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1、. .微生物限度检查法标准操作规程 目的：建立微生物限度检查的基本操作，为微生物检查人员提供正确的操作规程。 2. 依据： 中华人民XX国药典2000年版二部。 中华人民XX国卫生部药品卫生检验方法3. X围： 本标准适用于QC化验室的微生物限度检查。 4. 职责： QC微生物检验员对本标准的实施负责。 5. 程序： 5.1. 定义：微生物限度检查法：系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。 5.2. 实验用具： 电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75%酒精棉球、紫外灯（3
2、65nm波长）。 5.3. 培养基：5.3.1. 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、麦康凯琼脂培养基、枸橼酸盐培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、蛋白胨水培养基、4甲基伞形酮葡萄糖苷酸（MUG）培养基5.3.2. 培养基的管理、配制应符合检定菌、培养基管理规程（SMP ZL0036）、培养基配制规程（SOP ZL0016）。5.4. 试液：甲基红试液、-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。 5.5. 稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液。 5.6. 供试品溶液的制备：取供试品（供试品如为固体，置研钵中研磨成细粉）放入试管中，加入适量的稀释剂制成1:10浓度的供试品溶液。5.7
3、. 对照用菌液：控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，对照菌株为大肠杆菌CMCC（B）44102。取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18-20小时，稀释至1:106，对照菌的加入量为50-100个。 5.8. 检查法：5.8.1. 除另有规定外,细菌的培养温度为30-35,霉菌的培养温度为25-28,控制菌的培养温度为351。5.8.2. 细菌、霉菌计数：5.8.2.1. 平皿菌落计数法 取均匀供试液，进一步稀释成1:102、1:103等适宜的稀释级。分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm的平皿中，再注入约45的培养基约15ml，
4、混匀，等凝固后，倒置培养，每稀释级应作23个平皿。 营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。 5.8.2.2. 菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。5.8.2.3. 细菌培养时间为48小时，分别在24小时及48小时点计菌落数，一般以48小时菌落数为准，霉菌培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。5.8.2.4. 点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。5.8.2.5. 菌数报告规则：细菌宜选取
5、平均菌落数在30-300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30-100之间的稀释级，作为报告菌数计算的依据。如只有1个稀释级菌落数在30-300（30-100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有两个稀释级在30-300（30-100）之间时，按下式计算两级比值。比值=高稀释级平均菌落数稀释倍数低稀释级平均菌落数稀释倍数当比值2时，以两稀释级的均值报告，当比值2时以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告，如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30-300（30-100）之间时，以后两个稀释级计算级间比值，如各稀释级的平均菌落数均不在30-300（30-100）之间，以最接近30或30
6、0的稀释级平均菌数乘以稀释倍数报告，如各稀释级平均菌落数均在300（100）之上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告，如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告，如当1:10(1:100)稀释级平均菌落数等于或大于原液(或1:10)时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。5.8.2.6. 培养基稀释法：取供试液（原液或1:10供试液）3份，每份各1ml，分别注入5 个平皿内（每皿各0.2ml）每个平皿中倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后倒置培养，计数，每1ml注入的5个平板点计的菌落数之和即为每1ml的菌落数，共得3组数据，以3份供试液菌落数的平均
7、值乘以稀释倍数报告。如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个。5.8.3. 控制菌检查 除另有规定外，取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、cm2），直接或处理后接种，经增菌、分离培养后，进行革兰氏染色、生化试验等项检查。5.8.3.1. 大肠杆菌：5.8.3.1.1 取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养1824小时（必要时可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养
8、，分别于5小时与24小时时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。阳性对照呈现荧光，MUG阳性。供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性；无荧光，MUG阴性。然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌。供试液MUG阳性，靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。5.8.3.1.3. 如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于麦康凯琼指平板，培养1824小时，如上述
9、供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。或有菌落生长，应挑选23可疑菌落作靛基质试验（I）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生成试验（VP）、枸橼酸盐利用试验（C）及革兰氏染色、镜检，按表1规定判断结果。5.8.3.1.4. IMvic试验：5.8.3.1.4.1. 靛基质试验：（I）取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养物中，培养24小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。5.8.3.1.4.2. 甲基红试验（M）：取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养482小时，于管内加入甲基红指示剂数滴，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴
10、性。5.8.3.1.4.3. 乙酰甲基甲醇生成试验（V-P试验）：取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基，培养482小时，每2ml培养液中加入-奈酚乙醇试液1ml混匀，再加40%氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，在4小时内，如出现红色应判为阳性，无红色应为阴性。 5.8.3.1.4.4. 枸橼酸盐利用试验（C）：取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，培养4872小时，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为兰色时为阳性，培养基颜色无改变时为阴性。5.8.3.1.5. 结果判断见表1。对与MUG-1反应不符的可疑菌株，应重新分离培养，再作生化试验证实。5.8.3.1.6. 当空白
11、对照试验呈阴性；供试品检查为革兰氏阴性无芽孢杆菌，乳糖发酵产酸产气或产酸不产气；IMvic试验为阳性、阳性、阴性、阴性或阴性、阳性、阴性、阴性，可判为检出大肠杆菌。表1MUG的结果判断MUG-1曙红亚甲蓝琼脂IMViC结果+ +- -+ -+ - +无菌生长有菌生长有菌生长- + - -+ + - -检出大肠杆菌未检出大肠杆菌未检出大肠杆菌检出大肠杆菌检出大肠杆菌 注：如出现+-或出现- +- -，均应重新分离菌株，再作MUG-1和IMViC试验。革兰阴性杆菌。5.9. 结果判断：5.9.1. 细菌菌落数、霉菌菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下的规定，应判为供试品符合规定；其中任何一
12、项不符合该品种项下规定，应判供试品不符合规定。5.9.2. 细菌菌落数、霉菌菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以三次结果平均值报告。5.9.3. 如营养琼脂培养基平板上生长霉菌菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基平板上生长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，经复试2次，如3次结果平均值仍超过规定应判为供试品不符合规定。5.9.4. 各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按第一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不符合规定。 5.10. 活螨检查法：5.10.1. 设备和材料： 显微镜、放大镜、解剖针、发丝针、小毛笔、载玻片、盖玻片、30%甘油
13、水、培养皿或小搪瓷盘。5.10.2. 检查法：5.10.2.1. 取供试品放在预先衬有洁净黑纸的培养皿或小搪瓷盘中。5.10.2.2. 先用肉眼观察，有无疑似活螨的白点或其它颜色的点状物，再用510倍放大镜或双筒实体显微镜检视，有螨者，用解剖针或者发丝针或小毛笔挑取活螨放在滴有一滴甘油水的载玻片上，置显微镜下观察。5.10.2.3. 活螨卵的检验方法：螨卵极小，一般在0.1mm以下，呈乳白色，椭圆形或卵圆形。须用1020倍放大镜或显微镜方可查见。螨卵常见于活螨群的周围，但在未检出活螨的样品中，亦有检出螨卵者。一般在供试品中已经检出活螨，不再进行螨卵的检查,对可疑供试品,未检出活螨时,可注意检查
14、活螨卵。 检验方法：可采用检验活螨项下的直检法或漂浮法检查。凡用上述两种方法检查，如发现可疑螨卵时，用发丝针小心挑取。取一块凹形载玻片，在凹窝中央滴入2滴甘油水，将挑取物放入甘油水中，置显微镜下检查。为确证挑取物是否为活螨卵，可将上述载玻片置培养皿中，加盖，于2230培养38天，每天上、下午定时用低倍显微镜观察，如在甘油水液中孵出幼螨，则判断为检出活螨卵。 5.10.3. 供试品检验报告： 凡供试品按上述方法检验，发现活螨者，应作检出活螨报告。 在供试品中未检出活螨，但检出活满卵时，可按检出活螨处理。 为保留阳性结果备查，可将检出的螨按下法处理保存：将活螨挑放在载玻片上预先滴有1滴75%乳酸溶液中，加上载玻片。手持载玻片，在酒精灯小火焰上来回移动，缓缓加热片刻，使其适当透化，即可镜检。鉴定后的螨体，可取下放入70%酒精中保存，或适当处理。 6. 本标准引用本公司内部标准： 检定菌、培养基管理规程（SMP ZL0036）； 培养基配制规程（SOP ZL0016）。 7. 附：微生物限度检查记录ZL0084 00。. .jz.