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1、新冠病毒核酸检测技术要点梳理新冠病毒核酸检测系统的关键要素新冠病毒核酸检测结果分析内容新冠病毒核酸检测系统的关键要素第一部分01新冠病毒核酸检测系统的关键要素01新冠病毒核酸检测系统的关键要素01新冠病毒核酸检测系统的关键要素1.人群筛查及集中隔离人员标本的选择：首选鼻咽拭子，其次选择口咽拭子2.已知感染的住院患者标本选择：痰鼻咽拭子口咽拭子粪便01新冠病毒核酸检测系统的关键要素标本送检及接收保存1.标本送检：标本采集后室温放置不超过4小时，应在2-4h内送到实验室。如果需要长途运输标本，应采用干冰等制冷方式进行保存，严格按照相关规定包装运输。标本运送期间避免反复冻融。2.标本接收：标本接收人
2、员的个人防护按采样人员防护装备执行。标本运送人员和接收人员对标本进行双签收。转运人员与实验室交接时，需记录采样地点，送样时间，样本数量（生物安全柜内进行样本的核查清点），送样人员等信息。01新冠病毒核酸检测系统的关键要素标本送检及接收保存3.标本保存：l 检测前：含胍盐保存液采样管采集的标本可根据采样管说明书要求的保存条件及时间要求进行运送和保存。24小时内无法检测的标本则应置于-70或以下保存（如无-70保存条件，则于-20冰箱暂存）。l 检测后：境外高风险区域人群以及新冠肺炎患者的密接者和密接者的密接者等集中隔离人员的核酸检测标本，检测后，应当在-20保存7天。其他一般人群筛查标本，则可在
3、-4保存24小时。应当设立专库或专柜单独保存标本。01新冠病毒核酸检测系统的关键要素PCR室设计的一般原则：各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作 工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时缓冲区作用：控制风向各区通风换气：10次/小时12次/小时（P2+)核心问题：防止核酸污染实验室检测-新冠核酸检测系统（RT-PCR法）PCR实验室布局01新冠病毒核酸检测系统的关键要素1.人: 操作人员资质、岗位能力评估2.机：核酸提取仪、PCR扩增仪、生物安全柜、病毒灭活设备、冰箱、 UPS 。3.料：核酸提取试剂盒、核酸扩增试剂盒4.环：实验室环境5.法：SOPs 。实验室检测-新冠核酸检测系统（RT-P
4、CR法）01新冠病毒核酸检测系统的关键要素实验室检测-试剂准备01新冠病毒核酸检测系统的关键要素实验室检测-样本前处理01新冠病毒核酸检测系统的关键要素实验室质量管理与控制-性能验证01新冠病毒核酸检测系统的关键要素实验室质量管理与控制-室内质控1.每批检测至少有1份弱阳性质控品（第三方质控品，通常为检出限的1.5-3倍），3份阴性质控品（生理盐水）。2.质控品随机放在临床标本中，参与从提取到扩增的全过程。3.在大规模人群筛查时，因人群流行率极低（0.1），一旦出现阳性结果，对阳性标本采用另外一到两种更为灵敏且扩增不同区域的核酸检测试剂对原始标本进行复核检测，复核阳性方可报出。4.物品和环境样
5、本进行实验室检测时，除每批次检测至少有1份弱阳性质控品（第三方质控品，通常为检出限的1.5-3倍）、3份阴性质控品（生理盐水）外，还需要在采样前及采样过程中至少设置一个现场空白及运输空白样本,以进行过程中的质量控制。01新冠病毒核酸检测系统的关键要素实验室检测安全管理1.根据当前版本的国际航空运输协会（IATA）危险品规则，SARS-CoV-2感染疑似和确诊患者标本属于UN3373B类生物物质，涉及外部标本运输的，应按照B类感染性物质进行三层包装。疑似或确诊患者标本应标示有特殊标识，并进行单独转运。2.核酸检测应当在生物安全二级实验室进行，并应在生物安全风险评估的基础上，采取适当的个体防护措施
6、，包括手套、口罩和隔离衣等。3.开展新冠病毒核酸检测的实验室应当制定实验室生物安全相关程序文件及实验室生物安全操作失误或意外的处理操作程序，并有记录。01新冠病毒核酸检测系统的关键要素实验室检测安全管理4.实验日常清洁要求（1）地面、台面、转运容器、塑料及有机玻璃物品消毒：0.2%含氯消毒剂或75%酒精。（2）空气消毒：紫外线灯照射2小时以上，必要时可采用核酸清除剂等。（3）生物安全柜消毒：试管架、台面、移液器等使用75%酒精进行擦拭消毒。随后关闭生物安全柜，紫外线照射30分钟。01新冠病毒核酸检测系统的关键要素实验室废弃物的处理1.检测耗材、个人防护装备等均需要使用双层防渗漏专用包装袋打包密
7、封后经过压力蒸汽灭菌，再转运出实验室。2.扩增后的反应管不要开盖，直接放于垃圾袋，封好袋口，按一般医疗废物转移除实验室处理。3.检测完成后的剩余样本，可在结果报告发出到达其保存时限要求后，装入专用密封废物转运袋中进行压力蒸汽灭菌处理，随后随其他医疗废弃物一起转运出实验室销毁处理。4.体积较大的固体废弃物如HEPA过滤器，应由专业人士进行原位消毒后，装入安全容器内进行消毒灭菌。5.不能进行压力蒸汽灭菌的物品，可采用环氧乙烷熏蒸消毒处理。01新冠病毒核酸检测系统的关键要素实验室废弃物的处理6.废液的处理：实验室产生的废液分为普通污水和感染性废液，普通污水产生于洗手池等设备，对此类污水应当排入实验室
8、水处理系统。感染性废液是在实验操作过程中产生的废液，需采用化学消毒（0.55%含氯消毒剂处理）或物理消毒（紫外灯照射30min以上）方式处理，确认彻底消毒后方可排入实验室水处理系统，统一处理。新冠病毒核酸检测结果分析第二部分02新冠病毒核酸检测结果分析 实验室要确认某个病例为新冠核酸检测阳性，在质控在控的情况下需满足以下2个条件中的1个：（1）同一份样本中新冠核酸2个靶标（ORF1ab、N）检测结果均为阳性，如果出现单个靶标阳性的检测结果则需要重新采样并重新检测，如果检测结果仍然为单靶标阳性，则判定为阳性；（2）2种样本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳性或同种类型样本2次采样检测均出现单个
9、靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。 但是，核酸检测的阴性结果不能排除感染。样本质量差（口咽等部位的呼吸道样本）、样本收集过早或过晚、没有正确保存、运输和处理样本、技术本身存在问题（病毒变异、PCR抑制）等，都有可能造成假阴性。新冠病毒核酸检测阳性结果判断标准02新冠病毒核酸检测结果分析 阳性结果的复检实验室应常备两种以上不同厂家的核酸检测试剂。 一种用于日常检测（初检），另外一种或两种用于出现阳性结果的标本的复核检测（复检）；只有复检同样为阳性时，才能报出。为什么要复检？ 因为在人群筛查时，一旦出现弱阳性或单靶阳性，尤其是前一次出现过阳性检出时，很可能是污染所致。l 由于目前的试剂盒多为双靶或
10、三靶，但对不同靶基因的检测效率有差异，且有的差异还较大，从而扩增效率高的单靶更容易出现污染，因此如果出现扩增效率高的靶基因单阳性，很可能为污染所致；l 某次检测不明原因出现较多阳性，且多为较弱或单靶阳性。02新冠病毒核酸检测结果分析 常见的假阳性污染的来源最主要的来源：l 标本（包括试剂盒所带的强阳性对照）之间的“交叉污染”l 扩增产物的“遗留污染”其他可能的来源：l 试剂污染l 某种偶然误差如加错样本所致02新冠病毒核酸检测结果分析 假阳性污染来源分析02新冠病毒核酸检测结果分析通风：极其重要的预防前述“污染”的措施！实验室各区的使用管理：单一工作流向操作：l 加样器加样时，必须使用带滤芯吸
11、头；l 加样过程加样器头部污染，则即采用加样器清洁流程进行清洁。l 检测过程中，如发现手套污染即丢弃换新的手套；清洁：l 每批检测后，按SOP清洁仪器设备（提取仪、离心机、扩增仪等）l 每批检测后，室内紫外照射2小时，可使用可移动紫外灯；l 使用PCR核酸气溶胶污染清洁剂，擦拭可能存在污染的设备、工作台面等处理造成假阳性污染的常用方法02新冠病毒核酸检测结果分析 实验室要确认某个病例为新冠核酸检测阴性，在质控在控的情况下需满足：同一份样本中新冠核酸2个靶标（ORF1ab、N）无扩增曲线，内标有明显扩增曲线。 但是，核酸检测的阴性结果不能排除感染，需结合临床。样本质量差（口咽等部位的呼吸道样本）、样本收集过早或过晚、没有正确保存、运输和处理样本、技术本身存在问题（病毒变异、PCR抑制）等，都有可能造成假阴性。新冠病毒核酸检测阴性结果判断标准谢谢聆听！