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1、第一章 绪论1、分子生物学 （ P1）：从分子水平讨论生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学 ,主要指遗传信息的传递（复制）、保持（损耗和修复） 、基因的表达（转录和翻译） 与调控；广义上讲的分子生物学包括对蛋白质和核酸等生物大分子结构与功能的讨论,以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律；狭义上的概念, 即将分子生物学的范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学,主要讨论基因或DNA 结构与功能、复制、转录、表达和调剂掌握等过程；2、分子生物学讨论的内容：基因与基因组的结构与功能；DNA 的复制、转录与翻译；基因表达调控的讨论； DNA 重组技术；结构分子生物学； （P1）第三章 核酸的
2、结构与功能1、DNA 的基本结构 双螺旋结构（1） DNA 的一级结构： DNA 分子中各脱氧核苷酸之间的连接方式（ 3-5磷酸二酯键）和排列次序叫做 DNA 的一级结构, 简称为碱基序列； 一级结构的走向的规定为 53；不同的 DNA 分子具有不同的核苷酸排列次序,因此携带有不同的遗传信息；一级结构的表示法 ： 结构式,线条式,字母式Chargaff 第一留意到 DNA 碱基组成的某些规律性, 在 1950 年总结出 DNA 碱基组成的规律： 腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等,即A=T ；鸟嘌呤和胞腺嘧啶的摩尔数也相等,即G=C ；含氨基的碱基总数等于含酮基碱基总数,即A+C=G+T ；嘌呤的总
3、数等于嘧啶的总数,即A+G=C+T ；（2） DNA 的二级结构双螺旋结构Watson-Crick 模型 为两条反向平行的多核苷酸链,碱基在螺旋内侧； 磷酸和脱氧核糖位于外侧；两条链之间靠碱基对之间氢键连为一体,A TG C ；螺旋直径 2nm,每个螺圈含 10 个碱基对, 螺距 3.4nm ；表面的深沟、浅沟为蛋白识别DNA 单一序列并发生作用的基础；大沟和小沟：大沟宽2.2nm小沟宽 1.2nm（3） 超螺旋是 DNA 三级结构的一种普遍形式,双螺旋DNA 的松开导致负超螺旋,而拧紧就导致正超螺旋；2、DNA 双螺旋模型特点（ 1）DNA 分子是由两条多核苷酸链环绕一个中心轴盘绕而成,两条
4、链方向相反, 一条为5-3 ,另一条为 3-5 ；（ 2）两条链为右手螺旋；（ 3）、脱氧核糖和磷酸构成双螺旋的主链、 亲水, 4 种碱基的排列次序因物种不同而不同, 位于双螺旋的内部, 疏水, 导致 DNA 形成右手螺旋, 二条多核苷酸链依靠碱基的氢键联系；每个螺旋含 10 个碱基,螺距 3.4nm,相邻碱基对间距为 0.34nm ；两个相邻碱基对之间绕螺旋轴旋转的夹角为 36；（ 4）双螺旋中,碱基之间具有严格的配对关系,A 与 T 配对形成二个氢键, G 与 C 配对形成三个氢键；（ 5）、相邻的二个碱基对配对时不在同一位置（由于脱氧核糖中连接碱基的C 并不正好处在螺旋的相对位置上） ,
5、使二条链与中心轴间距不同,所以在DNA双螺旋的表面形成大沟和小沟,酶等大分子自大沟进入,进行复制,调控等生物活动；3、打算双螺旋结构状态的因素或甲酰胺等可以使Tm 值显著降低；1) 氢键：GC 之间有三条氢键, AT 之间有两条氢键,这是DNA 双螺旋结构的重要特点之一, DNA 的很多物理性质如变性、复性以及Tm 值等都与此有关；加入尿素2) 碱基堆集力： DNA 同一条链相邻碱基之间的非特异性作用力,包括疏水作用力和van der Waal 力； 疏水作用力 使 DNA 相邻的碱基有相互堆集在一起的趋势,这是形成碱基堆集力的重要因素之一；DNA双链中存在大量的嘌呤环和嘧啶环,其累积的 v
6、an der Waal 力是相当可观的,这是形成碱基堆集力的另一个重要因素；3) 氢键与碱基堆集力的协同作用：已经堆集的碱基更简洁发生氢键的键合,相应地 已经被氢键定向的碱基更简洁堆集；两种作用力相互协同,形成一种特别稳固的结构；假如一种作用力被排除,另一种作用力也大为减弱；4) 带负电荷的磷酸基的静电斥力： DNA 溶液中的离子浓度降低时, 阳离子在磷酸基四周形成的屏蔽作用减弱,使得磷酸基的静电斥力增大, 因而 Tm 值随之降低；所以纯蒸馏水中的 DNA 在室温下就会变性；5) 碱基分子内能： 温度上升,碱基分子内能增加时, 碱基的定向排列遭受破坏,消弱了碱基的氢键结合力和碱基的堆集力,会使
7、 DNA 的双螺旋结构受到破坏；总之, 氢键和碱基堆集力有利于 DNA 维护双螺旋结构, 而静电斥力和碱基分子内能就不利于 DNA 维护双螺旋结构；4、维护 DNA 双螺旋结构的作用力 ：（1） 氢键： GC 比 A=T 更稳固；（2） 碱基积累力：使DNA 分子内部形成强有力的疏水区,与分子表面的介质水分子隔开（3） 正负电荷作用： DNA 分子中磷酸基团上的氧原子带负电荷,能与介质中的阳离子,带正电荷的碱性蛋白质等形成离子键,从而有效屏蔽磷酸基之间的静电斥力；5、DNA 主要特点 ：）（ 38）储存遗传信息,将遗传信息传递给子代,物理和化学性质稳固,有遗传变异的才能；作为信息分子的 DNA
8、 携带有两种不同的遗传信息：一类负责编码组成型蛋白质氨基酸序列的信息以及编码RNA 的信息；一类负责编码一大类重要的调控蛋白以及打算基因表达的开启或关闭的序列元件,即负责基因表达的调剂掌握；6、L=T+W ,L 是连接数环形DNA 分子两条链间交叉的次数；只要链不断裂,L 不变；T 是双螺旋的交叉数； W 是超螺旋数；假如一个 DNA 有 5000bp,没有超螺旋形成时, W=0 , L 和 T 都是 500；假如固定一端,另一端朝双螺旋方向旋转8 圈后使两端封闭,就L=508 ,T 依旧是 500,W 就是 8；从而可知, 双螺旋 DNA 的松开导致负超螺旋,而拧紧就导致正超螺旋；7、拓扑异
9、构酶 共有两类 :型和型拓扑异构酶；（一）型拓扑异构酶作用特点：仅切断双链DNA 的一条链,即催化瞬时的单链断裂和连接,不需要能量帮助因子如 ATP 和 NAD 等,因而不能催化需能的超螺旋化结构；（二）型拓扑异构酶型酶作用的共同特点是：同时切断、缝合DNA 的两条链,不需要单链切口存在,因而每个反应后转变两个链环数；需要能量帮助因子；型拓扑异构酶目前讨论较为清晰的是大肠杆菌拓扑异构酶（过去叫做蛋白）；其作用机理是,当酶 与 DNA 结合时,可形成稳固的复合物,这个复合物是切断DNA 链的 5-磷酸基与酶的酪氨酸羟基以酯键连接而成的,同时酶的另一端共价连接在3 -OH 基上； 在此发生的是磷酸
10、二酯键的转移反应,由DNA 转移到蛋白质；当DNA 的一股链穿越切割点绕另一股旋转一圈后,原先断裂的DNA重新连接,酶被释放；即磷酸二酯键又由蛋白质转移到DNA ；整个过程并不发生键的不行逆水解,没有能量的丢失；因此不需要外界供应能量,结果由于L由 n 变为 n+1型拓扑异构酶大肠杆菌的拓扑异构酶又叫旋转酶（gyrase；当反应开头时, DNA 环围着酶卷起,然后将两条链切断, 2 个 A 亚基分别与5-磷酸基结合,在酶构象转变的牵引下,另一双链穿越 酶蛋白供应的裂隙（切口）,最终断裂的2 条链又重新连接；ATP 水解产生的能量用来复原酶的构象, 从而可进行下一次循环； 拓扑异构酶功能是将复制
11、叉前的正超螺旋转为负超螺旋,从而释放由复制叉移动造成的张力；其每将一个正超螺旋转为负超螺旋,就将DNA 的连接数 L 的符号从 +1 变为 -1,就 L 的变化为L=-2 ；在细胞中,拓扑异构酶和拓扑异构酶的量是相互抗衡,并受到精细地调剂的,这能保证DNA 的负超螺旋程度达到一个正确状态；8、变性：对 DNA 加热时, DNA 双键之间的氢键断裂的过程,称DNA 的变性或叫 DNA 的融解；9、增色效应或高色效应hyperchromic effect：由于 DNA 变性引起的光吸取增加称增色效应,也就是变性后DNA溶液的紫外吸取作用增强的效应；10、DNA 的复性 ：变性的 DNA 重新复原为
12、双螺旋的过程,叫做复性 （renaturation ）或退火；11、DNA 复性时,其紫外线吸取值降低,这种现象称为减色效应 （ hypochromic effect ）；12、端粒 （Telomere）真核生物染色体线性DNA 分子末端的特殊序列,由短而多的重复序列构成,由端粒酶合成；13、端粒的功能：第一,爱护染色体不被核酸酶降解；其次,防止染色体相互融合；第三, 为端粒酶供应底物,解决DNA 复制的末端隐缩,保证染色体的完全复制；第四章 基因与基因组的结构与功能1、如何判定一段核苷酸序列是否是某个基因？要看这个特定的核苷酸序列是否与其转录产物RNA 核苷酸序列或翻译产物多肽链的氨基酸序列
13、相对应,这样就必需同时测定某一段DNA 的核苷酸序列和相应产物的序列；2、基因座（ locus,loci ）又称座位；基因在染色体上所占的位置；3、等位基因（ allele）：显现在染色体某特定座位上的两个或多个基因中的一个；4、基因组（ genome）细胞或生物体中,一套完整单倍体的遗传物质的总和；5、C 值（ C-value）：通常是指一种生物单倍体基因组DNA 的总量 .6、C 值悖论：生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比例增加；7、持家基因 house-keeping genes：又称管家基因,是指全部细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维护细胞基本生命活动所必需的；8、浪费基因 L
14、uxury gene ：在特殊细胞类型中大量通常 表达并编码特殊功能产物的基因；9、重叠基因（ overlapping gene 即同一段 DNA 片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子； 10、原核生物基因组结构的特点：（1） 、基因组为环状双链DNA 分子（2） 、只有一个复制起始点.（3） 、具有操纵子结构；指数个功能上相关的基因串联在一起,连同上游的调控区和下游的转录终止信号构成基因的表达单位.（4） 、有部分重叠基因.（5） 、基因是连续的 ,无内含子（6） 、编码区在基因组中的比例（7） 、基因组中重复序列很少（8） 、具有编码同工酶的基因isogene（9） 、存在可移动DNA 序列
15、（10） 、分子中有多功能识别区域；复制、转录起始区复制、转录终止区另（网）真核生物基因组特点：（1）真核基因组的分子质量大； （ 2）真核生物一般有多条呈线状的染色体（3）细胞核 DNA 与蛋白质稳固地结合, 形成染色质的复杂高级结构；染色质内除含有 DNA 和组蛋白之外, 仍有大量非组蛋白； （ 4）真核细胞被核膜分隔成细胞核和细胞质,在基因表达中,转录和翻译在时间和空间上被分隔,不偶联真核细胞基因组DNA 有大量重复序列, 这些重复序列的单位长度不一,从几个至几千个碱基对不等；重复程度各异；（ 5）真核生物的蛋白质基因一般以单拷贝形式存在,转录产物为单顺反子mRNA ；功能上亲密相关的基
16、因密集程度不如原核生物高； （ 6）真核生物基因组存在着可移动的DNA 序列；（ 7）绝大多数真核生物基因都含有内含子,因此基因的编码区不是连续排列的；11、质粒（ plasmid ）是细菌内携带的染色体以外的DNA 分子；是共价闭合环状 DNA （ covalent closed circular DNA , cccDNA ） 12、真核生物基因组特点（1） 、体细胞 :两套基因组性细胞 :一套基因组（2） 、基因组结构复杂,数目巨大 , 多个复制起始点（3） 、mRNA 为单顺反子 .（4） 、含大量重复序列.（5） 、非编码序列占 90%以上 .（6） 、基因间有间隔区spacer DN
17、A, 基由于断裂基因 split gene 即内含子 ,外显子 .（7） 、功能相关的基因串联在一起形成基因家族（8） 、存在可移动成分.13、内含子（ intron ）是结构基因中的非编码序列,往往与编码序列呈间隔排列；14、外显子（ exon）15、开放阅读框（ open reading frame,ORF） 是可以翻译成氨基酸序列的一段 DNA 碱基序列,即从起始密码子 （ATG 或 AUG ）至终止密码子 （ TGA/UGA 或 TAA/UAA 或 TAG/UAG 的一段碱基序列；16、重复序列（1） .高度重复序列：重复频率 105（2） .中度重复序列 :重复频率 101-105,
18、占基因总量的 35% rRNA gene, tRNA gene,组蛋白 gene （3） .单拷贝基因 : 仅显现一次或少数几次.大多数编码蛋白质的基因.17、卫星 DNA satellite DNA是另一类高度重复序列,其重复单位一般由2-10bp 组成,成串排列；由于碱基组成（富含AT）不同于其他部份,用等密度梯度离心法将其与主体DNA 分开,因而称为卫星DNA 或随体 DNA ；18、短分散片段 short interspersed repeated segments, SINES）,又叫短散在序列元件,这类重复次序的平均长度约为300bp（ 500bp）,它们与平均长度约为1000bp
19、 的单拷贝次序间隔排列；拷贝数可达 10 万左右；如 Alu 家族, Hinf 家族等属于这种类型的中度重复序列；19、长分散片段 Long interspersed repeated segments, LINES ）这类重复次序的长度大于1000bp,平均长度为3500-5000bp ,它们与平均长度为13000bp（个别长几万bp）的单拷贝次序间隔排列；20、 Alu 家族:Alu 家族是哺乳动物包括人基因组中含量最丰富的一种中度重复次序家族；Alu 家族每个成员的长度约 300bp,由于每个单位长度中有一个限制性内切酶Alu 的切点（ AG CT）从而将其切成长 130 和 170bp
20、 的两段,因而定名为Alu 序列（或 Alu 家族）；Alu 序列分散在整个人体或其他哺乳动物基因组中,在间隔 DNA 内含子中都发觉有Alu 序列,平均每 5kbDNA 就有一个 Alu 次序；已建立的基因组中无例外地含有Alu 次序；Alu 家族的功能：Alu 次序可能参与 hnRNA 的加工与成熟Alu 序列与遗传重组及染色体不稳固性有关Alu 次序可能具有转录调剂作用21、真核生物的基因组中有很多来源相同、结构相像、功能相关的基因,将这些基因称为基因家族（ gene family ；如：编码组蛋白、免疫球蛋白和血红蛋白的基因都属于基因家族22、同一家族中的成员有时紧密地排列在一起,成为
21、一个基因簇gene cluster23、假基因：是基因组中因突变而失活的基因,无蛋白质产物；一般是启动子显现问题；第五章 DNA 的复制1、由于 DNA 复制的半不连续性,复制叉上一条链的合成总是比另一条链快,称先导链leading strand ,另一条链复制要滞后一步,称后随链 （ lagging strand ）；2、复制单位 ：指调控 DNA 复制的一组基因及其所掌握的待复制的DNA 片段,包括复制原点和与复制有关的结构,称复制单位,又称复制子（replicon ）；一个复制单位只有一个复制原点；3、一个能够在模版链上合成新的DNA 链的酶叫做 DNA 聚合酶；4、DNA 聚合酶的功能
22、（1） 、5 -3聚合功能；主要用于DNA 的修复和 RNA 引物的替换；（2） 、3 5外切核酸酶活性：校对功能 proofreading ；（3） 、5 3外切核酸酶活性； A、切口平移b、链的置换c、模板转换（4） 、内切酶活性生物学功能切除引物修复 DNA修复 DNA修复肠杆菌 DNA 聚合酶I、II 、 III的性质比较性质聚合酶I聚合酶II聚合酶 III3 5+5 -3新生链的合成+生物学活性10.0515DNA Pol I ：具有 DNA 聚合酶活性,需要模板和引物,只有当引物具有游离的3-OH 时才能将四种核苷酸依据模板的信息合成DNA ；其功能主要用于复制后的校正；外切酶活性
23、在先,聚合酶活性在后；1） 5 3 外切核酸酶活性,特点：Pol I 只在核酸有 5磷酸末端存在时才发挥这种活性； 切除的核苷酸是已经配对的,以逐个逐个的方式切除； 被切除的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸,也可以是核糖核苷酸；2） 35核酸外切酶活性： 由具有游离的 -OH 的未配对 3末端核苷酸激活, 即对不配对的碱基造成的单链进行识别；3） 5- 3方向的聚合酶活性4） 核酸内切酶活性：当一段DNA 带有 5-P 的不配对单链时, Pol I 可以作用于此单链相连的两个配对碱基之间,切断其磷酸二酯链；5） Klenow 以枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理时,Pol I 裂解为大小不同的两个活性片段
24、, 较大的 C 端片段具有聚合酶和3 5核酸外切酶活力,称Klenow 片段,较小的 N 端片段, 具有 5 3方向核酸外切酶的、活力；Pol III ：是大肠杆菌中的主要复制酶,分子量最大,由7 个亚基各二个组成全酶,其中构成核心酶；： 5 3聚合功能： 3 5外切活性：连接核心酶 ：使核心酶与模板结合其他亚基的功能虽然仍不很清晰,但它们的参与提高了反应的连续性DNApol和 DNApol的共同功能：多亚基酶； 5-3聚合活性； 3-5的外切核酸酶活性； DNApol在体内功能尚不清晰, 可能参与 DNA 修复5、螺旋酶（ helicase） 又称解旋酶：是促进DNA 的两条链分别的一类酶；
25、6、拓扑异构酶（ Top）（旋转酶）：一类转变 DNA 的超螺旋状态的酶；7、第六章 DNA 的损耗、修复和基因突变1、DNA 损耗 ：在生物体生命过程中DNA 双螺旋结构发生的任何转变；（1） 包括： 1）单个碱基的转变通过序列的变化转变子代遗传信息；2）双螺旋结构的反常扭曲对 DNA 复制或转录产生生理性损害（2） 产生因素：自发性损耗、代谢物质、物理、化学因素引起的损耗1） 自发性损耗互变异构移位：碱基发生烯酮式酮式结构互变；脱氨基作用：AC G 脱氨基 A I C U； DNA 聚合酶的“打滑” ：引起一个或数个碱基的插入或缺失；活性氧引起的诱变： H2O2 对 DNA 造成氧化损耗；
26、碱基缺失：自发性水解2） 物理因素引起的损耗：（1） 紫外线（ UV ）照耀 引起的 DNA 损耗主要是形成嘧啶二聚体；（2） 电离辐射 对 DNA 的损耗有直接效应和间接效应两种途径；前者指辐射对 DNA 直接沉积能量,并引起理化转变；后者是指电离辐射在DNA 四周环境的其它成分上沉积能量,而引起 DNA 分子的变化； 电离辐射的结果可以引起DNA 的碱基损耗、 链断裂以及 DNA 的交联3） 化学因素（ 1） .烷化剂对 DNA 的损耗烷化剂是一类亲电子的化合物,极简洁与生物体内的有机物大分子的亲核位点起反应烷化剂 核 DNA 作用时,就可以将烷基加到核酸的碱基上去；DNA 链上的磷酸二酯
27、键被烷化就形成不稳固的磷酸三酯键,可能在糖与磷酸间发生水解作用,导致DNA 链的断裂；（2） . 碱基类似物对 DNA 的损耗碱基类似物是一类结构与碱基相像的人工合成的化合物,它们进入细胞以后, 便能替代正常的碱基而掺入到 DNA 链中,干扰了 DNA 的正常合成；最常见的碱基类似物是5-溴尿嘧啶（5-BU ）2、DNA 的修复 ：生物体细胞在长期进化过程中形成的一种爱护功能,维护遗传信息的稳固性；修复系统有五种：切除修复错配修复 直接修复重组修复易错修复和 SOS 反应（1） 切除修复1） 碱基切除修复修复单个碱基缺陷的缺失；特异性酶识别缺失部位,切除该碱基,DNA 聚合酶合成新链, 连接酶
28、连接；2） 核苷酸片段切除修复DNA 双螺旋结构有较大的缺失变性时,以核苷酸片段切除修复为主；（2） 错配修复原核细胞内存在 Dam 甲基化酶,能使位于5GATC 序列中腺苷酸的 N6 位甲基化；复制后DNA 在短期内（数分钟）为半甲基化的GATC 序列,一旦发觉错配碱基,即将未甲基化链切除一段包含错误碱基的序列,并以甲基化的链为模板进行修复；（3） 直接修复把被损耗的碱基回复到原先状态的一种修复；生物体内存在多种DNA 损耗以后而并不需要切除碱基或核苷酸的机制,这种修复方式称为DNA 的直接修复；包括：光复活作用、 O6-甲基鸟嘌呤 -DNA 甲基转移酶（ MGMT ）直接修复、单链断裂修复
29、（4） 重组修复遗传信息有缺损的子代DNA 分子通过遗传重组的方式加以补偿,即从同源DNA 的母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处,然后用再合成的序列来补上母链的空缺；（5） 复制后修复简洁出错 RecA, DNApolymerae ligase ,重组修复后的损耗位点可由其它机制进一步修复（6） 易错修复和 SOS 反应SOS 反应：很多能造成DNA 损耗或抑制 DNA 复制的过程能引起一系列复杂的诱导效应, 这种效应称为应急反应（SOS response）；细胞 DNA 受到损耗或复制系统受到抑制的紧急情形下,为求得生存而显现的应急效应；SOS 反应诱导的修复系统包括防止差错修复err
30、or free repair 和易错修复 error-prone repair（7） 防止差错修复 error free repair ：切除修复错配修复直接修复重组修复易错修复：容许错配,增加细胞存活的机会SOS 反应包括两方面的内容：DNA 修复导致变异SOS 修复只是 SOS 反应的一部分SOS repair 是一种错误倾向性极强的修复机制第 7 章 DNA重组与转座1、广义上,任何造成基因型变化的基因沟通过程都叫遗传重组 （ genetic recombination ） .狭义上,指涉及到DNA 分子内断裂 -复合的基因沟通,有时又称交换（ crossing over） .2、DNA
31、 重组类型（1 同源重组（ Homlogous recombination ）或普遍性重组（ generalized recombination ）A 交互重组B 单向重组（2） 位点特异性重组（3） 转座重组（4） 特殊重组3、同源重组也称交换,指减数分裂过程中染色体间遗传物质的交换,即在两个双螺旋 DNA分子中任何一对同源序列作底物进行交换；4、位点专一性重组特指噬菌体DNA 整合到细菌染色体DNA 的过程；5、原核生物,真核生物基因组中都有一些不必借助同源序列可以从一个部位移动到另一个部位的 DNA 片段,这些片段称转座子 （ transposon or transposable ele
32、ment）转座子 是在基因组中可以移动的一段DNA 序列；6、转座子的共性： 1、两端都有反向重复序列2、具有编码转座酶的基因,催化转座子插入新的位点7、转座子的类型（1） 简洁转座子,即插入序列（insertion sequence, IS）；（2） 复合转座子：较大,由两个重复序列夹着中心区的编码其他蛋白如抗药性基因组成, 通常以 Tn 命名；一、原核生物的 RNA 聚合酶第八章 转录大部分原核生物的RNA 聚合酶的结构特别相像,在聚合酶的表面形成一条约2.5nm 的通道,是容纳DNA 分子的场所；细菌 RNA 聚合酶的大小约为9.5 nm 9.5 nm 16 nm；1. 大肠杆菌 RNA
33、 聚合酶大肠杆菌 RNA 聚合酶由多亚基组成,全酶组装过程为2+,分子量为 480 KDa左右； 亚基与全酶 结合疏松 ,很简洁与全酶分别；全酶可以起始RNA 的合成,之后亚基从全酶解离下来；亚基 可能参与全酶的组装及全酶识别启动子；另外, 亚基仍参与 RNA 聚合酶与一些转录调控因子间的作用；亚基 具有与底物（ NTP 及新生的 RNA 链）结合的才能；利福霉素可以阻断转录的起始,链霉溶菌素可抑制延长反应,二者均是通过与亚基的结合而发挥作用的；亚基 可能与模板结合；肝素 可与 亚基结合而抑制转录,并且可以和亚基竞争 DNA 的结合位点；亚基和亚基供应了 RNA 聚合酶的活性中心 ,其一级结构
34、与真核生物RNA 聚合酶大亚基有同源性；亚基 的功能是帮忙全酶识别启动子并与之结合；亚基也可被看作一种帮助因子,因此又可称为因子（ sigma factor ）；在转录过程中, RNA聚合酶需要与其他蛋白质帮助因子 共同作用,才能保证转录的顺当进行；如转录终止时的终止因子和抗终止因子；大肠杆菌 RNA聚合酶多亚基的复杂结构主要是为酶供应了与多种因子相互作用的才能,从而可以 识别多种启动子 ；2. 因子在大肠杆菌中, RNA 聚合酶要负责全部基因的转录,也就是说要识别全部转录单位的启动子；因此, 因子在 RNA 聚合酶识别启动子 的过程中起 关键 作用；因子的二级结构属于 螺旋,是通过识别启动子
35、上的某一序列来掌握 RNA 聚合酶与启动子的结合的；目前已发觉了至少 4 种 因子；在细菌受到外界环境的急剧影响时,会转变所表达的基因,产生 因子更替的现象；如环境 温度上升 时,大肠杆菌会开启 rpoH 基因的表达,其产物 32 能识别热激基因的启动子,而正常状态下表达的基因会关闭或表达水平下降；芽孢菌 生活周期过程中生活方式的转变也是通过 因子的更替完成的；二、 RNA pol执行多功能1、识别 DNA 双链上的启动子2、使 DNA 变性在启动子处解旋成单链3、通过阅读启动子序列,RNA pol 确定他自己的转录方向和模板链4、最终当它达到终止子时,通过识别停止转录三、终止子（1） 强终止
36、子 -内部终止子1) 只有核心酶和终止子就足以使转录终止,不依靠其他其他帮助因子的作用；2) 不依靠 因子的终止子在结构上有两个特点,一个是转录生成的RNA 形成发夹结构 ,二是发夹结构 末端紧跟着 6 个连续的 U 串；3) 发夹结构中的突变可阻挡转录的终止,说明白发夹结构在转录终止中的重要作用；4) 讨论发觉, 发夹结构只是使转录过程暂停,为转录的终止供应了机会；（2）弱终止子需因子,又称为依靠性终止子12依靠 因子的终止子必需在因子的存在下才能终止核心酶的转录作用；依靠 因子的终止子序列,特殊是实际终止位点之前的序列量相对较少；富含 C,而 G 含3大肠杆菌种依靠 因子的终止子相对较少；
37、四、强终止子的结构特点1、有回文结构存在2、茎的区域含 G-C3、强终止子 3端上有 6 个 U五、5) 假如没有终止子序列,聚合酶可以连续转录,而不发生转录的终止；6 个连续的 U 串可能为 RNA 聚合酶与模板的解离供应了信号；第 9 章 RNA的转录后加工一、原核生物转录产物的后加工原核生物 mRNA 的寿命特别短,这是原核生物基因表达调控的一种手段；原核生物的mRNA 不需要进一步的加工就可以具有生物学活性,作为翻译的模板；通过比较成熟的 rRNA 和 tRNA 与其原初转录产物, 发觉原核生物 rRNA 和 tRNA 的转录产物存在着后加工过程；1. rRNA的后加工原核生物有三种
38、rRNA （ 5S、16S 和 23S）,其基因（ rDNA ）与 tRNA 的基因（ tDNA ）混在一起,排列在一个操纵子（r r n）中；大肠杆菌有7 个这样的操纵子；r r n 操纵子有两个启动子,第一个启动子 p1 位于 16S rRNA序列上游 300bp 左右,可能是主要的启动子； 其次个 启动子 p2 位于 p1 下游 110bp 左右,该操纵子转录的产物为30S rRNA ；RNA 酶 负责 p2 转录产物的后加工； 在缺乏 RNA 酶 III 的菌体细胞中, 没有成熟 rRNA显现,且 30S rRNA 产生积累；RNA 酶在体外能够作用于30S RNA ,产生 p16 和
39、 p25,可进一步转变为成熟的rRNA ；2. tRNA 的转录后加工原核生物 tRNA 的初始转录产物要经过 多种加工处理 后才能变成有功能的分子；有两种类型的 tRNA 基因,一种具有 CCA 序列, 称为 型 ；另一种没有 CCA 序列, 称为型 ；型 tRNA 的 CCA 下游仍有一段序列,需在酶的作用下切除；型 tRNA 需在酶的作用下添加CCA 序列；原核生物的 tRNA 多为型；tRNA 的后加工是在多种酶的作用下完成的；1) RNA 酶 P（ RNase P） 是一种内切酶,能够使tRNA 产生成熟的 5末端；2) RNA 酶 D （ RNase D） 是一种核酸外切酶,能够逐
40、个切除tRNA 3末端余外的核苷酸,使 CCA 暴露；当 CCA 末端产生后,会立刻产生氨酰化而得到爱护；3) tRNA 核苷酸转移酶（ tRNA nucleotidyl transferase） 该酶能够以 ATP 和 CTP 为前体,催化 tRNA 的 3端生成 CCA ；4) 该酶识别 tRNA 的空间结构,没有种属特异性；5) RNA 酶 负责切开间隔序列；人们始终以为具有3poly （A ）结构是真核生物mRNA 的特点；在最近的讨论中,发觉原核生物的RNA 转录后也有在 3端添加 poly （ A ）的现象；大肠杆菌的poly （ A ）聚合酶早在 1962 年就已经发觉,但对于这
41、种生物学现象仍缺乏明白；二、真核生物的转录后加工真核生物转录后加工除了mRNA 外, tRNA 和 rRNA 也要经过后加工的过程；有关真核生物 tRNA 的加工处理明白仍不多,可能和原核生物有相像之处；1. rRNA的转录后加工真核生物有 4 种 rRNA ,即 5.8S rRNA 、18S rRNA 、28S rRNA和 5S rRNA ；其中前三者的基因组成一个转录单位,产生47S 的前体 ,并很快转变成 45S 前体 ；45S 前体上有很多甲基化的位点,在转录过程中或转录后被甲基化；甲基基团主要是加在核糖上；甲基化 是 45S 前体最终成为成熟rRNA 区域的标志；真核细胞中 rRNA
42、 的加工途径(1) 切除 5端的前导序列；(2) 从 41S 的中间产物 中先切下 18S 的片段；(3) 部分退火,形成发夹结构；(4) 最终修正；目前仍不清晰45S 前体在剪切位点断裂后是否就产生成熟的末端,仍是要经进一步的加工；整个加工过程需要蛋白质的参与,可能形成核蛋白体的形式；rRNA 的加工过程仍需要snoRNA（small nucleolar RNAs）的参与；真核生物的 5S rRNA是和 tRNA 转录在一起的,经加工处理后成为成熟的5S rRNA ；2. mRNA的转录后加工在真核生物中, 几乎全部的成熟 mRNA 有 5帽子（cap）结构, 多数仍有 3末端的 poly
43、（A ）尾巴 ；这些结构都是在转录后经过修饰的结果；（ 1） 5帽子结构成熟真核生物的 mRNA 并没有游离的 5端,而是一种被称为帽子的结构；真核生物的帽子结构可归纳为三种：a) m7Gppp X 为帽子 0b) m7Gppp Xm 为帽子 1c) m7Gppp XmYm为帽子 2不同真核生物的 mRNA 可有不同的帽子结构,同一种真核生物的mRNA 也常有不同的帽子结构；帽子结构的作用：a) 为核糖体识别 RNA 供应信号b) 增加 mRNA 的稳固性c) 与某些 RNA 病毒的正链 RNA 的合成有关；(2) 3 polyA尾巴多数真核生物（酵母除外）的mRNA 3末端具有长约 200
44、bp 的 poly （ A ）尾巴；poly（A ）尾巴不是由模板 DNA 所编码, 而是在转录后由 RNA 末端腺苷酸转移酶 （ RNA terminal riboadenylate transferase ）催化下,以 ATP 为前体,添加到 mRNA 的 3末端形成的；有些 mRNA 的 3末端没有 poly （ A ）尾巴,如组蛋白的mRNA ,其 3末端的正确形成依靠于 RNA 本身形成的茎环结构 ,即转录终止于此处；对茎环结构进行突变,只要是维护其二级结构,就不影响转录的终止；说明二级结构所供应的信息比序列本身更重要；Poly A 在分子生物学试验中有很大的应用价值 ；a) 应用
45、mRNA 的该特性,可用寡聚T（ oligo dT ）为引物,反转录合成cDNA ；b) 将 oligodT 与载体相连,用于从总RNA 中分别纯化mRNA ；c) 后加工与 mRNA 的稳固性转录后加工 是产生各种成熟 RNA 分子的重要过程；各种 RNA 分子的加工都是在特定的酶参与下完成的,包括核酸内切酶和核酸外切酶；核酸酶 除了参与后加工过程外,仍负责过剩RNA 的降解；原核生物 mRNA 降解的方向为5至 3,可能由 内切酶 在最终一个核糖体后面发挥作用；余下的片段由 外切酶 按 3至 5的方向水解成核苷酸； mRNA 分子结构中的 二级结构 可以阻挡外切酶的作用；参与 RNA 降解的核酸酶类 可能比参与 RNA 成熟过程的核酸酶特异性差；真核生物 mRNA 的稳固性可能取决于 去稳固元件（ destablizingelement ）；将这一元件与 mRNA 结合,可引起该 mRNA 的降解；三、转录本（ transcript）：从 DNA模板复制的 RNA分子称为 .四、原核的 tRNA 和 rRNA 的加工