min（注
8、意不可使染液干燥，必要时可再加染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置于光学显微镜下观察。.在低倍镜下，选择平展的口腔黏膜上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞细胞核周围的胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体。第2页扩展阅读：细胞生物学实验报告实验六细胞膜的渗透性一、实验目的了解细胞膜1的渗透性及各类物质进入细胞的速度2二、实验原理1、在等渗溶液中，细胞对各种溶质的透过性不同。有的溶质可以进入，有的溶质不能渗入。2、渗入的溶质能提高细胞的渗透压，促进水分子进入细胞，引起溶血现象3。3、不同的溶质渗入到细胞内的速度不同，因此溶血时间也不同。三、
9、实验材料新鲜血液（鸡血、猪血、牛血等）四、实验器材试管（1.5cmX18cm）、试管架、10ml移液管、1ml移液管、200ml烧杯（2个）、250ml容量瓶、移液枪、胶头滴管、菜刀、吸球、电子天平、显微镜、盖玻片、载玻片、秒表五、实验药品及试剂0.17MNaCl、0.17MNH4Cl、0.17MNH4Ac、0.17MNaNO3、0.12MNa2SO4、0.12M草酸铵、0.32M葡萄糖、0.32M甘油、0.32M乙醇、0.32M丙酮、肝素抗凝剂4六、实验步骤1、制备血液稀释液（1）抗凝剂的制备：首先称取1克肝素钠粉末，然后加入0.17MNaCl溶液10ml（110的比例），混合均匀，制成肝素
10、抗凝剂。（2）血液稀释液的制备：取新鲜血液，按比例（肝素抗凝剂:血液=110）混合均匀，配制成经肝素抗凝的血液56。（3）按比例（经肝素抗凝的血液0.17MNaCl溶液=110）混合均匀，形成一种不透明的红色液体7。2、低渗溶液（空白对照）的观察取试管一只，加入10ml蒸馏水，然后再加入1ml稀释的血液。注意观察溶液颜色的变化。结果是溶液由不透明的红色变为澄清。记录下这个过程所要的时间。3、红血球的渗透性按表一的配制，分别在下列十种等渗溶液中进行实验。轻轻摇动，注意有无颜色变化，是否有溶血现象发生，记下时间（自加入稀释血液到溶液逐渐由红色变为透明澄清，红血球全部溶血所需时间），填入表一的空格中
11、。4、显微观察1何为细胞膜？5注意：这一步，动作要非常迅速，否则鸡血会凝固。或者先把抗凝剂加入到烧杯中，再加入新鲜的2鸡血，边加边震荡即可。为何不同物质进入细胞的速度不同？6为什么新鲜的鸡血会凝固？3何为溶血现象？7为什么这一步要使用0.17M的NaCl溶液？4你知道有哪些血液抗凝剂？（1）血液红细胞的观察滴一滴稀释的血液于载玻片上，盖上盖玻片。用光学显微镜观察细胞的种类、形状和颜色。（2）细胞破碎的观察在上一步的载玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在显微镜下观察细胞的破裂。七、实验结果与分析1、比较和分析你所观察到的实验结果，并解释原因。结果：（1）在所提供的试剂中不溶血的有：（2）在所提
12、供的试剂中不完全溶血的有：（3）在所提供的试剂中完全溶血的有：结果分析与比较：结论：2、绘制你所观察到的血液细胞图。3、讨论溶血实验在研究中应用的可能性。附1：试剂配制表1、0.17MNaCl需要克NaCl，定容至100ml。2、0.17MNH4Cl需要克NH4Cl，定容至100ml。3、0.17MNH4Ac需要克NH4Ac，定容至100ml。4、0.17MNaNO3需要克NaNO3，定容至100ml。5、0.12MNa2SO4需要克Na2SO4，定容至100ml。6、0.12M草酸铵需要克草酸铵，定容至100ml。7、0.32M葡萄糖需要克葡萄糖，定容至100ml。8、0.32M甘油需要克甘
13、油（100%），定容至250ml。9、0.32M乙醇需要克无水乙醇，定容至250ml。10、0.32M丙酮需要克丙酮，定容至250ml。附2：表一在不同低渗溶液下溶血现象的调查编号12345678910试剂10ml0.17MNaCl+1ml稀释的鸡血10ml0.17MNH4Cl+1ml稀释的鸡血10ml0.17MNH4Ac+1ml稀释的鸡血10ml0.17MNaNO3+1ml稀释的鸡血10ml0.12MNa2SO4+1ml稀释的鸡血10ml0.12M草酸铵+1ml稀释的鸡血10ml0.32M葡萄糖+1ml稀释的鸡血10ml0.32M甘油+1ml稀释的鸡血10ml0.32M乙醇+1ml稀释的鸡血
14、10ml0.32M丙酮+1ml稀释的鸡血是否溶血时间附3：溶血结果的判断（1）不溶血：液体分2层，上层浅黄色透明，下层红色不透明，镜检红细胞完好。（2）不完全溶血：溶液混浊，上层变红色，镜检有部分红细胞破裂。（3）完全溶血：液体变红而且透明，镜检发现细胞全成碎片。附4：细胞膜内外物质交换示意图原始生命向细胞进化所获得的重要形态特征之一，是生命物质外面出现了一层膜性结构，即细胞膜。细胞膜和细胞内膜系统总称为生物膜(biomembrane)。细胞膜(cellmembrane)，又称原生质膜，是细胞结构中分隔细胞内、外不同介质和组成成分的界面。其厚度通常为78nm，由脂类和蛋白质组成。一般蛋白质占6
15、0%-80%，类脂占20%-40%，碳水化合物约占5%。关于细胞膜的结构模型，流体镶嵌模型是目前被最广泛接受和认可的观点。该模型由美国加州大学的辛格(S.J.Singer)和尼克森(G.L.Nicolson)于1972年提出。该模型突出了膜的流动性和不对称性，其结构特征是：生物膜的骨架是磷脂双分子层，其中磷脂分子的疏水性尾部相对，极性头部朝向水相。蛋白质或嵌在脂双层表面，或嵌在其内部，或横跨整个脂双层，表现出分布的不对称性。根据在膜上的位置不同，膜蛋白可分为两类：通过强疏水或亲水作用同膜脂牢固结合不易分开的，称为整合蛋白(integralprotein)或内在蛋白；附着在膜表层，与膜结合比较疏
16、松容易分离的，称为外周蛋白(peripheralprotein)。细胞膜的表面还有糖类分子，形成糖脂、糖蛋白。因脂双层具有流动性，故蛋白质分子也可以在脂双层中横向移动；又因膜的内外表面上脂类和蛋白质的分布不均匀，反映了膜两侧的功能不同。细胞膜是细胞与周围环境和细胞与细胞间进行物质交换和信息传递的重要通道。其最重要的特性是半透性，或称选择透过性，对进出入细胞的物质有很强的选择透过性。这是细胞膜最基本的一种功能，如果丧失了这种功能，细胞就会死亡。细胞膜的功能有：1)分隔形成细胞和细胞器，为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境，膜的面积大大增加，提高了发生在膜上的生物功能；2)屏障作用，膜两侧的水溶性
17、物质不能自由通过；3)选择性物质运输，伴随着能量的传递；4)生物功能：激素作用、酶促反应、细胞识别、电子传递等；5)物质转运功能：细胞与周围环境之间的物质交换，是通过细胞膜的转运功能实现的，其主要转运方式有四种，即单纯扩散、易化扩散、主动转运、入胞和出胞作用。6)细胞膜的受体功能：受体是细胞识别和结合化学信息的特殊结构，其本质是蛋白质。实验八细胞融合实验目的掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。实验用品1.材料鸡红细胞2.器材和仪器普通光学显微镜、普通低速离心机、恒温水浴箱、刻度离心管、试管、载玻片、盖玻片3.试剂50PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4
18、)、生理盐水实验内容一、原理细胞融合(Cellfusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。细胞融合的诱导物种类很多常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键
19、及极性基团发生结构重排。二、方法1.取新鲜鸡血以0.85生理盐水制成10的悬液。2.称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的37Hanks液混匀制成50的PEG溶液。放入37水浴中备用。3.取上述10的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，沿离心管壁滴加50PEG溶液，边加边晃动试管使之混匀，37水浴20min。4.取出离心管，缓慢滴加9mlHanks液以终止PEG的作用，800g离心3min，弃上清。5.用贴壁的液体重悬细胞，取一滴制成滴片，加盖片镜检。结果：在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。三、融合率的计算在高倍镜下随机计数200个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。公式如下：第 10 页 共 10 页