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1、下载可编辑经过分级纯化的多糖在测定结构前须检查纯度最常用的判定方法：检查其纯度 及测定分子量 ；（ 1）用 G C 、HPLC 测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定；用不同的柱型测定结果更为牢靠；（ 2）电泳 只显现一条带；如可用 聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳；对于中性多糖可采纳高压电泳,以硼酸盐为缓冲液,可增大其迁移速度；（ 3）凝胶柱层析 图出现对称的单峰；如有“拖尾”现象,说明其均一性不够好；阴离子交换层析纯化用 DEAE一纤维素 522.6x100cm 柱层析 ,0.lmol/LNaCl洗脱 , 流速 6ml/h, 按 2ml 一管分部收集 , 苯酚一硫酸法逐管
2、检测峰；, 绘制收集体积与糖含量之间的关系曲线；看是否有单一对称依据 Ye等报道 , 采纳 DEAE一 52 一纤维素交换柱层析法2.6x30cm 对鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖进行初步分别；DEAE一纤维素凝胶预处理 : 称取 DEAE一 52 一纤维素凝胶干粉, 加入约 10 倍体积质量比 ml/g的 0.5mol/LNa0H 溶液浸泡 30 分钟 , 倒出上清液 , 用大量去离子水反复浸洗至 pH 值近中性 ; 再用相同体积的 0.5mol/LHCI溶液浸泡 30 分钟 , 倒出上清液 , 用大量去离子水反复浸洗至pH 值近中性 ; 最终用相同体积的0.5mol/lNaOH溶液再浸泡 30 分
3、钟 , 用 大 量 去 离 子 水 反 复 浸 洗 至 pH 值 中 性 ； 处 理 完毕 后 , 进 行 湿 法 装柱 , 用 去 离 子 水0.5mol/LNaCl溶液 , 去离子水依次分别平稳 流速 1.0ml/min2一 3 个柱体积备用 .-1糖样 100mg溶于 5ml 的去离子水中 , 离心除去不溶物 , 上样于 DEAE一 52 一纤维素阴离子层析柱 2.6x30cm,Cl型 , 分别采纳去离子水0.1 和 0.3mol/LNaCI溶液进行分段梯度洗脱, 流速 1.0ml/min,自动收集器分部收集 10ml/ 管 , 每梯度 20 管；用硫酸一苯酚法跟踪检测各 管多糖含量 4
4、90nm 处吸取值 , 以收集的管数为横坐标；吸光值490nm 为纵坐标绘制DEAE 一 52 一纤维素色谱柱洗脱曲线；依据洗脱峰型 , 合并相同组分 ,50 旋转蒸发浓缩 , 对去离子水透析 48h 以去除 NaCI 及小分子杂质 , 最终将透析液冷冻干燥, 得初步纯化产品；初步纯化多糖得率运算公式:多糖得率 %= 纯化多糖质量 / 粗多糖质量 x100%葡聚糖凝胶层析纯化采纳 Sephadex G-100 凝胶层析法对 DEAE-52一纤维素初步纯化的不同组分的多糖样品进一步纯化；葡聚糖凝胶sephadexG 一 100 的预处理 : 称取 sephadexG 一 100 凝胶干粉 , 加
5、入 30 倍体积质量比 ml/g 的去离子水 , 沸水浴 5 小时使其溶胀；冷却后用去离子水反复浸洗, 减压脱气后进行湿法装柱, 用 0.1MNa2SO4; 溶液平稳 流速 0.25ml/min2一 3 个柱体积备用；.专业.整理.第 2 页,共 22 页下载可编辑分别称取经 DEAE一纤维素一 52 初步纯化的各多糖组分样品20mg,溶于 2 ml 0.1 MNa2 SO4 溶液中 , 上样于 SephadexG一 100 层析柱 2.6x60cm 用 0.1MNa2SO4 溶液溶液洗脱 , 流速0.25 ml/min,分步收集 5ml/ 管 ；用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量490nm
6、处吸取值 , 以收集的管数为横坐标；吸光值 490nm 为纵坐标绘制 sePhadexG 一 100 色谱柱洗脱曲线；依据洗脱峰型, 合并相同组分,50 旋转蒸发浓缩 , 对去离子水透析 48h 以去除 Na2SO4 ; 及小分子杂质 , 最终将透析液冷冻干燥 , 得不同纯化产品；纯化多糖得率运算公式:纯化多糖得率 %=纯化多糖质量 / 粗多糖质量 x100%（鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖）（ 4）纸层析法 呈单一集中斑点；取 0.5%的多糖样品溶液 50ul, 点样于新华中速滤纸 3cmx20cm 距端点 1cm 处的中部 , 以正丁醇 : 浓氨水 : 水 4O:50:5为绽开剂 , 饱和 2 小
7、时以上 , 在室温下绽开 6h, 取出吹干 , 用 0.5%甲苯胺蓝液染色 , 立刻用 95%乙醇漂洗至背景褪色, 看是否只有一个清楚的斑点；（ 5）琼脂糖 Agarose 凝胶电泳法在琼脂糖板 厚度为 0.2cm 上点样 3 一 5ul采纳浓度为 0.075mol/L,pH8.6的巴比妥缓冲液 , 电泳 1-1.5h,电压为 64 一 80V, 甲苯胺蓝 浓度为 1%染色 , 醋酸乙醇混合溶液 醋酸: 乙醇: 水=0.1:5:5脱色；多糖纯品经电泳绽开后, 看是否出现单一斑点 , 斑点是否清楚；（ 6）紫外分光光度法将多糖 PWZ加 0.9%NaCI 溶液溶解 , 配成浓度为 1mg/ml
8、的溶液 , 采纳 UV一 16OA紫外可见光谱仪扫描 200nm 一 30Onm观看 260nm、280nm处是否有吸取峰；多糖的分子量测定：过去用 超速离心沉降法、 光散射法、 渗透压法、粘度法 等,这些方法操作复杂且误差较 大,现已少用； 现在较常用的方法有 凝胶过滤法 和高效凝胶液相色谱法 ,这两种方法须先用已知分子量的标准多糖对比测定样品的分子量；一般来说, 多糖结构分析 包括以下几点：（1） 单糖组成分析：讨论确定单糖的种类及摩尔比；完全酸水解 后用 高效液相色谱方法 HPLC或气相色谱方法测定 ；（2） 糖苷键类型：讨论确定糖苷键及支链点连接位置； 甲基化分析方法高碘酸氧化法与 S
9、mith 降解法（3） 糖环大小：讨论确定糖苷键为呋喃糖或吡喃糖； 红外光谱（4） 异头碳构型：讨论确定糖苷残基的a- 或 P- 构型；2D NMR.Two dimensional Nuclear Magnetic Resonance光谱分析方法 测（5） 确定单糖残基和重复单元的序列甲基化分析方法与磁共振光谱分析方法结合分析,一般会 参考多糖的单糖组成及摩尔比信息以利于解析多糖结构；高碘酸氧化法薄层层析 TLc 定性, 气相色谱法（6） 取代基团位点：讨论0H- 修饰基团的种类和取代位点,如0- 磷酸化,乙醜基取代,0-.专业.整理.第 5 页,共 22 页硫酷化等；比色分析方法（7） 多糖
10、分子量分布的讨论；紫外光谱定性与定量方法薄层层析： 残基定性气相色谱： 残基定量气质联用： 残基定量高效阴离子色谱法： 残基定量鉴定结构常用物理化学方法：高效液相色谱 : 确定单糖组分和相对分子量红外光谱分析 : 测定多糖的官能团,不仅可以检测酮糖、酵糖的耻喃糖环或呋喃糖环的构象和糖苷键的构型核磁共振 : - 构型与 - 构型残基的比例；判定异头碳构型；推断主链和支链连接键型鉴定结构复合方法：甲基化分析 : 推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例高碘酸氧化法与 Smith 降解法 : 判定糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目糖睛乙酸酷衍生物的气相色谱法: 单糖组成和摩
11、尔比各种多糖化学结构鉴定方法的详细实施方案1、酸水解（1） 完全酸水解-1称 取 20mg 样品 ,加入 2mL 2mol L的 H2SO4 于安培管中沸水浴水解8h,水解液用BaCO3 中和至pH =7 ,离心 ,取上清夜置冰箱冷藏备测；（阿魏侧耳子实体多糖分别纯化及其化学结构的初步讨论）（2） 部分酸水解称取糖样 70mg,80条件下, 0.05M 三氟乙酸水解 2h ；降至室温后, 离心（ 4000r/min , 10min）,将沉淀干燥,留做GC 分析；上清用无水乙醇除酸至中性pH 为 6 7 ,蒸馏水透 析 48h ：将袋外透析液浓缩,真空干燥,留做GC 分析；袋液浓缩至5ml左右,
12、加 10倍体积无水乙醇,醇沉过夜,离心4000r/min,10min ,沉淀常规干燥,作GC 分析；上清浓缩, 真空干燥,留做 GC 分析；2、高效液相色谱确定样品的单糖组成色谱条件为 :色谱柱为 Shodex KS804 Sugar300mm 7.8mm-1柱温 40 度流淌相为水流速 0.8mL min检测用 410R 示差检测器,数据处理用810GPC软件进行；同时用鼠糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、岩藻糖8 种单糖进行.专业.整理.下载可编辑对比 ,依据峰值确定样品的单糖组成；分子量的测定 以标准分子量的葡聚糖Pulluan作分子量测定标准；让其通过高压液相色谱柱 ,
13、Pulluan条件同上 ,先以分子量对数与对应的保留时间作标准曲线,从标准葡聚糖的工作曲线上可以求得该成分分子量；例如：（阿魏侧耳子实体多糖分别纯化及其化学结构的初步讨论）将水解后的多糖样品PW2进行 HPLC分析 , 结果如表所示 : 阿魏侧耳子实体多糖PW2经过酸水解后 , 得到 2 种单糖 : 葡萄糖和半乳糖 , 摩尔比例 1.77 1；例如：经 HPLC测定后对比标准曲线得多糖分别纯化及其化学结构的初步讨论）PW2的分子量为 3.18 10 ；（阿魏侧耳子实体多糖44、甲基化分析1基本原理先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化,然后将多糖中的糖苷键进行完全酸水解, 水解后得到的化
14、合物,其羟基所在的位置,即为原先单糖残基的连接点；同时依据不同甲基化单糖的比例,可以估计出此种连接键型在多糖重复结构中所占的比例；用此种方法得到的羟基及NaBH4 仍原醛基后产生的羟基,经乙酰化可得到甲基化的糖醇 乙酸酯 此产物易挥发, 可进行 GC分析 ,再经 GC与 GC-MS分析, 通过气相色谱的出峰次序和对质谱谱图的主要离子碎片的分析便可以较精确地确定糖的连接键型；反应通式如下 :第 26 页,共 22 页（2 甲基化反应取充分干燥的多糖样品10 mg,溶解在 2.0 ml的二甲基亚矾（ DMSO中；在 N2 爱护下快速加入干燥的NaOH粉 50 mg,用 N2 排出空气,加盖密封,室
15、温反应1.0 h并间歇振荡；在 N2 爱护下缓慢滴加碘甲烷1.0 ml ,用 N2 排出空气,加盖密封,室温连续反应1.0 h并间歇振荡,反应完成后加0.5 ml水终止反应；反应液先用自来水流水透析48 h ,再用蒸馏水透析 24 h ,透析液冷冻干燥得第一次甲基化样品；第一次甲基化样品连续甲基化,反应步骤同上,得其次次甲基化样品； 如此重复甲基化三次； 甲基化后的样品用红外光谱检测,3700.专业.整理.cm-1 3100 cm -1 ,邻近无羟基的特点吸取峰,说明甲基化反应完全；（3 甲基化样品的衍生化上述完全甲基化多糖样品加入2 mol/1 的三氟乙酸 TFA 3.0 ml, 120密闭
16、水解 2.0 h；冷却后 50减压蒸发干,加2.0 ml甲醇再蒸发干,重复三次,最终蒸发干得完全甲基化多糖的水解产物；加蒸馏水2.0 ml使其溶解,再加硼氢化钠25 mg,振荡后室温仍原反应 2.0 h ；反应完后滴加 0.1 mol/1醋酸分解过量的硼氢化钠并调pH 值至 5.57.0弱酸性；反应液 50减压蒸发蒸干,加2.0 ml甲醇再蒸干,重复三次,最终蒸发干；上述蒸发干样品加入1.0 ml醋酸酐和 1.0 ml吡啶,封管后在沸水浴中反应1.0 h ；反应液 50减压蒸发干,加 2.0 ml 甲醇再蒸发干,重复三次,最终蒸发干；加入丙酮1.0 ml, 用 0.45ul尼龙微孔滤膜过滤,取
17、样进行GC/MS分析；4 衍生化样品的 GC/MS分析多糖样品经甲基化、水解、仍原、乙酰化后得到甲基化糖醇乙酸酯,进行GC/MS联机分析,依据文献的相对保留时间和不同单糖的主要离子碎片m/e ）,推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例；本试验采纳的条件为 :GC Varian CP3800型 和 MS （Varian Satum 2200型 气相一质谱联用仪, DB-5MS石英毛细管柱 30 m X0.25 mm X0.25um;程序升温,初温 80,保持1 min ,以 8 /min升至 210,保持 1 min ,再以 20 /min升至 260 , 保持 1 min; 氦气作
18、载气,进样口温度250,分流比 1: 50 ,柱流速 1.0 ml/min;电子电离源 EI 源 70 eV , 倍增器电压 350 V,灯丝电流 250uA,接口温度 260 , 离子源温度 180,质荷比 m/z 扫描围 30450,扫描速率 2.5 scan/sec ；（胞式层孔菌菌丝体多糖分别纯化、结构鉴定及其生物活性讨论）流程图如下： （ MAEP-2a-2b 是安络小皮伞菌丝体多糖的某个过程中第某个样品）.专业.整理.例如：经过甲基化反应的MAEP-2b-2a通过 GC-MS 分析,结合其各峰位保留时间和质谱.专业.整理.碎片峰,判定样品的结构并运算摩尔百分比；从表 14 中,可以
19、看出 MAEP-2b-2a 中糖部分是以（ 1 2,1 6）连接的 Man（甘露糖）为主链；（ 1 2）连接的 Man（甘露糖） 在其 4 位上有分枝点 ,（ 1 6）连接的 Man 在其 2 位上有分枝点；在这些分枝点上,连接着由 Gal 和 Glu 为主组成的侧链； MAEP-2b-2a 的非仍原末端是由 Gal,Man,Glu 组成；从甲基化结果的摩尔百分比运算,各分枝点摩尔百分比之和低于非仍原末端摩尔百分比之和,由 PMP 衍生化组成糖分析结果可知,尚含约 9%的 GalA ,糖醛酸在复杂多糖中可能以分枝点的形式存在,故估计在MAEP-2b-2aMAEP-2b-2a中仍有大量的 Gal
20、A作为分枝点而存在； （络小皮伞菌丝体多糖）.专业.整理.（茶源多糖结构鉴定）5、红外光谱分析取干燥样品微量 ,压片 ,全波段扫描 ；例如：阿魏侧耳子实体多糖分别纯化及其化学结构的初步讨论-1-1图中显示在 4000cm 650cm区的是具有多糖类物质的一般特点；-13372cm的吸取峰是 O-H和 N-H的伸缩振动峰 , 2931cm-1-1为 C-H的吸取峰 ,即为 -CH和-CH2 的共振吸取锋；这两类是糖类的特点吸取峰；848cm 吸取峰 说明在 PW2（文中提纯-1-1的其次种成分）多糖纯品结构中存在型 即 端基差向异构体, 1026cm 、 1081cm和1152cm-1 的吸取峰
21、 说明 PW2 中的糖环为 吡喃糖环 ,这是由醚键 C-O-C振动而产生的吸取-1峰; 而呋喃糖环在此区间上只有两个强吸取峰；在 890cm 处有柔弱吸取 ,说明样品中含有-1-1少量 型糖苷键 ,而在 810cm 处没有振动吸取峰说明 没有甘露糖 的存在； 928cm为糖类-1分子振动吸取峰 ,即 D-吡喃糖 的非对称环伸缩振动产生；而1725cm 的存在 ,说明多糖含有糖醛酸基团 ,即 PW2 为酸性多糖；.专业.整理.3、核磁共振将样品 10mg ,溶于 D 2O重水 中 ,溶解温度 80 ,分别在 400MHz和 500MHz上测定131HNMR和CNMR；（阿魏侧耳子实体多糖分别纯化
22、及其化学结构的初步讨论）（1） 氢谱分析例如：5.39吸取峰 说明样品的 主要构型为 - 构型,由于存在 4.97吸取峰 的存在 ,说明存在 少量的 - 构型 - 构型 C-1 信号在 103 以下 , H-1 信号在 5.0以上 ; - 构型 C-1 信号在104 以上, H-1信号在 5.0以下 ；且 - 构型与 - 构型残基的比例为1 0.2843 ；（2） 碳谱分析例如：由图及表 2可以看出 : C-1 信号在 100.4ppm,即处在 90-103之间 ,说明多糖的 异头碳的构型为 - 构型 ,同时可以看到存在一个柔弱的117ppm 峰,说明样品中有少量的 - 构型 ,峰的相对高度正
23、比于碳的数目,即 - 构型与 - 构型残基的比例为1 0.29 ,这个结果和红外光谱以及氢谱的结论完全吻合；.专业.整理.图中 70 76之间的碳共振峰分别是未被取代的C-2 、C-3、C-4,其中 , 与 两种构型的共振峰重叠严峻,由于 77.906为被取代的 C-4的糖苷键的共振峰 ,图中可以看出存在重叠峰 ,这是由于与两种构型和两种单糖造成的,（小邱：不是很明白它的 意思,后面估计说应当是C-4 上有支链） C-6 部分共振峰由 61.114 向低场移动到 69.977说明多糖 PW2 存在 1-6 糖苷键 ,依据峰高比例可以大约看出多糖PW2 的主链为 1-6糖苷键 , 存在 1-4糖
24、苷键的支链；由 C-1和 C-6的峰高比例可以看出多糖PW2 的支链不多；6、高碘酸氧化法与Smith 降解法（1）原理高碘酸氧化是一种挑选性的氧化反应,它只能作用于多糖分子中连二轻基及连三轻基处；当 连二轻基的 C-C 键被断开 后, 产生相应的醛 ; 当断裂连三轻基的C-C 键时, 产生甲酸及相应的醛 ；此反应定量进行,每断开1 mol C-C 键,消耗 1 mol 高碘酸,由此可知, 每生成 1 mol 甲酸必定对应消耗2 mol 高碘酸； 因此, 通过测定高碘酸消耗量及甲酸生成量,便可以判定糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目等；高碘酸氧化产物经NaBH4 仍原,得到的多
25、糖醇用稀酸在温顺条件下水解,可发生特异性降解,即 Smith 降解； Smith 降解的特点是只 打断被高碘酸破坏的糖苷键,而未被高碘酸氧化的糖残基仍连在糖链上；这样, 多糖醇经 Smith 降解, 就可以得到小分子的多元醇和未被破坏的多糖或寡糖片段,对这些产物进行分析,便可以推断出糖苷键的键型及其位置；(2) 高碘酸钠标准曲线绘制各取适量的 NaI04 15 mmol/L和 NaIO3 15 mmol/L溶液,以 5: 0, 4: 1, 3:2, 2: 3,1: 4和 0: 5的体积比分别相混合；取不同比例的混合液0.1 ml稀释 250 倍至 25 ml ,分光.专业.整理.光度计测量各管
26、 223 nm 处的吸光值；以混合液中的NaI04 浓度 mmol/L 为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制 NaIO4 标准曲线；(3) 高碘酸氧化精确称取多糖样品25 mg,用 15 mmol/1的 NaIO4 溶液将多糖配成 1.0 mg/ml 溶液, 振荡使其溶解； 2h 后取多糖溶液 0.1 ml 稀释 250 倍至 25 ml,分光光度计测量223 nm处的吸光值；多糖溶液置4冰箱,暗处反应,并间歇振荡；间隔6h 取样 0.1 ml稀至 25 ml , 测 223 mn 处吸光值,直至吸光值基本稳固；依据反应前后的吸光值和NaIO4 标准曲线运算出 NaIO4 消耗量；加乙二醇1.0 m
27、l ,静置反应 1h 以仍原过量的高碘酸；取反应液 1.0 ml ,加 50ul酚酞指示剂,用 0.5 mmol/L的 NaOH溶液滴定,运算甲酸的生成量；反应液加硼氢化钠50mg,静置反应 20 h 以仍原多糖醛成稳固的多羟基化合物；用0.1 mol/L 的乙酸调反应体系的pH 值为 5.5-7.0,分解余外的硼氢化钠；反应液用自来水流水透析 48 h,再用蒸馏水透析24 h；透析液 50减压蒸发至干,加入甲醇2.0 ml,再蒸干, 如此重复 3 次,最终蒸干获多糖的高碘酸氧化产品待作Smith 降解使用；（4 Smith降解及 GC分析将减压蒸干的多糖高碘酸氧化产品,进行三氟乙酸TFA 水
28、解,再制备糖腈乙酸酯衍生物,最终用 GC进行检测；7、糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱法（鲍氏层孔菌菌丝体多糖的结构分析）（1）多糖样品水解采纳完全酸水解法；称取多糖样品5mg置安瓶瓶中 , 加入 2 mol/1 三氟乙酸 TFA2ml 封管 ,120 水解 2 小时；水解液 50条件下旋转蒸发至干 , 加入甲醇约 2ml, 再蒸发干 , 如此重复 3 次, 最终蒸干待作衍 生化使用；(2) 糖腈乙酸酯衍生物的制备水解后的糖样中加入10 mg盐酸羟胺、 5 mg肌醇 标物 、0.6 ml 吡啶,封口, 放入 90 水浴中加热反应 3 0 min并振荡；冷至室温,再加入1.0 ml醋酸酐, 90水浴中
29、连续反应30 min ,冷却后得糖腈乙酸酯衍生物；反应产物可直接用于气相色谱分析；(3) 衍生物的气相色谱检测本试验采纳的条件为 :Agilent6890N 气相色谱仪, 5%苯甲基硅氧烷毛细管色谱柱HP-5,30.0 mX320umX0.25um; 氢火焰离子检测器FID ; 色谱柱程序升温 :1200C 保持 3min ,以 30C/ min速度升温至 2100C, 2100C 再保持 4 min; 进样口、检测器温度分250、 280 ; 进样体积 1.0ul,氮气、氢气和空气的流速分别是25 ml/min,30 ml/min, 400 ml/min；(4) 标准单糖衍生与检测鼠糖、岩藻
30、糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖等标准单糖同样进行糖睛乙酸酷衍生化,然后以同样条件进行气相色谱分析；依据色谱图中各色谱峰的出峰时间、峰面积以及单糖本身的摩尔质量可知样品的单糖组成和摩尔比 ；运算公式 :Wx = Ax * Wi /Ai*f；公式中 Wx一样品中单糖质量mg ;Wi一样品中加入标的质量mg; AX样品中单糖的峰面积 ;Ai样品中标的峰面积 ;f相对校正因子 :f = Wi* As/ Ws * Ai ；8、薄层层析 TLc 单糖残基的定性分析 猴头菌实体多糖 薄层层析 TLc ：取 2mg 多糖样品放入薄壁长试管中, 加入 2mol/L三氟乙酸 TFA4mL, 在.专业
31、.整理.110下水解 , 中性多糖样品水解2h, 含糖醛酸样品水解4h；样品水解溶液减压蒸干 低于40 后, 加入 3mL 甲醇再蒸干 , 重复以上步骤 4 一 5 次, 以完全除去0.5mL 左右的蒸馏水使样品完全溶解, 取 5uL 在纤维素板上进行薄层层析酯: 吡啶 : 醋酸: 水5:5:1:3,单糖样品为对比； 山药多糖 TFA；再向样品中加入, 绽开剂采纳乙酸乙显色剂为苯胺一邻苯二甲酸,110 加热 10min 后显色 , 以标准9、气相色谱法（猴头菌体多糖）（1） 标准单糖样品的乙酰化精密称取等摩尔 2 mmol/L 的半乳糖、岩藻糖、木糖、鼠糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖,分别溶于3
32、 mL蒸馏水中,加入 20-30 mg硼氢化钠 NaBH4 ,于室温下,间歇振荡,仍原 3h,然后用冰醋酸中和过量的NaBH4,至溶液不再产愤怒泡为止,pH 应在 4-5 之间,加入 3mL甲醇,减压浓缩蒸干,重复4-5 次,以除去反应副产物硼酸及水分,然后置于真干燥器中过夜； 次日, 110烘箱中加热15 min ,充分除去残留的水分后,加入 4 mL醋配, 100 反应 1h,冷却,然后加入3 mL甲苯,减压浓缩蒸干,重复4-5 次,以除去余外的醋酐；将乙酰化后的产物用3 mL 氯仿溶解后转移至分液漏斗,加入少量蒸馏水充分震荡后,除去上层水溶液,如此重复4 次；氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥
33、,定容至10 mL 待 GC和 GC-MS分析；（2） 样品的乙酰化处理取 2 mg 多糖样品,放入薄壁长试管中,加入2 mol/L的三氟乙酸 TFA4 mL ,在 110 水解 2h；将水解液低于 40减压蒸干,然后加入3 mL甲醇蒸干,重复上述操作4-5 次,以完全除去 TFA；然后依据上述的方法进行仍原、乙酞化,用氯仿定容至5m1,待 GC和 GC-MS.专业.整理.分析；（3） GC 分析及定量分别用单个单糖的标样按（单糖的混标按（ 1）法处理后用1）法处理后用GC测定, 确定每个单糖的保留时间；然后用GC测定,重复进样6 次,确定混合标准样品的气相色谱图和相对标准偏差 RSD1；最终
34、按（ 1）法平行处理六个混标样品后用GC测定,确定其相对标准偏差 RSD2；糖的定量分析 : 运算各糖组分的峰面积,利用面积归一法求出各糖组分的百分比例,并运算每种单糖的响应因子；然后依据等摩尔的标样组分,运算出样品的摩尔比；（4）色谱条件气相色谱仪 GC 配备 DB-23 石英毛细管柱, 30 m X 0. 25 mm X 0. 25 um；氢火焰离子化检测器 FID ,高纯氮作载气；程序升温: 柱初温 120 ,以 15 /min 升至 240 ,恒6.5 min；进样口温度 250 ,分流比 1:50 ；检测器温度 250 氢气 35 mL/min,空气 350mL/min ,尾吹气 3
35、0 mL/min ；柱流速为 1 mL/min ；.专业.整理.10、高效阴离子色谱法（猴头菌体多糖）.专业.整理.取 2 mg 多糖样品放入薄壁长试管中,加入2 mol/L三氟乙酸 TFA 4 mL,在 110下水解, 中性多糖样品水解2h,用超纯水溶解定容至100 mL容量瓶, 稀释 100 倍后上样测定；色谱条件 : 分别柱采纳Dionex 公司 CarboPac PA20 预处理、 CarboPac PA20检测柱 ; 脉冲安TMTM培检测器工作参数 :E1 为 100 mv, 400 ms; E2为-2000mv, 20 ms;E3 为 600 mV, 10 ms; E4为-100
36、mV,70 ms；流淌相 : 分别采纳浓度为2.5 mmol/L的 NaOH作淋洗液 ; 淋洗方法采纳单一浓度淋洗；流速 :0.45mL/min;上样量 :25 uL;温度 30；11、气质联用（猴头菌体多糖）取处理的乙酰化产物,上GC-MS,色谱条件 : 气相一质谱联用 GC-MS配备 DB-5MS石英毛细管柱, 30 m X 0. 25 mm X 0. 25 um；程序升温 : 柱初温 80,保持 1 min ,以 5 0C/min至 200 0C ,再以 2 0C/min至 215 ,最终以 20 /min 至 270 氦气作载气,进样口温度 250 ,分流比 1:50 ,柱流速为 1
37、mL/min ； EI70eV ,倍增器电压350 v,灯丝电流250 uA,接口温度 200,离子源温度 250,质量数扫描围 42-462 amu,扫描速率 2. 5 scan/秒；.专业.整理.依据 HEPF1的总离子流图 图 3. 6,通过各峰的保留时间和质谱可以确定其含有岩藻糖、葡萄糖和半乳糖,但是在保留时间22. 58 min处有一未知物峰；依据22. 58min处的质谱图 图 3. 7可知,该组分在 m/z 43, 87, 101, 117, 129, 143, 189和 203 处有碎片离子峰；其中m/z 203和 189 是 3-0- 甲基一甲基戊糖糖醇乙酸醋衍生物的一级片段
38、,而耐 z 129 和 143 是由一级片段 m/z 189 和 203 部分裂解产生乙酸根 -AcOH,-60而产生的二级片段, 与文献完全一样； 由此可以肯定此峰是3- 0- 甲基一甲基戊糖的糖醇乙酸酷衍生物；由于 3-0- 甲基一甲基戊糖有两种存在形式,3- 0-甲基一鼠糖或 3- 0- 甲基一岩藻糖,判定详细的哪一种,仍需要进一步验证；12、苯酚硫酸法总糖含量测定（1） 标准曲线的制作葡萄糖标准品在 105烘箱条件下干燥至衡重,取20 mg 于 500 mL 容量瓶中定容；分别吸取 0.4 mL, 0.6 mL, 0.8 mL, 1.0 mL, 1.2 mL,1.4 mL,1.6 mL
39、, 1.8 mL葡萄糖标准液于试管中,并加水补至2.0 mL ；加入配制好的6%苯酚溶液 1.0 mL ,用移液管吸取 5.0 mL浓硫酸,待静止 10 min 后摇匀,再在室温下放置20 min,待反应完全；于490nm 下测吸光度,并绘制标准曲线；（2） 样品含量测定配制 1 mg/mL 的粗多糖溶液；稀释后,测定吸光值,依据标准曲线运算总糖含量；13、糖醛酸含量测定.专业.整理.（1） 试剂配制间轻基联苯 m-hydroxydiphenyl试剂 :0.15% 间轻基联苯,以 0.5%氢氧化钠配制,置于冰箱中储存, 1 月稳固；四硼酸钠一硫酸试液 : 配制 0.0125 mol/L四硼酸钠
40、的浓硫酸溶液；半乳糖醛酸标准溶液 : 精密称取半乳糖醛酸60 mg,置于 100 mL 容量瓶中,加水溶解, 定容；稀释标准溶液至60ug/mL,定容后备用；（2） 标准曲线制作分别精确量取 0uL, 5uL , 100uL,150 uL, 200uL, 250 uL, 300uL, 350uL半乳糖醛酸标准溶液于比色管中,补加水至0.25 mL ,在冰水浴中预冷,加入1.5 mL四硼酸钠硫酸试液；振摇混合后,在沸水浴中加热5 min ；冰水浴冷却至室温后,加25uL 间经基联苯试液；摇匀后,在520 nm 处测定吸光值,绘制标准曲线；3 样品测定取 0.1 mg/mL 多糖水溶液 0.1 m
41、L ,加水补足至 1mL,余操作同标准曲线,平行测定三次,依据吸光度从标准曲线上求得糖醛酸含量；14、分子质量测定示差折光指数增量dn/dc 通过 OPTILAB折光仪在 633 nm 和 25下测定, dn/dc 值为0.14 ； dn/dc描述的是大分子溶液折光指数相对于溶质浓度的变化,它的值得大小有其自身性质打算的, 受溶剂、 温度、 测量波长等因素的影响, 也是用光散射测定聚合物分子量不行少的常数；光散射 LS 测定角度为900, TFP1 的流出体积为 28 mL；依据方程6-1 和 6-2 ,通过Kc/R；对 sin2 /2+Kc作图得到 Zimm 曲线 图 15b, 在纵坐标的交
42、点为重均分子量Mw的倒数；公式中字母的意义:K 为光学常数, c 为多糖溶液的浓度 mg/mL , R 为瑞利因子, n2为溶剂的折光指数,0 为入射光波长, z1/2均方根旋转半径,NA 为 Avogadro常数, I 0和 I 分别为入射光强和散射光强,代表光源到测量点得距离；.专业.整理.依据 Zimm图运算得到 TFPl 在 NaCl 溶液中各个参数见表1 , TFPl的重均分子量 Mw大小为 5.832xl06Da; Z均方根旋转半径 z 1/2 是用来描述大分子的尺寸, 它的大小可以用来判定聚合物的伸展围和刚性, 该值比较大时说明多糖是伸展的刚性链, 值比较小就代表紧密缠绕的线团 , TFP1的 z为 191.3 nm说明 TFP1是伸展的刚性链1/2; 多分散系数 Mw/Mn为 1.005, 说明 TFP1分子量分布均勾； 所以用本讨论中的提取纯化方法得到的银耳多糖是分子量较大的均一多糖, 糖链是伸展的刚性链；TFP114、碘 - 碘化钾反应银耳多糖 TFP1溶液与碘试剂 含 0.02% 12 的 0.2% KI 溶液 混匀, 测定 300-700 nm围的吸取光谱 , 如在 565 nm 处有最大吸取 就说明 多糖有较少的分支和较短的侧链 161 ；如图 16 所