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1、精品学习资源试验室分子生物学试验基本操作标准及留意事项一、酶与载体的分装酶类与载体： T 载体50 ng/l 用灭菌水稀释 4 倍12.5 ng/l后分装成 10 l 或20 l；连接酶 solution按 5 l 分装； dNTP10 mM 分装成 50 l ； 无菌水分装成 1 ml ；留意：1全部分装都必需用已灭菌的管；2全部工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行；3工具酶、载体以及试剂盒等试验室共用物品，用完后必需准时放回原处，以免耽搁他人使用；4当你发觉你使用的是最终一管盒公用物品时，请立刻告知负责人购买，以免耽搁使用；5感受态， 氨苄青霉素和 IPTG 由讨论生轮番负责制备； 每人负
2、责六个月；其他试剂就由第一位使用新包装的同学分装；由于分子试验工具酶比较容易失活，必需在冰上进行分装；二、常见抗生素及 IPTG 的配置以氨苄青霉素为例：1. 预备足够量的 1.5 ml 的 EP 管、两个 100 ml 的离心管、 0.22 m 水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌；2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作；3. 称取 2 g 的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜；4. 用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，慢慢推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml 的离心管中；
3、留意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，仍要防止染菌；欢迎下载精品学习资源5. 把 100 ml 离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml 的 EP 管中，每管0.5 ml；在 EP 管上做好标记，包括名称、浓度、日期等；6把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP 管于-20储存；留意：当你发觉你使用的是最终一管抗生素时， 请立刻告知有关人员准时配制，以免耽搁使用；名称储存浓度工作浓度氨苄青霉素 ampicillin 100 mg/ml50 g/ml100 g/ml卡那霉素 kanamycin 10 mg/ml10 g/ml50 g/ml氯霉素 chloramphenicol 25 mg/
4、mlg/ml25 g/ml链霉素 streptomycin 50 mg/ml10 g/ml50 g/ml四环素 tetracyyline 10 mg/ml10 g/ml50 g/mlIPTG1 M-0.6 mM表 1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度欢迎下载精品学习资源三、分子生物学试验中各种试剂与溶液的配制 分子生物学试验中各种试剂与溶液的配制参见分子克隆；四、总 DNA 的提取详细步骤参考试剂盒说明书； 留意：革兰氏阳性菌 DNA 提取时需要加溶菌酶；欢迎下载精品学习资源五、基因扩增1. 引物与合成：设计引物序列，发至生工公司进行合成 jinansangon；2. 引物配制：合成后的引物先离
5、心至管底，然后按说明书用无菌水稀释至10-50M ，分装至无菌 EP 管中，做好标记肯定要标记浓度！ 后，于-20度储存备用；3. PCR 反应体系配制：将所需各组分在冰浴中化开后，进行PCR 反应体系配制；反应体系及反应参数按不同聚合酶的说明书进行，以transgen 的easyTaq酶扩增 1kb 基因序列为例，100 l 反应体系为：10buffer 10l，dNTP 10 mM 2l, 引物各 2 l 10-50M ，模板 1 l依据浓度加减体 积，Taq 酶 1 l，ddH2O 82 l留意：加入次序为：水， buffer ， dNTP ，引物，模板，酶 ；涡旋混匀，分装至四 -五管
6、，瞬时离心；留意：假设反应时间较长在反应混合液的上层加10-20 l 的矿物油防止样品在 PCR 的过程中蒸发；4. 将管放入 PCR仪中， 在 PCR 仪上设置好 PCR 反应参数， 例如： 94 5 min，94 40 sec，Tm 55 1 min， 72 2 min，72 10 min，16 1 h, 一般设 30 个循环；待温度降至 16 后停止 PCR 仪，尽快取出样品， 不答应过夜；欢迎下载精品学习资源六、琼脂糖核酸电泳1. 电泳缓冲液的配制：电泳缓冲液一般为TAE或 TBE,其配制方法参见表 2，先配制 50母液放于 4 度冰箱中，电泳时稀释100 倍使用；2. 将制胶模具和梳
7、子冲洗洁净，架好梳子；3. 依据欲别离 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制相宜浓度的琼脂糖凝胶表3：精确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液；4. 放入到微波炉内加热至胶粒全部熔化一般沸三次即好 ,冷却片刻，倒入制胶模具中，待其凝固；a) 室温下 30-45 分钟后凝胶完全凝聚， 当心拔出梳子， 将凝胶安放在电泳槽内；b) 向电泳槽中倒入电泳缓冲液， 其量以没过胶面 1 mm 为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；c) 在 DNA 样品中加入 1/5-1/10 体积的上样缓冲液 1% SDS, 50%甘油, 0.05%溴酚蓝，混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶 加
8、样孔内；5. 接通电源，红色为正极，黑色为负极， 切记 DNA 样品由负极往正极泳动 靠近加样孔的一端为负 ；依据胶的长度设定电压，一般 5-8 V/cm ， 电泳 20-40 min, 溴酚蓝跑完胶板的 3/4 左右即可；6. 电泳完毕，关上电源，戴上手套，将胶放入 g/ml的溴化乙锭 EB溶液中，室温下染色 5-10 min；7. 蒸馏水中漂洗一下， 置于紫外灯下或凝胶成像仪上观看电泳带及其位置， 并与核酸分子量标准 Marker 比较被扩增产物的大小；假如要切胶回收， 最好在观看台上铺上塑料片观看，防止污染以及紫外灯引起DNA 突变；留意：溴化乙锭 EB有剧毒，操作时应留意安全，戴手套操
9、作；但是要防止污染染色池和切胶板以外的区域；操作完后手套和胶分别放入垃圾桶和回收桶；表 2. 电泳缓冲液 TAE 配方欢迎下载精品学习资源电泳缓冲液配方表 3.琼脂糖凝胶浓度与线形DNA 的最正确辨论范畴缓冲液使用液浓贮存液每升Tris- 乙酸 TAE ： 2 mol/L Tris- 05 mol/L EDTA乙酸50 ： 242 g Tris 碱ml 冰乙酸100mol/L EDTApH 8.0琼脂糖凝胶浓度与线形琼脂糖凝胶浓度DNA的最正确辨论范畴线形 DNA 的最正确辨论范畴bp0.5%1,000 30,0000.7%800 12,0001.0%500 10,0001.2%400 7,0
10、001.5%200 3,0002.0%50 2,000欢迎下载精品学习资源七、回收与连接1. 将切下的目的条带依据回收试剂盒说明书进行产物回收；2. 连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度；稀释好的 T 载体浓度为12.5 ng/l ，不用再确定浓度，每次用量为1 l；3. 连接反应体系的配制1用 Solution I 连接时，取一只分装的 Solution I 离心管含 5 l Solution I ，加入待连接的两个 DNA 样品：载体与片段载体与片段的 mol 比为 1： 3-5，加水补足 10 l；2用 T4 连接酶 5 l 连接时，取一只灭菌 PCR 管，加入 10连接 buffer
11、 1 l，待连接的两个 DNA 样品：载体与片段载体与片段的 mol 比为 1：3-5， T4 连接酶 1 l，加水补足 10 l；3连接至 T 载体时反应体系一般为： 回收的 PCR 产物 4 l, solution I 5 l，4 倍稀释的 pMD-18T 克隆载体 12.5 ng/l1 l；留意：加入次序为：水， buffer ， DNA 样品，酶4. 混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底；5. 将离心管置于 16 孵育 4 h 以上或过夜；欢迎下载精品学习资源八、 E. coli DH5 和 Bl21 感受态细胞的制备 采纳 CaCl2 制备法制备 E. coli DH5 感受态细胞，
12、步骤如下：1. 预备试验：1预备 LB 固体培育基和分装于试管 2-5 ml和三角瓶 100 ml 的液体培育基；2分别配制含 15%甘油的和不含甘油的 0.1 M CaCl 2；3预备洁净培育皿、 特别洁净 的 100 ml 离心管 2 只， 1.5 ml EP 管 50 只，1ml 和 200l 枪尖各一盒；4将以上培育基和物品高压灭菌；2. 在 LB 平板上活化 i DH5 ；将活化的 i DH5 单菌落接种于成含 LB 培育基的试管中， 37 摇床过夜培育；3. 其次天按 1%接种量接种到含 100 ml LB 培育基的三角瓶中， 37 摇床培育至 OD600=0.4-0.6 约 2
13、h；4. 冰浴 10 min，倒入灭过菌的 100 ml 离心管中离心， 4000 rpm，10 min，4 ；5. 去掉上清，加 20 ml 配制好的已灭菌的 0.1 M CaCl 2，将菌体打散后静置 20 min， 4000 rpm 离心 10 min，去掉上清；6. 加 1-2 ml 灭菌的 0.1 M CaCl2 含 15%甘油制成感受态细胞；将制好的感受态细胞分装成 50 l 小份储存于 -80 冰箱；7. E. coliBl21 和 BL21DE3 的制备方法同上；留意：1全部操作均在冰上进行； 2整个制备过程必需保证无菌操作； 3E.coli Bl21 ， BL21DE3 ，D
14、H5 菌种每学期更换一次；欢迎下载精品学习资源九、转 化1. 取 50 l 感受态细胞于冰浴上融解；2. 加入 10 l 连接产物或 3-5 l 纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴 20 min；3. 放入 42 水浴中热激 90 秒，立刻放入冰浴中 2-10 min；4. 加入 ml 不含抗生素的 LB液体培育基，于 37 培育 1 h；5. 将培育物 4000 rpm 离心 3 min，保留约 200 l 上清于管中，将菌体用无菌枪尖轻 轻打散，匀称涂布于含 100 g/ml Amp +的平板外表，平板于 37 先正置 1-2 h，后倒置培育 12-16 h 至菌落显现；十、重组子的挑选和鉴定从转
15、化平板上挑取白色菌落，转接至含抗生素Amp+100 g/ml 的LB 液体培育基， 37 振荡培育过夜；菌液可以用以下三种方法验证是否是阳性转化子；留意：同时培育阴性菌落作为对比！一酚抽验证取1 ml菌液12,000 rpm 离心1 min收集菌体，尽量倒洁净上清后加入 50 l Tris 饱和酚和 50 l 水，漩涡震荡 5 min充分混匀； 12,000 rpm离心10 min后快速取上清进行琼脂糖凝胶电泳；二质粒酶切验证1. 依据质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，用未插入片段的质粒作为阴性对比，进行琼脂糖凝胶电泳；电泳后可依据质粒的大小初步判定质粒中是否有插入片段，并估计质粒的浓度；2.
16、 利用引物中设计的酶切位点或质粒上的酶切位点，对质粒进行酶切；根据待切质粒的浓度确定要加的体积 , 挑选合适的限制性内切酶和配套Buffer；3. 在离心管中加入如下成分：10Buffer2 l待切样品x l 一般为5 l 左右酶1 l10U/ul加灭菌水补足 20 l酶的多少并不是一成不变的，关键要看待切DNA 的浓度，假如浓度较低，欢迎下载精品学习资源可以适当少加酶；不要在 20 l 体系中加入超过 2 l 的酶，那样简单产生星号活性；4、混匀样品并短暂离心使样品沉于管底；5、将离心管置于 37 中温育 2 h，假设待切样品为 PCR 产物，就可将反应时间适当延长；最长酶切时间要取决于是否
17、会产生星号活性； 假如 50l 体系加入 1l 酶，就可过夜酶切一般不会显现星号活性；6、用未酶切的质粒作为对比，琼脂糖电泳鉴定酶切结果；留意：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当扩大反应体积；不同内切酶最适酶活温度不同， 如 BamH I 最适酶活温度为 30 ； 双酶切可选用二者活性都较高的 Buffer 或者通用 Buffer ，但要留意不能有星反应；三菌落 PCR挑取培育皿上的部分菌落或取l 菌液作为模板进行 PCR扩增，每管反应体系最低可少至 10 l ，琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增结果；假设为阳性转化子，可检测到插入的目的条带；将鉴定好的阳性转化子菌液 500 l 送上海博尚生物技术进行序列测定； 留意： 冬天温度很低时需做成甘油管样品送测！欢迎下载