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1、精品学习资源HPLC培训教程我国药典收载高效液相色谱法工程和数量比较表：方法工程1985 年版数量1990 年版1995 年版2000 年版鉴别934150HPLC法检查1240160含量测定760117387鉴于 HPLC应用在药品分析中越来越多， 因此每一个药品分析人员应当把握并应用HPLC；I 概论一、液相色谱理论进展简况色谱法的分别原理是：溶于流淌相 mobilephase 中的各组分经过固定相时，由于与固定相 stationaryphase 发生作用（吸附、支配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出；又称为色层法、层析 法；色谱法最早
2、是由俄国植物学家茨维特（ Tswett ）在 1906 年争辩用碳酸钙分别植物色素时发觉的，色谱法 Chromatography 因之得名；后来在此基础上进展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法；液相色谱法开头阶段是用大直径的玻璃管柱在室温存常压下用液位差输送流淌相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）；高效液相色谱法 High performance LiquidChromatography ，HPLC是在经典液相色谱法的基础上，于60 岁月后期引入了气相色谱理论而快速进展起来的； 它与经典液相色谱法的区分是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需
3、用高压输送流淌相，故又称高压液相色谱法 High Pressure LiquidChromatography，HPLC；又因分析速度快而称为高速液相色谱法 High Speed LiquidChromatography， HSLP；也称现代液相色谱；二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压压力可达 150300Kg/cm2；色谱柱每 M降压为 75 Kg/cm2 以上；高速流速为 0.110.0 ml/min；高效可达 5000 塔板每 M；在一根柱中同时分别成份可达100 种；高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng ；同时消耗样品少；HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快通常
4、分析一个样品在 1530 min ，有些样品甚至在 5 min 内即可完成；辨论率高可选择固定相和流淌相以达到正确分别成效；灵敏度高紫外检测器可达 0.01ng ，荧光和电化学检测器可达 0.1pg ；柱子可反复使用用一根色谱柱可分别不同的化合物；样品量少，简洁回收样品经过色谱柱后不被破坏， 可以收集单一组分或做制备；三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法 GC和液相色谱法 LC ；气相色谱法适用于分别挥发性化合物； GC依据固定相不同又可分为气固色谱法 GSC和气液色谱法 GLC， 其中以 GLC应用最广；液相色谱法适用于分别低挥发性或非挥发性、 热稳固性差的物质；LC同样可分为液
5、固色谱法 LSC和液液色谱法 LLC ；此外仍有超临界流体色谱法 SFC， 它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流淌相（常用CO2），因其扩散系欢迎下载精品学习资源数大，能很快达到平稳，故分析时间短，特殊适用于手性化合物的拆分；按原理分为吸附色谱法 AC 、支配色谱法 DC、离子交换色谱法 IEC 、排阻色谱法EC，又称分子筛、凝胶过滤 GFC、凝胶渗透色谱法 GPC）和亲和色谱法； 此外仍有电泳； 按操作形式可分为纸色谱法 PC、薄层色谱法 TLC 、柱色谱法；四、色谱分别原理高效液相色谱法按分别机制的不同分为液固吸附色谱法、液液支配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色
6、谱法及分子排阻色谱法；1. 液固色谱法使用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱上分别原理是依据固定相对组分吸附力大小不同而分别；分别过程是一个吸附解吸附的平稳过程；常用的吸附剂为硅胶或氧化铝， 粒度 510m；适用于分别分子量 2001000的组分， 大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾；常用于分别同分异构体；2. 液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分别原理是依据被分别的组分在流淌相和固定相中溶解度不同而分别；分别过程是一个支配平稳过程；涂布式固定相应具有良好的惰性；流淌相必需预先用固定相饱和，以削减固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批
7、号流淌相的区分常引起柱子的变化；另外在流淌相中存在的固定相也使样品的分别和收集复杂化；由于涂布式固定相很难防止固定液流失，现在已很少接受；现在多接受的是化学键合固定相，如 C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱；液液色谱法按固定相和流淌相的极性不同可分为正相色谱法 NPC和反相色谱法RPC；正相色谱法接受极性固定相 如聚乙二醇、氨基与腈基键合相 ；流淌相为相对非极性的疏水性溶剂 烷烃类如正已烷、环已烷） ，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调剂组分的保留时间；常用于分别中等极性和极性较强的化合物 如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等） ；反相色谱法一般用非极性固定相（如 C18、C8）；流淌
8、相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调剂保留时间；适用于分 离非极性和极性较弱的化合物； RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC应用的 80%左右；随着柱填料的快速进展，反相色谱法的应用范畴逐步扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析；为把握样品在分析过程的解离，常用缓冲液把握流淌相的pH 值；但需要留意的是， C18 和 C8 使用的 pH 值通常为 2.57.5 （28），太高的 pH值会使硅胶溶解，太低的 pH 值会使键合的烷基脱落；有报告新商品柱可在pH 1.510 范畴操作；正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法
9、反相色谱法固定相极性高中中低流淌相极性低中中高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）；3. 离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚欢迎下载精品学习资源合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离 子交换树脂）；被分别组分在色谱柱上分别原理是树脂上可电离离子与流淌相中具有相 同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，依据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分别；缓冲液常用作离子交换色谱的流淌相；被分别组分在离子交换柱中的保留时间除跟 组分别子与树脂上
10、的离子交换基团作用强弱有关外，它仍受流淌相的pH 值和离子强度影响；pH值可转变化合物的解离程度， 进而影响其与固定相的作用； 流淌相的盐浓度大， 就离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出；离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸；4. 离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支；它是依据被测组分别子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分别成效改善；主要用于分析离子强度大的酸碱物质；分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等；另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对；分析酸性物质常用四丁
11、基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐；离子对色谱法常用 ODS柱（即 C18），流淌相为甲醇 - 水或乙腈 - 水，水中加入 310 mmol/L 的离子对试剂， 在确定的 pH值范畴内进行分别； 被测组分保时间与离子对性质、浓度、流淌相组成及其pH值、离子强度有关；5. 排阻色谱法 固定相是有确定孔径的多孔性填料，流淌相是可以溶解样品的溶剂；小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中， 直接随流淌相流出； 它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻才能的差异而完成分别；常用于分别高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等；被分别组分在柱中的洗脱原理II 基
12、本概念和理论一、基本概念和术语1. 色谱图和峰参数色谱图 chromatogram 样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号- 时间曲线，又称色谱流出曲线 elution profile；基线 base line经流淌相冲洗，柱与流淌相达到平稳后，检测器测出一段时间的流出曲线；一般应平行于时间轴；噪音 noise 基线信号的波动；通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳固、流淌相含有气泡或色谱柱被污染所致；漂移drift基线随时间的渐渐变化；主要由于操作条件如电压、温度、流淌相及流量的不稳固所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移；色谱峰 peak 组分流经检测器时响应的连续信号产生
13、的曲线；流出曲线上的突起部分；正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）；不对称色谱峰有两种： 前延峰 leading peak和拖尾峰 tailing peak；前者少见；拖尾因子 tailing factor， T T，用以衡量色谱峰的对称性；也称为对称因子symmetry factor或不对称因子 asymmetry factor；中国药典规定T 应为0.951.05 ；T0.95 为前延峰， T1.05 为拖尾峰；峰底基线上峰的起点至终点的距离；峰高peak height，h 峰的最高点至峰底的距离；欢迎下载精品学习资源峰宽（ peak width ，W峰两侧拐点处所作两
14、条切线与基线的两个交点间的距离；W4半峰宽（peak width athalf-height，Wh/2 峰高一半处的峰宽； Wh/2 2.355 规范偏差 （ standard deviation， 正态分布曲线 x1时（拐点）的峰宽之半；正常峰的拐点在峰高的0.607 倍处；规范偏差的大小说明组分在流杰出谱柱过程中的分散程度； 小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低；峰面积 peak area ，A峰与峰底所包围的面积； A h2.507 h 1.064 Wh/2h2. 定性参数（保留值）死时间 dead time ，t 0 不保留组分的保留时间；即流淌相（溶剂
15、）通过色谱柱的时间；在反相 HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间；死体积 dead volume ，V0 由进样器进样口到检测器流淌池未被固定相所占据的空间；它包括 4 部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流淌相占据， Vm）、柱出口管路体积、检测器流淌池体积；其中只有Vm参与色谱平稳过程，其它3 部分只起峰扩展作用；为防止峰扩展，这3 部分体积应尽量减小； V0Ft0（F 为流速）保留时间 retention time， t R 从进样开头到某个组分在柱后显现浓度极大值的时间；保留体积 retention volume，VR 从进样开头到某组分在柱后显现浓度极大值时流出溶剂的体
16、积；又称洗脱体积； VRFtR调整保留时间 adjusted retention结构 time ， t R 扣除死时间后的保留时间；也称折合保留时间 reduced retentiontime；在试验条件（温度、固定相等）确定时， t R只准备于组分的性质，因此， t R（或 t R）可用于定性； t R t Rt 0调整保留体积 adjusted retentionvolume，V R 扣除死体积后的保留体积； V RVRV0 或 V RFtR3. 柱效参数理论塔板数 theoreticalplatenumber ， N用于定量表示色谱柱的分别效率（简称柱效）；N取决于固定相的种类、性质（粒
17、度、粒径分布等） 、填充状况、柱长、流淌相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质；假如峰形对称并符合正态分布， N可近似表示为：N 2 162 5.542N为常量时， W随 tR 成正比例变化； 在一张多组分色谱图上， 假如各组分含量相当， 就后洗脱的峰比前面的峰要逐步加宽，峰高就逐步降低；用半峰宽运算理论塔数比用峰宽运算更为便利和常用，由于半峰宽更易精确测定， 特殊是对稍有拖尾的峰；N 与柱长成正比，柱越长， N越大；用 N 表示柱效时应注明柱长，假如未注明，就表示柱长为 1M时的理论塔板数；（一般 HPLC柱的 N在 1000 以上；）如用调整保留时间 tR 运算理论塔板数， 所得值称为有效
18、理论塔板数 N 有效或 Neff ；理论塔板高度 theoretical plateheight，H每单位柱长的方差； H；实际应用时往往用柱长 L 和理论塔板数运算： H， H有效；4. 相平稳参数支配系数 distributioncoefficient，K 在确定温度下，化合物在两相间达到支配平稳时，在固定相与流淌相中的浓度之比；K；支配系数与组分、流淌相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关；在不同的色谱分别机制中， K 有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数 或称交换系数 ，凝胶色谱法为渗透参数；但一般情形可用支配系数来表示；欢迎下载精品学习资源在条件 流
19、淌相、固定相、温度和压力等 确定，样品浓度很低时 Cs、Cm很小 时， K只取决于组分的性质， 而与浓度无关； 这只是理想状态下的色谱条件， 在这种条件下， 得到的色谱峰为正常峰；在许多情形下，随着浓度的增大，K 减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大， K 也增大，这时色谱峰为前延峰；因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低， K恒定时，才能获得正常峰；在同一色谱条件下，样品中 K 值大的组分在固定相中滞留时间长，后流杰出谱柱； K 值小的组分就滞留时间短，先流杰出谱柱；混合物中各组分的支配系数相差越大，越简洁分别，因此混合物中各组分的支配系数不同是色谱分别的前提；在 HP
20、LC中，固定相确定后， K主要受流淌相的性质影响； 实践中主要靠调整流淌相的组成配比及 pH 值，以获得组分间的支配系数差异及适宜的保留时间，达到分别的目的；容量因子 capacityfactor，k 化合物在两相间达到支配平稳时，在固定相与流淌相中的量之比； k；因此容量因子也称质量支配系数；支配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k K， t R k t 0；上式说明容量因子的物理意义： 表示一个组分在固定相中停留的时间 （ t R）是不保留组分保留时间（ t 0）的几倍；k0 时，化合物全部存在于流淌相中，在固定相中不保留，t R0； k 越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，
21、保留时间越长；容量因子与支配系数的不同点是： K 取决于组分、流淌相、固定相的性质及温度， 而与体积 Vs、Vm无关； k 除了与性质及温度有关外，仍与Vs、Vm有关；由于 t R、t 0 较 Vs、Vm易于测定，所以容量因子比支配系数应用更广泛；选择性因子 selectivityfactor， 相邻两组分的支配系数或容量因子之比；（设 k2k1）；因 kt R/t 0，就 ，所以 又称为相对保留时间 （美国药典）；要使两组分得到分别， 必需使 1； 与化合物在固定相和流淌相中的支配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情形无关；从本质上来说，的大小表示两组分在两相间的平稳支配热力学性质的差异，
22、即分子间相互作用力的差异；5. 分别参数分别度 resolution，R相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值；也叫辨论率， 表示相邻两峰的分别程度； R；当 W1W2时， R；当 R1 时，称为 4 分别，两峰基本分别，暴露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约 2%；R1.5 时，称为 6 分别，暴露峰面积为 99.7%；R1.5 称为完全分别；中国药典规定 R应大于 1.5 ；基本分别方程 分别度与三个色谱基本参数有如下关系:R其中称为柱效项， 为柱选择性项， 为柱容量项；柱效项与色谱过程动力学特性有关， 后两项与色谱过程热力学因素有关；从基本分别方程可看出，提高分别度有三种途径：增加塔板数
23、；方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压；更好的方法是降低塔板高度，提高柱效； 增加选择性；当 1 时， R0，无论柱效有多高，组分也不行能分别；一般可以实行以下措施来转变选择性： a.转变流淌相的组成及 pH 值；b.转变柱温； c.转变固定相；转变容量因子；这经常是提高分别度的最简洁方法，可以通过调剂流淌相的组成来实 现；k2 趋于 0 时， R也趋于 0；k2 增大，R也增大；但 k2 不能太大，否就不但分别时间延长，而且峰形变宽， 会影响分别度和检测灵敏度； 一般 k2 在 110 范畴内，最好为 25， 窄径柱可更小些；二、塔板理论欢迎下载精品学习资源1. 塔板理论的基本
24、假设塔板理论是 Martin和 Synger 第一提出的色谱热力学平稳理论； 它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分别过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内 的支配平稳过程；塔板理论的基本假设为：1） 色谱柱内存在许多塔板， 组分在塔板间隔 （即塔板高度） 内完全听从支配定律， 并很快达到支配平稳；2） 样品加在第 0 号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽视；3） 流淌相在色谱柱内间歇式流淌，每次进入一个塔板体积；4） 在全部塔板上支配系数相等，与组分的量无关；虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到支配平 衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不行防止的；
25、但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程， 成功地说明白流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评判色谱柱柱效；2. 色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h 和峰面积 A）依据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述：C e 或 Ce由色谱流出曲线方程可知：当 t t R时，浓度 C有极大值， Cmax；Cmax就是色谱峰的峰高；因此上式说明：当试验条件确定时（即 确定），峰高 h 与组分的量 C0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析； 当进样量确定时， 越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度；由流出曲线方程对 V0 求积分，即得杰出谱峰面积 A Cmax C0
26、；可见 A相当于组分进样量 C0，因此是常用的定量参数； 把 Cmaxh 和 Wh/22.355 代入上式，即得 A1.064 Wh/2 h，此为正常峰的峰面积运算公式；三、速率理论（又称随机模型理论）1. 液相色谱速率方程1956 年荷兰学者 VanDeemter 等人吸取了塔板理论的概念， 并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论速率理论；它把色谱过程看作一 个动态非平稳过程，争辩过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响；后来 Giddings和 Snyder 等人在 Van Deemter 方程（ HAB/u Cu，后称气相色谱速率方程）的基础上，依据液体与气体
27、的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即Giddings 方程）：H2dp sup52p sup52p sup52f2. 影响柱效的因素1） 涡流扩散（ eddy diffusion）；由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色 谱柱中的流速不同而引起的峰展宽；涡流扩散项A2dp， dp 为填料直径， 为填充不规章因子， 填充越不均匀 越大；HPLC常用填料粒度一般为310m，最好 35m， 粒度分布 RSD5%；但粒度太小难于填充均匀 （ 大），且会使柱压过高； 大而均匀（球形或近球形）的颗粒简洁填充规章均匀，越小；总的说来，应接受细而均匀的载体， 这样有助于提高柱效；毛细管无填料， A0；2
28、） 分子扩散（ molecular diffusion）；又称纵向扩散；由于进样后溶质分子在柱 内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽；分子扩散项B/u2Dm/u；u 为流淌相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（ u 小），展宽越严肃；在低流速时，它对峰形的影响较大； Dm为分子在流淌相中的扩散系数，由于液相的Dm很小，通常仅为气相的10-410-5 ，因此在 HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽视不计；是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对Dm进行校正； 一般在 0.60.7 左右，毛细管柱的 1；3） 传质阻抗（ mass transferresi
29、stance）；由于溶质分子在流淌相、静态流淌相欢迎下载精品学习资源和固定相中的传质过程而导致的峰展宽；溶质分子在流淌相和固定相中的扩散、支配、 转移的过程并不是瞬时达到平稳，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱 总是在非平稳状态下工作，从而产生峰展宽；液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项；流淌相传质阻抗 HmCmd2pu/Dm，Cm为常数；这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致；靠近填充颗粒的流淌相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子 仍将来得及与固定相达到支配平稳就随流淌相前移，因而产生峰展宽；静态流淌相传质阻抗 Hsm Csmd2pu/Dm， Csm为常数；这是由于溶质
30、分子进入处于固定相孔穴内的静止流淌相中，晚回到流路中而引起峰展宽；Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用；固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小， 传质速率越高；所以改进固定相结构，减小静态流淌相传质阻力，是提高液相色谱柱效 的关键；Hm和 Hsm都与固定相的粒径平方 d2p 成正比，与扩散系数 Dm成反比；因此应接受低粒度固定相和低粘度流淌相； 高柱温可以增大 Dm，但用有机溶剂作流淌相时， 易产愤慨泡，因此一般接受室温；固定相传质阻抗 HsCsd2fu/Ds （液液支配色谱），Cs 为常数， df 为固定液的液膜厚度， Ds 为分子在固定液中的扩散系数； 在支配色谱中 H
31、s 与 df 的平方成正比， 在吸附色谱中 Hs 与吸附和解吸速度成反比；因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中， Hs 才有明显影响；接受单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽视；从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可接受以下措施：进样时间要短；填料粒度要小；改善传质过程；过高的吸附作用力可导致严肃的峰展宽和拖尾，甚至不行逆吸附；适当的流速；以H对 u 作图，就有一正确线速度uopt ，在此线速度时， H最小；一般在液相色谱中， uopt 很小（大约 0.030.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作；较
32、小的检测器死体积；3. 柱外效应速率理论争辩的是柱内峰展宽因素，实际在柱外仍存在引起峰展宽的因素，即柱外 效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应） ；色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即： 22柱内2柱外2 其它柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的全部死体积所引起；为了削减柱外效应，第一应尽可能削减柱 外死体积，如使用“零死体积接头”连接各部件，管道对接宜呈流线形，检测器的内腔 体积应尽可能小；争辩说明柱外死体积之和应VR/；其次，期望将样品直接进在柱头的中心部位，但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的；此外，要求进样体 积VR/2；柱外效应的直观标志是容量
33、因子 k 小的组分（如 k2）峰形拖尾和峰宽增加得更为明显； k 大的组分影响不显著；由于 HPLC的特殊条件，当柱子本身效率越高（ N越大）， 柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出；而在经典LC 中就影响相对较小；III HPLC系统HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成；其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件；有的仪器仍有梯度洗脱装置、在线脱气机、 自动进样器、预柱或爱惜柱、柱温把握器等，现代HPLC仪仍有微机把握系统，进行自动化仪器把握和数据处理；制备型HPLC仪仍备有自动馏分收集装置；最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪，绘出
34、欢迎下载精品学习资源的峰是通过手工测量运算峰面积；后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱，柱填料从单一品种进展至几百种类型，检测器从单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器；数据处理不再用绘图仪，逐步取而代之的是最简洁的积分仪、运算机、工作站及网络处理系统；目前常见的 HPLC仪生产厂家国外有 Waters 公司、 Agilent 公司（原 HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等；一、输液泵1. 泵的构造和性能输液泵是 HPLC系统中最重要的部件之一；泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的牢靠性；输
35、液泵应具备如下性能：流量稳固，其RSD应 0.5%，这对定性定量的精确性至关重要；流量范畴宽，分析型应在0.110 ml/min 范畴内连续可调，制备型应能达到 100 ml/min ；输出压力高，一般应能达到 150300kg/cm2；液缸容积小；密封性能好，耐腐蚀；泵的种类许多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵；恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵；恒压泵受柱阻影响，流量不稳固；螺旋泵缸体太大， 这两种泵已被剔除；目前应用最多的是柱塞往复泵；柱塞往复泵的液缸容积小，可至 0.1ml ，因此易于清洗和更换流淌相，特殊适合于再循环和梯度洗脱； 转变电机转速能便利地调剂流量， 流
36、量不受柱阻影响； 泵压可达 400 kg/cm2；其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多接受双泵系统来克服；双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（ RSD为 0.1%左右，串联泵为 0.20.3%），但出故障的机会较多（因多一单向阀） ，价格也较贵；各品牌输液泵的基本参数：工程Waters 515型HP 1100型LC-10ATvp型Elite P200 II型检定要求流速范畴0.001100.001100.0019.9990.014.99调剂精度0.0010.0010.0010.01流量精密度流量精确度RSD0.1%0.15%（0.3%）0.3%2.0%0.5%5.
37、0%1.5%2.0%最高压力4000 Psi40 MPa39.2MPa40.0MPa密封圈寿命流淌相的脉冲2. 泵的使用和爱惜留意事项为了延长泵的使用寿命和爱惜其输液的稳固性，必需依据以下留意事项进行操作：防止任何固体微粒进入泵体，由于尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流淌相中的任何固体微粒；流淌相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可接受 Millipore 滤膜（ 0.2µ ；m或 0.45µ ；m）等滤器；泵的入口都应连接砂滤棒（或片） ；输液泵的滤器应经常清洗或更换；流淌相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流淌相不应保留
38、在泵内，特殊是在停泵过夜或更长时间的情形下； 假如将含缓冲液的流淌相留在泵内， 由于蒸发或泄漏， 甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等；因此，必需泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱储存和有利于泵爱惜的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇- 水）；泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流淌相被用完，否就空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液；输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否就会使高压密封环变形，产生欢迎下载精品学习资源漏液；流淌相应当先脱气， 以免在泵内产愤慨泡， 影响流量的稳固性， 假如有大量气泡， 泵就无
39、法正常工作；假如输液泵产生故障，须查明缘由，实行相应措施排除故障：没有流淌相流出，又无压力指示；缘由可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量（如 5ml/min ）下运转，将气泡排尽，也可用一个 50ml 针筒在泵出口处帮忙抽出气体；另一个可能缘由是密封环磨损，需更换；压力和流量不稳；缘由可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗；有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流淌相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如 4mol/L 硝酸）内快速除去微生物，或将盐溶解，再马上清洗；压力过高的缘由是管路被堵
40、塞，需要清除和清洗；压力降低的缘由就可能是管路有泄漏；检查堵塞或泄漏时应逐段进行；3. 梯度洗脱HPLC有等强度 isocratic和梯度 gradient洗脱两种方式；等度洗脱是在同一分析周期内流淌相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品；梯度洗脱是在一个分析周期内程序把握流淌相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH 值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品；接受梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分别度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是经常引起基线漂移和降低重现性；梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）；两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗
41、脱曲线：线性梯度、凹形 梯度、凸形梯度和阶梯形梯度； 线性梯度最常用， 特殊适合于在反相柱上进行梯度洗脱；在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必需充分重视：要留意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流淌相；有些溶剂在确定比例内混溶，超出范畴后就不互溶，使用时更要引起留意；当有机溶剂和缓冲液混合时，仍可能析出盐的晶体，特殊使用磷酸盐时需特殊当心；梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性；进行样品分析前必需进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，由于弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来；用于梯度洗脱的溶剂需完全脱气，以防止混合时产
42、愤慨泡；混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱经常显现压力的变化；例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大许多，此时的柱压大约是甲醇或水为流淌相时的两倍； 因此要留意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承担的最大压力；每次梯度洗脱之后必需对色谱柱进行再生处理， 使其复原到初始状态； 需让 1030倍柱容积的初始流淌相流经色谱柱，使固定相与初始流淌相达到完全平稳；二、进样器早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处；现在大都使用六通进样阀或自动 进样器；进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色 谱系统的压力、流量影响小； HPLC进样方式可分
43、为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样；1. 隔膜进样；用微量注射器将样品注入特地设计的与色谱柱相连的进样头内，可 把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得正确的柱效，且价格 廉价，操作便利；但不能在高压下使用（如10MPa以上）；此外隔膜简洁吸附样品产生欢迎下载精品学习资源记忆效应， 使进样重复性只能达到12%；加之能耐各种溶剂的橡皮不易找到， 常规分析使用受到限制；2. 停流进样；可防止在高压下进样；但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会显现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准；在以峰的始末信号把握馏分收集 的制备色谱中，成效较好；3. 阀进样；一般 HPLC
44、分析常用六通进样阀 （以美国 Rheodyne公司的 7725 和 7725i型最常见），其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成；由于阀接头 和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降510%左右），但耐高压（ 3540MP）a，进样量精确，重复性好（ 0.5%），操作便利；六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种；用部分装液法进样时，进样 量应不大于定量环体积的 50%（最多 75），并要求每次进样体积精确、相同；此法进样的精确度和重复性准备于注射器取样的娴熟程度，而且易产生由进样引起的峰展宽；用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的510 倍（最少 3 倍），
45、这样才能完全置换定量环内的流淌相，排除管壁效应，确保进样的精确度及重复性；六通阀使用和爱惜留意事项：样品溶液进样前必需用0.45µ ；m滤膜过滤，以削减微粒对进样阀的磨损；转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否就流淌相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏；为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析终止后应冲洗进样阀；通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗；4. 自动进样；用于大量样品的常规分析；三、色谱柱色谱是一种分别分析手段，分别是核心，因此担负分别作用的色谱柱是色谱系统的心脏；对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等；市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为 3,5,7,10 m等，柱效理论值可达 516 万/M；对于一般的分析只需 5000 塔板数的柱效；对于同系物分析，只要500 即可；对于较难分别物质对就可接受高达2 万的柱子， 因此一般 1030cm左右的柱长就能中意复杂混合物分析的需要；柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到正确效率，除柱外死体积要小外，仍要有合理的柱结构（尽可能削减填充床以外的死体积）及装填技术；即使最好