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1、读书之法 , 在循序而渐进 , 熟读而精思一、培育基分类专题二 微生物的培育与应用课题一 微生物的试验室培育划分标准培育基类型作用物理性质液体培育基应用于工业或生活生产半固体培育基应用于微生物的分别和鉴定培固体培育基常用于观看微生物的运动及菌种保藏等养成分人工合成培育基常用于微生物的分别鉴定基自然培育基常用于实际工业生产分用途选择培育基抑制不需要的微生物生长,促进所需要的微生物类的生长鉴定培育基依据微生物的特点,在培育基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的,用以鉴别不同类别的微生物二、培育基的成分成分作用例子水碳源为微生物的代谢供应培碳元素的物质如 CO2 、NaHCO3 等无机碳源；糖类、石
2、油、花生粉饼等有机碳源,异养微生物只能利用有机碳源-+养氮源为微生物的代谢供应基氮元素的物质成如 N2 、NH3 、NO3 、NH4 （无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等；只有固氮微生物才能利用 N2分培育基仍要满意微生物生长对PH、特别养分物质以及氧气的要求；例如,培育乳酸杆菌时需要在培育基中添加维生素,培育霉菌时须将培育基的pH 调至酸性,培育细菌是需要将pH 调至中性或微碱性,培育厌氧型微生物是就需要供应无氧的条件三、 无菌技术 掌握无菌的目的掌握无菌的操作1. 防止试验室的培育物被其他外来微生物污染 2. 有效防止操作者自身被微生物感染消毒与灭菌的区分对试验操
3、作的空间、操作者的衣着和手,进行清洁和消毒；将用于微生物培育的器皿、接种用具和培育基等器具进行灭菌；为防止四周环境中微生物的污染,试验操作应在酒精灯火焰邻近进行；试验操作时应防止已经灭菌处理的材料用具与四周的物品相接触比较项常用的方法理化因素的作用强度煮沸消毒法,巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液毁灭微生物的数量部分生活状芽孢和孢子能否被毁灭消毒体）仍有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒灼烧灭菌（用于接种环、接种针、试管口等）、干较为温顺态的微生物不能灭菌热灭菌（用于玻璃器皿、金属用具等）、高压蒸汽灭菌（用于培育基、无菌水等）、紫外线灭菌法（表面灭菌和空气灭菌等使用）剧烈全部微生
4、物能四、制作牛肉膏蛋白胨固体培育基（1） 方法步骤：运算、称量、溶化、灭菌、倒平板；（2） 倒平板操作的步骤：（3 ）倒平板操作的争论争论问题答案1. 培育基灭菌后,需要冷却到50 左右时,才能用来倒平板；你用什么方法来估量培育基的温度？可以用手触摸盛有培育基的锥形瓶,感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时,就可以进行倒平板了为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培育基平板冷凝后,为什么要将平板倒置？平板冷凝后,皿盖上会凝聚水珠,凝固后的培育基表面的湿度也比较高,将平板倒置,既可以使培育基表面的水分更好地挥发,又可以防止皿盖上的水珠落入培育基,造成污染；在倒平板的过程
5、中,假如不当心将培育基溅在皿盖与皿底之间的部位,这个平板仍能用来培育微生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培育基上滋生,因此最好不要用这个平板培育微生物；五、纯化大肠杆菌方法平板划线法稀释涂布平板法将接种环放在火焰上灼烧,直到接种环烧红；在火焰旁冷却接种环, 并打开棉塞；将试管口通过火焰； 将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液；将试管通过火焰,并塞上棉 塞；左手将皿盖打开一条缝隙,右手操作将沾有菌种的接种环快速伸入平板内, 步骤划三至五条平行线,盖上皿盖；留意不要划破培育皿；灼烧接种环,待其冷却后,从第 一区域划线的末端开头往其次区域内划线；重复以上操作,在三、 四、五区域内
6、划线；留意不要将最终一 区的划线与第一区相连；将平板倒置 放入培育箱中培育；1. 稀释16将分别盛有9ml 水的 6 支试管灭菌,并按10 到 10的次序进行编号；用移液试管吸取1ml 培育的菌1夜,注入 10 倍稀释的试管中；用手指轻压移夜管上1的橡皮,吹吸三次,使菌液与水充分混匀；从102倍稀释的试管中吸取1ml 稀释液,注入 10 倍稀释的试管中,重复其次步的混匀操作；以此类推,直到完成最终一支试管的稀释；留意：移夜管需要经过灭菌；操作时,试管口和移夜管应在离火焰12cm处2 涂布平板：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；取少量菌液,滴加到培育基表面；将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃,待酒精
7、燃尽后,冷却810s ；用涂布器将菌液匀称地涂布在培育基表面目的使集合在一起的微生物分散成单个细胞,从而能在培育基表面形成单个的菌落（由一个细胞繁衍而来的肉眼可见的子细胞群体）,以便于纯化菌种1. 平板划线操作的争论争论问题答案1. 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作终止时,仍旧需要灼烧接种环 吗？为什么？在灼烧接种环之后,为什么要等其冷却后再进行划线？ 在作其次次以及其后的划线操作时,为什么总是从上一次划线的末端开头划线？操作的第一步灼烧接种环是为了防止接种环上可能存在的微生物污染培育物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线终止后,接种环上残留的菌种,使下一次划
8、线时,接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐步削减,以便得到菌落；划线终止后灼烧接种环,能准时杀死接种环上残留的菌种,防止细菌污染环境和感染操作者以免接种环温度太高,杀死菌划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开头,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步削减,最终能得到由单个细菌繁衍而来的菌落；2. 涂布平板操作的争论问题答案涂布平板的全部操作都应在火焰邻近进行；结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求,想一想, 第 2 步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证 “无菌 ”；例如,酒精灯与培育皿的距离要合适、吸管头不
9、要接触任何其他物 体、吸管要在酒精灯火焰四周等等六、菌种的储存方法适用的对象详细操作将菌种接种到试管的固体斜面培育基上,在合适 的温度下培育；当菌落长成后,将试管放入4的暂时保藏频繁使用的菌种甘油管藏需要长期储存的菌种冰箱中保藏；以后每36 个月,都要重新将菌种从旧的培育基上转移到新奇的培育基上在 3mL的甘油瓶中,装入 1mL甘油后灭菌；将 1mL培育的菌液转移到甘油瓶中,与甘油充分混匀后, 放在 20的冷冻箱中储存一、选择菌株课题二 土壤中分解尿素的细菌的分别与计数土壤中分解尿素的细菌的分别尿素尿素是一种重要的农业氮肥,尿素并不能直接被农作物吸取；只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后,才能
10、被植物利用；原理土壤中的细菌能合成脲酶将尿素分解所用培育基 选择性培育基（培育基的氮源为尿素,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,以尿素作为氮源；缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁衍, 而受到抑制,所以用此培育基就能够选择出分解尿素的微生物）配制选择培育基的依据依据选择培育的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的；例如,培育基中不加入有机物可以选择培育自养微生物；培育基中不加入氮元素,可以选择培育能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培育金黄色葡萄球菌等二、统计菌落数目（1） 直接计数法：常用显微镜直接技术法,一般适用于纯培育悬浮液中各种单细胞菌体的计数；（2）
11、 间接计数法：常用稀释平板计数法,平板培育基上长出一个菌落就代表原待测样品中一个微生物个体；当样品的稀释度足够高时,培育基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌；通过统计平板上的菌落数,就能估量出样品中大约含有多少活细菌；为了保证结果精确,一般设置3 5 个平板, 选择菌落数在 30 300 的平板进行计数,并取平均值；统计的菌落数往往比活菌的实际数目低,因此,统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；采纳此方法的留意事项： 1. 一般选取菌落数在 30300之间的平板进行计数三、设置对比设置对比的主要目的是排除试验组中非测试因素对试验结果的影响,提高试验结果的可信度；对比试验是指除了
12、被测试的条件以外,其他条件都相同的试验,其作用是比照试验组,排除任何其他可能缘由的干扰,证明的确是所测试的条件引起相应的结果；四、试验设计试验设计包括试验方案,所需仪器、材料、用具和药品,详细的实施步骤以准时间支配等的综合考虑和支配操作步骤详细操作缘由细菌相宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长,绝大多土壤取样距地表约 38cm 的土壤层取样数分布在距地表约 38cm 的土壤层取样样品的稀释微生物的培育与观看456测定土壤中细菌的数量,一般选用101010345测定放线菌的数量,一般选用101010测定真菌的数量,一般选用10 2 10 310 4培育时间：细菌 3037 12天,放线菌 2528
13、57天 ,霉菌 2528 34天观看：每隔 24 小时统计一次菌落数目、外形、大小、隆起程度、颜色保证获得菌落数在 30300之间、适于计数的平板四、 疑难解答（ 1）如何从平板上的菌落数估量出每克样品中的菌落数？每克样品中的菌落数= （ C/V ） *M其中, C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V 代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml ）, M 代表稀释倍数注：统计某一稀释度下平板上的菌落数,最好能统计3 个平板,运算出平板菌落数的平均值课题三 分解纤维素的微生物的分别一、纤维素与纤维素酶组成例子纤维素 一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物,是地球上含量最丰富的多糖类物质纤维素
14、酶 由 C1 酶、 CX 酶和葡萄糖苷酶组成,可将纤维素分解成葡萄糖棉花是自然界中纤维素含量最高的自然产物,木材、作物秸秆等也富含纤维素纤维素在纤维素酶作用下最终被水解成葡萄糖,为微生物的生长供应养分二、纤维素分解菌的选择方法原理刚果红染色法刚果红 +纤维素红色复合物当纤维素被纤维素酶分解后,刚果红纤维素的复合物就无法形成,培育基中会显现以纤维素分解菌为中心的透亮圈；这样,我们就可以通过是否产生透亮圈来选择纤维素分解菌三、分别分解纤维素的微生物的试验流程流程留意事项土壤取样选择富含纤维素的环境选择培育以纤维素为 C源,增加纤维素分解菌的浓度梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培育基上选择产生
15、透亮圈的菌落刚果红染色法：一种是先培育微生物,再加入刚果红进行颜色反应,另一种是在倒平板时就加入刚果红四、课题延长对分解纤维素的微生物进行了初步的选择后,只是分别纯化的第一步,为确定得到的是纤维素分解菌,仍需要进行发酵产纤维素酶的试验；纤维素酶的测定方法,一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定；五、疑难解答（1 ）为什么要在富含纤维素的环境中查找纤维素分解菌？由于生物与环境的相互依存关系,在富含纤维素的环境中,纤维素分解菌的含量相对提高,因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于一般环境；（2 ）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应当埋进土壤多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集合,实际上是人工设置纤维素分解菌生存的相宜环境；一般应将纸埋于深约 10cm左右腐殖土壤中；（3 ）为什么选择培育能够“浓缩”所需的微生物？在选择培育的条件下,可以使那些能够适应这种养分条件的微生物得到快速繁衍,而那些不适应这种养分条件的微生物的繁衍被抑制,因此可以起到“浓缩”的作用；