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1、个人资料整理仅限学习使用2021 届毕业生毕业论文题目 : 白色链霉菌 PL3-6 菌株产聚赖氨酸发酵条件争论院系名称：生物工程专业班级：生物工程0402 班同学姓名：赵爱霞学号： 20044850427指导老师：惠明、田青老师职称：副教授、助教2021 年 06 月 01 日个人资料整理仅限学习使用摘 要-聚赖氨酸 -Poly-L-Lysine 是由微生物发酵合成的一种由赖氨酸单体通过-酞胺键形成的多肤； -PL 具有优良的抑菌作用，对革兰氏阳性菌和阴性菌、酵母 和一些病毒都有抑制作用，而且兼有水溶性好、热稳固性高等特点；采纳正交实验对选择的一株白色链霉菌 Streptomyces albu
2、lus PL3-6发酵产 -聚赖氨酸 -PL 的培育基成分进行了优化；结果说明，该菌株产-PL的优化培育基为 :葡萄糖 3.0g L -1、酵母粉 0.5g L- 1、N H 42 SO4 1.2g L- 1、KH 2 PO40.20g L-1 、K2 HPO40.12g L -1、- 1- 1- 1MgSO47H2O 0.05g L 、FeSO47H2O 0.003g L 、ZnSO47H2O 0.008g L ；在优化培育基下， -PL摇瓶产量达到 4.05g L- 1，比优化前提高了 25 %；采纳 D152弱酸性阳离子交换树脂 H 型对发酵法生产的 -聚赖氨酸进行了分别提取；参考文献设
3、计了合理的工艺流程；离心分别发酵pH3.2 ，调剂滤液的pH值到8.5，过滤除去沉淀；滤液通过 D152离子交换柱 H型，用水和 0.2N 醋酸洗涤，用 0.1N的盐酸洗脱；用 1N的NaOH调剂洗脱液的 pH值到6.5，加入活性炭脱色后浓缩到小体积；加入乙醇和乙醚的混合物体积比 2:1后，析出白色晶体；关键词：-聚赖氨酸白色链霉菌发酵条件提取离子交换TitleThe study on ferment condition of Streptomyces albulus PL3-6 produced-PLAbstract-Poly-L-Lysine is comprised of lysine
4、linked by amide bond throughmicrobial fermentation. It has excellent antibacterial activity against Gram-positive and Gram- negative bacteria, yeast and some kinds of viruses. In additional-Poly-L-Lysine is soluble and attractive heat stable. The fermentation medium ofStreptomycesalbulus producing -
5、poly- L-Lysine was optimized by orthogonalexperiments. The optimalmedium consisted of3.0gL- 1glucose,0.5g L- 1 yeast extract,1.2g L -1NH 42SO4 ，0.20g L-1 KH 2PO4,0.12g L-1K 2HPO4, 0.05g L-1 MgSO 47H2O,0.003g L-1 FeSO47H2Oand 0.008g L-1 ZnSO47H 2O. The yield of -PL reached 4.05gL-1with optimalmedium,
6、 which increased 25% compared to initial medium.The separation and extraction of-Poly-L-Lysinefromfermentation liquidbyusing weak acid anion-exchange resin D152 .Theculture brothpH3.2 was filtered and the filtrate was adjusted to pH8.5.Then,the precipitateformedwasremoved by filtration. The filtrate
7、 was applied on a column of weak acid anion-exchange resin D152 H+- from and washedwith 0.2N acetic acid and water, successively. Thesubstancewas elutedwith0.1Nhydrochloricacid.Theeluatewasneutralized with1Nsodiumhydroxideanddecolorizedwithactivecharcoal, andthenevaporatedto a smallvolume.Thesubstan
8、cewasprecipitatedasawhitepowderby additionofan ethanol and ether 2:1mixture.Keywords:-Poly-L-Lysine；Streptomycesalbulus ；fermentcondition；extractionion exchange resins个人资料整理仅限学习使用1.1 -聚赖氨酸11.2 物理和化学性质1.3聚赖氨酸的发酵生产1.4争论价值2材料与方法2.1材料2.1.1菌种 2.1.2试剂 2.1.3相关溶液及其配制 2.1.4试验仪器 2.2方法2.2.1菌种的分别与纯化 2.2.2培育方法2.
9、2.3分析方法 2.2.4提取方法 2.2.5验证方法 3结果与争论3.1-PL 标准曲线的绘制10123555667778899103.2碳氮源优化试验 103.3无机盐优化试验123.4-PL 的提取14参 考文 献 20目次1引言 13.4.1发酵液的预处理143.4.2离子交换树脂的预处理153.4.3离子交换提取163.4.4发酵液的紫外吸取波长的测定163.4.5-聚赖氨酸组成定性分析 17结论18致谢191 引言随着人们生活水平的提高和健康意识的加强，对食品品质提出了更高的要求， 除了食品的养分、感官和外观包装外，食品的食用安全性更为人们所关注；由于食品的特殊性，对其防腐保鲜始终
10、是食品争论中的重要方面；长期以来，由于受到经济环境和开发水平的制约，几乎全部的食品都采纳化学合成防腐剂来延长食品的保质期；化学防腐剂假如超剂量使用会产生累积毒素和致癌作用，存在局限性；因 此，安全、广谱、高效及经济有用的自然食品防腐剂的开发和生产成为食品防腐领域进展的趋势和要求；微生物食品防腐剂是自然防腐剂中的一大类，其是指通过微生物发酵的方法，从发酵液中提取分别得到有抑菌作用的物质，主要为多肤类物质；目前，国际上批准使用的微生物食品防腐剂仅有乳酸链球菌素 Nisin 和纳他霉素 Natamycin ；我国分别于 1990年和1996年批准上述两种微生物防腐剂用于食品防腐保鲜；另外， -聚赖氨
11、酸也是一种抑菌成效明显的微生物食品防腐剂，其在日本应用广泛，在我国的争论才刚刚起步；由于这三种微生物防腐剂安全无毒、抑菌作用强，因此具有广阔的应用前景；1.1 1- 聚赖氨酸1977 年日本学者 S.shima 和 H.sakai1 从放线菌培育过滤液中提取出一种含有2530 个赖氨酸残基的同型单体聚合物；这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基通过 -梭基和 -氨基形成的酞胺键连接而成，故称为 -多聚赖氨酸 -PL；实际上多聚赖氨酸的合成是早在 1947 年由 K.L.Eprain 第一完成的 2但是化学法合成的聚赖氨酸为 型，其赖氨酸残基之间的酞胺键是由 -氨基和 -梭基缩合而成，争论也证明白 -PL
12、 比 -聚赖氨酸抑菌活性差且有毒性，因此目前在国际市场上； -聚赖氨酸作为食品防腐剂已经取代了 -多聚赖氨酸 3 ；1.2 2 物理和化学性质-聚赖氨酸是一种含有 25 30个赖氨酸残基的同型单体聚合物多肽；赖氨酸残基通过 -羧基和 -氨基形成的酰胺键连接 4 ；具有高抑菌活性 -聚赖氨酸的分子量个人资料整理仅限学习使用在3600 4300之间，当分子量低于 1300时， -聚赖氨酸失去抑菌活性；红外光谱分析说明: -聚赖氨酸在 16801640cm-1和1580 1520cm-1有强吸取峰 5 ；H-NH-CH 2-CH 2-CH2-CH2-CH-CO n-OH-聚赖氨酸结构式NH 2-聚赖
13、氨酸带正电荷，可以和阴离子物质发生结合；没有固定的熔点， 250以上开头软化分解；易溶于水、乙醇，但不溶于乙酸乙醋、乙醚等有机溶剂；能够承担一般食品加工过程中的热处理，热稳固性高， 120加热 10min 仍具有抑菌活性17，可以随原料一同进行灭菌处理，防止二次污染； -聚赖氨酸经 6NHCl 酸解 24h 后，测其赖氨酸的旋光度为 23.8，说明每个残基上携带 1molHCl 和水6 ；-PL 抑菌的最适 pH58，也就是说其在中性和微酸性环境中有较强的抑菌 性，而在酸性和碱性条件下，抑菌成效不太抱负；可能由于聚赖氨酸作为赖氨酸的 聚合物，在酸性和碱性条件下易分解 7；-PL 作为一种浓缩胶
14、质溶液的交联剂，它的效力对 pH 和胶质分布有依靠性；在胶质中，阳离子电荷与阴离子缩氨酸聚合物的平稳导致了胶体的不透亮性和最终导致网络结构的崩溃；在pH 接近中性的时候， L-聚赖氨酸可以作为一种有效的胶质网络交联剂8；1.3 3 聚赖氨酸的发酵生产最初用野生的 S . albulus 346 进行发酵的争论中， -PL 在最优化的培育基中的积存浓度是 0.5g/L；在发酵过程中， -PL 的最大积存浓度开头于pH 值 6.0；当细胞生长达到稳固状态，培育基pH 值的降低是 -PL 生产的关键 pH 值 3.05.0；在发酵过程中，在培育基中添加L-赖氨酸对 -PL 的生产没有影响后， Shi
15、ma 等发觉给静止的细胞中添加葡萄糖和硫酸铵作为培育基，且在酸性pH 值的条件下， - PL 的积存量可达 45 g/ L；-PL 在 pH 值 5.06.0 时产量快速下降，说明S . albulus 中含有 -PL 降解酶；为了提高 -PL 的生产力， Hiraki 等在 S .albulus 346 中选择出对 S-2-氨乙基半胱氨酸和甘氨酸 Glycine 有抗击力的变种；在野生种346 中， L-赖氨酸会导致天冬氨酸激酶合成的部分抑制，这种酶是L- 赖氨酸生物合成的关键酶，而甘氨酸可以抑制这种酶的活性；S-2-氨乙基半胱氨酸是 L-赖氨酸的类似物，在 2 mg/mLS-2- 氨乙基半
16、胱氨酸存在的情形下，S . albulus 346 的生长不会被抑个人资料整理仅限学习使用制；进一步增加甘氨酸到 1mg/mL 会抑制其生长；在对S-2-氨乙基半胱氨酸和甘氨酸耐受性的菌种中， 90%是 -PL 的高产菌；其中之一 11011A在测试管中的最大生产量是 2.11mg/mL，是野生种 346 的 10 倍；这个变种有很高的天冬氨酸激酶活 性；在 3L 摇瓶发酵罐中，以pH 掌握、葡萄糖和硫酸铵流加补料的方法，S . aLbuLus11011A在 120 h 内靠吸取葡萄糖的收益可达 20 mg/ mL 8.9% ；Kahar 等论证了利用 S . albulus 410 生产-P
17、L 中严格掌握 pH 值和葡萄糖浓度的重要性 9 ；在-PL 发酵生产中，培育基的 pH 值通常会从最初的 6. 8 降到 36h 后的 4.2，然后96h 内逐步降到 3.2；在 pH 值低于 4.2 后， -PL 开头逐步在培育基中积存，所以在 -PL 的生产中严格掌握 pH 值是有必要的； pH 值的掌握分 2 个阶段，第 1 阶段为菌体的生长阶段， pH 值大于 5.0 培育过程 pH 值自然下降，当低于 5.0 时，用氨水调剂 ；第 2 阶段为产物积存阶段， pH 值掌握在 4.0；在发酵过程中，发酵液的葡萄糖浓度掌握在 10g/L，当葡萄糖浓度低于 10 g/L 时，流加碳源和氮源
18、 含有 80%葡萄糖和 8%硫酸铵的培育基 ，使葡萄糖浓度维护在10 g/L 一般在 48 h 后 ，经过47 d 的发酵， -PL 的产率最高达 48.3 g/L；迄今为止 -聚赖氨酸的微生物发酵在日本已实现工业化，年销售量为1000 t；但在我国仍处于试验室阶段，小试和中试采纳易操作的分批发酵；1.4 4 争论价值随着人们对食品安全性的熟悉和要求的逐步提高，化学防腐剂受到严肃挑战， 食品防霉防腐剂的自然化已成为今后的进展趋势；自然防霉防腐剂是近年来国内外提倡、开发和寻求的新型产品，开发抗菌性强、安全无毒的自然防霉防腐剂已成为各国科技工作者的争论热点；它不但对人体健康无害，有的仍具有肯定的养
19、分价 值，是今后开发的方向；目前，国外食品防腐剂行业已相当成熟，开发出了数十种自然食品防腐剂，建立了完备的法规；国内对自然食品防腐剂的争论起步较晚，目前尚属初级阶段，为适应市场需求，国内学者也做了大量的工作；21 世纪是 绿色 的世纪，是追求食品安全与可连续进展的世纪；因此，开发绿色食品、有机食品成为提高经济效益，增加市场竞争力，提高人民生活质量的重要举措；随着人民生活水平的进一步提高， 自然食品防腐剂在食品加工保藏过程中将被广泛使用；生物技术的飞速进展，为开发、应用自然食品防腐剂开创了一条崭新的途径；至今 -PL 发酵生产的争论已历经几十年，目前虽然-PL 发酵生产已在日本实现工业化， -P
20、L 作为一种自然、无毒、可生物降解的聚氨基酸，不仅在食品工业有 广泛的应用，而且其在医药、环保、农业中的应用也将不断拓开；-聚赖氨酸在目前的日本添加剂目录表中属于一种自然添加剂，1989 年日本窒素公司第一用生物技术方法工业化生产聚赖氨酸，同年，日本在添加剂目录表中把-PL 归属于一种自然添加剂，并答应使用；以后韩国也答应作为食品添加剂使用；在美国和欧洲，主要是使用山梨酸作为防腐剂，但自2003 年 7 月 10 日 FDA 收到日本窒素公司的申请后，目前已正式批准GRAS Notice No GRN 000135 该公司生产的的-PL 作为自然食品添加剂；该公司仍将逐步把-PL 的应用拓展至
21、纤维、化妆品及其他货品，甚至把-PL 作为抗菌材料用于厨房及浴室用具中；国内对-聚赖氨酸的应用处于研发阶段，有关- PL 在医药和基因芯片领域的应用争论开展得较多，在食品方面目前尚未列入使用卫生标准；因此，-聚赖氨酸的争论及食品防腐剂的应用具有宽阔的前景和进展空间，- PL 特殊的物理化学性质可以应用到除了食品工业以外的其他很多领域，所以将来-PL 会有庞大的需求；今后的争论重点是选择到产聚赖氨酸的菌株，对其进行改造，大幅度提高产量；并加强基础争论，揭示其抑菌机理，同时加强应用争论；个人资料整理仅限学习使用2 材料与方法2.1 1 材料2.1.1 菌种白色链霉菌 2SO4天津市化学试剂三厂酵母
22、膏北京双旋微生物培育基制品厂蛋白胨北京双旋微生物培育基制品厂牛肉膏北京奥博星生物技术责任有限公司ZnSO 4 7H 2O洛阳市化学试剂厂FeSO4 7H2O上海其次钢铁厂MgSO 47H 2O洛阳市化学试剂厂NaH 2PO4洛阳市化学试剂厂Na 2HPO 4天津市科密欧化学试剂开发中心KH 2PO4天津市科密欧化学试剂开发中心K 2HPO 4天津市科密欧化学试剂开发中心甲基橙天津市化学试剂一厂盐酸洛阳市化学试剂厂醋酸开封化学试剂总厂乙醇洛阳吴华化学试剂有限公司磷酸开封开化有限公司NaOH天津市化学试剂厂丙酮洛阳市化学试剂厂甲醛洛阳市化学试剂厂茚三酮天津科密欧化学试剂开发中心-聚赖氨酸SIGMA
23、 固体标准品 2.1.3 相关溶液及其配制 101）0.1mol/L 磷酸钠缓冲溶液的配置取 62.5mL 的 0.2mol/L 的 NaH2PO4 溶液和 37.5mL 的 0.2mol/L 的 Na2HPO4混合即得到 0.1mol/L 磷酸钠缓冲溶液；2）1mmol/L 甲基橙溶液称取 0.0327g 甲基橙定容于 100mL 磷酸钠缓冲溶液中；3）1mol/L 和 0.1mol/L 盐酸溶液1mol/LHCl ：量取 90mL 的 36%-37%浓度的 HCl 定容于 1000mL 蒸馏水中；0.1mol/LHCl ：量取 9mL 的 36%-37%浓度的 HCl 定容于 1000mL
24、 蒸馏水中；4）1N 和 5N 的 NaOH 溶液1N 的 NaOH 溶液：称取 40g NaOH 固体定容于 1000 mL 蒸馏水中；5N 的 NaOH 溶液：称取 10g NaOH 固体定容于 50 mL 蒸馏水中；5）0.2N 的醋酸溶液称取质量分数大于 99.5%的浓醋酸定容与 500mL 蒸馏水中；6）0.1%磷酸溶液量取质量分数为 85%的磷酸定容于 1000mL 蒸馏水中；2.1.4 试验仪器仪器名称生产厂商723N可见分光光度计上海申安医疗器械厂752 紫外光栅分光光度计上海精密科学仪器有限公司PYXDHS40X50BS 电热恒温培育箱上海跃进医疗器械厂 GZXGF MBS1
25、9053A） 电热鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂LD5-2A型低速离心机北京医用离心机厂pHSJ-4A 型数字 PH 计上海雷磁仪器厂LDZX 50FB立式高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂TGL16C台式离心机上海安亭科学仪器厂FA12048 电子天平上海精密科技有限公司THZ-30 恒温培育摇床上海-恒科学仪器有限公司超净工作台苏州净化设备有限公司SWCJ2F 型双人双面净化工作台苏州净化设备有限公司立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂2.1.5培育基111）高氏一号培育基可溶性淀粉2g， K 2HPO40.05g， MgSO4 .7H2O0.05g， KNO 30.1g， NaCL 0.05
26、g， FeSO4.7H2O 0.001g，琼脂 1.5g，水 1000mL， PH 值 7.22）牛肉膏蛋白胨培育基牛肉膏 2g， 蛋白胨 10g， NaCl 5g，琼脂 15 g， 水 1000mL3）贝特纳培育基葡萄糖 1 g/L，蛋白胨 0.2 g/L，酵母膏 0.1 g/L，琼脂 1.5 g/L，pH 值 7.52SO41 g/L ，KH 2PO40.6 g/L， K2 HPO4 0.8g/L，MgSO 4.7H2O 0.02 g/L，FeSO4.7H2O 0.02 g/L，pH 值 6.8（ 5） 发酵培育基基本组成与种子培育基相同；在培育基碳氮源的优化试验中，碳氮源含量依据正交试验
27、设计进行 ，无机盐的含量同种子培育基；在碳氮源最有条件下进行无机盐优化，在无机盐的优化试验中，碳氮源按正交试验设计最有条件配制；2 2 方法2.2.1 菌种的分别与纯化 111）保藏菌种的活化与稀释涂布取一环试验室保藏菌株按 10-1 用无菌水进行适当的稀释，吸取不同浓度的菌悬0.1mL 装有 15mL 左右的贝特纳培育基的平板上， 30倒置培育 34d；再挑取菌落较大的进行划线分别；如图1：2） 抑菌圈法 图 1 聚赖氨酸划线平板底层铺 10mL 下层培育基，将培育好的单菌落点接至培育基上， 30下培育 2d，将上层培育基冷却至 50左右，加入 10%敏锐菌培育液摇匀，去 10mL 铺于底层
28、培育基上；点解菌落间距要足够大，以免抑菌圈相互重叠；将平板于 30恒温培育24h，显现边缘清楚的抑菌圈；3） 单菌落分别纯化选择抑菌圈较大的菌落转接到贝特纳斜面培育基， 30恒温培育 7d，待斜面完全被孢子掩盖，冰箱4） 储存备用；如图 2：2.2.2 培育方法1） 种子培育液的制备 图 PL3-6 菌株斜面取 1 环斜面菌种于装有50mL 种子培育基的500mL 三角瓶中，于30、220rmin-1 菌培育 24h 得到种子培育液；如图3、图 4：图种子培育液图培育后的种子液2） 发酵培育以 1%的接种量将种子液转接到装有50mL 发酵培育基的 250mL 三角瓶中，在 30， 220rmi
29、n-1条件下培育 72h；如图 5、图 6：图发酵培育基图发酵完成液2.2.3 分析方法对发酵法生产的 -聚赖氨酸进行了分别提取；2.2.5 验证方法 13对发酵液进行紫外扫描，测定其最大吸取波长；通过水解洗脱浓缩液中的聚赖氨酸经行纸层析，与标准赖氨酸的迁移率作对比；3 结果与争论3.1 -PL 标准曲线的绘制聚赖氨酸的溴化物，甲基橙从水中重结晶，并干燥至恒重，试验前将两者溶于pH 值为 6.6 的 0.1mol/L 的磷酸钠缓冲液中；取2mL 不同浓度的聚赖氨酸溶液2SO4 含量和酵母膏含量三个因素，利用正交表L934进行 3 因素 3 水平正交试验；试验设计、结果和分析如表1表 3 所示；
30、表 2 碳氮源优化正交试验L93 4因素水平表 g/L4Tab.2Factors and levels of orthogonal experiment L 9 3 foroptimizing carbon and nitrogen sources g/L水平A. 葡萄糖含量B.NH42SO4 含量酵母膏含量13.00.40.325.00.80.537.01.20.7表 3 碳氮源优化正交试验L 934结果Tab.3Results of orthogonal experiment L 9 34 for optimizing carbon and nitrogen sources试验号ABCY
31、-PL 产量 /g/L11112.88721223.26031333.46342123.15352233.00562313.18373132.48083212.49093323.120K 19.6108.5208.560K 29.3418.7559.533K 38.0909.7668.948R0.5060.4150.325Y i = 27.041K i2245.054244.615244.218Y i2 = 82.143以n表示试验的总次数， a、b、c表示A、B、C三因素每个水平的重复试验次数，就有n=9, a=3，b=3，c=3.先运算2= xi 2=27.0412=81.246，QA=
32、Ki2-2 =245.054-81.246=0.439，QB=QC=Ki -=244.615-81.246=0.292，2222Ki -=244.218-81.246=0.160.而 Q总=Xi 2-2=82.143-81.246=0.897于是误差： Qe= Q总- Q A + QB + QC）=0.897-方差分析Tab.4Variance analysis of orthogonal experiment L 9 34 for optimizing carbon and nitrogen sources方差来源平均和自由度均方差F 值显著性A0.43920.219573.167* *B0
33、.29220.146048.667* *C0.16020.080026.6 发67* *误0.00620.0030总和0.8978注：查F 临界值表F0.1 2， 2 = 9.00F 0.05 2， 2 = 19.00F 0.012， 2 = 99.00依据 F 值大小可知打算碳氮因素对试验影响从大到小的次序为：A B C再依据每个因素k 值大小可以看出，碳氮源含量正确水平为A 1B3C2，即葡萄糖3.0g/L、NH 42SO41.2 g/L、酵母膏 0.5 g/L ；从表 4 方差分析可以 看出， 葡萄糖 含量对 聚 赖氨酸产量影 响较 显著，NH 42SO4 含量和酵母膏对聚赖氨酸产量影响
34、显著；从在这个试验可以看出碳氮源对聚赖氨酸的生产特别重要，但由于试验室条件的影响，试验结果有很大的误差；3.3 无机盐优化试验以碳氮源最优条件为基础，在Streptomycesalbulus PL3-6 产聚赖氨酸的单因素试验基础上，选取无机盐 KH 2PO4 含量、 K 2HPO4含量、 ZnSO4.7H2O 含量、等五个因素，利用正交表 L 827经行 5 个因素两个水平正交试验；试验设计、结果和分析如表 5、表 6 所示；表 5 无机盐优化正交试验L 827水平表 g/LTab.5Factors and Levels of orthogonal experiment L 8 27 for
35、 optimizing inorganic salts g/L水平A. KH 2PO4B. K 2HPO 4C. MgSO 4 7H 2OD. FeSO 4 7H2OE.ZnSO 47H 2O10.1020.200.080.120.050.100.0030.0060.0040.008表 6 无机盐优化正交试验L 827Tab.6Results of orthogonal experiment L 8 27 for optimizing inorganic salts试验号ABCDEY -PL 产量 /g/L1111113.2412112223.2693121123.8324122213.2105211213.6386212123.5727221224.0018222113.713K 113.55213.72014.71214.35813.802K