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1、210 2018,V0139,No02 食品科学 成分分析基于拉曼光谱法测定冷鲜牛肉中肌红蛋白相对含量张同刚，罗瑞明，李亚蕾木，周亚玲(宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)摘要：为研究4贮藏期间冷鲜牛肉3种化学形式肌红蛋白相对含量变化，对采集的一维拉曼光谱，用2D-shige二维相关分析软件对其光谱数据进行二维相关分析，得出3种化学形式肌红蛋白的相对含量最佳推导公式。结果表明：肌红蛋白、氧合肌红蛋白与高铁肌红蛋白相对含量的最佳推导公式分别为：脱氧肌红蛋白相对含量，=(-0305 5x+19570)100；氧合肌红蛋白相对含量，=(-2933 9x+15417)100；高铁肌红蛋白相对含量，
2、=(1574 3x一14369)100。3种化学形式的肌红蛋白相对含量的预测效果为高铁肌红蛋白脱氧肌红蛋白氧合肌红蛋白，其中波数为1 033 l 248 cm-1时，高铁肌红蛋白相对含量的误差值最小为476。研究表明，基于拉曼光谱法无损检测冷鲜牛肉中肌红蛋白相对含量是可行的。关键词：拉曼光谱；二维相关光谱技术；冷鲜牛肉；肌红蛋白Determination of Myoglobin in Chilled Beef Based on Raman SpectroscopyZHANG Tonggang，LUO Ruiming，LI Yalei木，ZHOU Yaling(School of Agricu
3、lture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China)Abstract：In this study，we examined the changes in the relative amounts of three chemical forms of myoglobin，deoxymyoglobin(DeoxyMb)，oxymyoglobin(OxyMb)and metmyoglobin fMetMb)，in flesh beef meat stored at 4Forthis purpose，onedimensional Raman spectral d
4、ata were acquired and analyzed by two-dimensional correlation analysisusing 2D-shige softwareThe optimal formulas for the relative amounts ofthree chemical forms of Mb were DeoxyMbl=(-0305 5x+19570)100；OxyMbl=(-2933 9x+15417)100；and MetMb=(1574 3x一14369)X 100，respectivelyThe prediction efficiency of
5、 these formulas Was in the decreasing order：MetMbDeoxyMbOxyMbWhenthe Raman frequency was 1 0331 248 cm-1，the root mean square error of prediction of MetMb Was minimum，only 476Therefore，it is feasible to determine the relative amount ofmyoglobin using Raman spectroscopyKeywords：Raman spectroscopy；two
6、dimensional correlation spectxoscopy；chilled beef；myoglobinDOI：107506spkxl0026630201802033中图分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：10026630(2018)02021005引文格式：张同刚，罗瑞明，李亚蕾，等基于拉曼光谱法测定冷鲜牛肉中肌红蛋白相对含量J】食品科学，2018，39(2)：210214DOI：107506spkxl0026630201802033http：wwwspkxnetcnZHANG TonggmlgLUO Ruiming,LI Yalei,et aL衄删11蚯0f m、唾
7、灿渤蝴beefbas。d$炳鹚删F00d Scimce,2018，39(2)：210214(inChinesewithEnglishabstract)DOI：107506spkxl002-6630-201802033http：llwwwspkxnetcn肉色是影响消费者对肉购买行为的决定性因素，因为肉的颜色被认为是评价肉及肉制品新鲜程度和品质特征的重要指标。牛肉色泽主要由血红蛋白与肌红蛋白决定，屠宰后放血充分的鲜肉中，肉的颜色主要是由肌红蛋白在肉中的含量和存在状态决定的。刚刚屠宰完的收稿日期：20170506基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目(31660442)肉色呈现为暗红色(脱氧肌
8、红蛋白)，随后与氧气的接触，发生氧化反应，呈现为鲜红色(氧合肌红蛋白)，随着冷鲜牛肉贮藏时问的延长，肉色发生褐变(高铁肌红蛋白)D4I o随着我国人民生活水平的提高，冷鲜肉正逐渐成为我国肉类消费的主流，在冷鲜肉推广的过程中第一作者简介：张同刚(1987一)，男，博士研究生，研究方向为畜产品加工。E-mMI：372998013qqcom+通信作者简介：李亚蕾(1967一)，女，教授，硕士，研究方向为畜产品加工与安全。E-mml：yaleilicn万方数据成分分析 目晶科学 2018,V0139,No02 211贮藏期是面临的最大问题之一，只有在保证了冷鲜肉食品质量安全的同时，延长贮藏期，冷鲜肉才
9、能快速稳定的进一步发展p捌。拉曼光谱属于振动光谱的一个分支，是红外光谱的有效补充。可用于检测不同状态食品中蛋白质分子结构的变化n41。二维相关技术将拉曼光谱信号扩展到第二维上，提高了光谱分辨率，简化了含多重重叠峰的复杂光谱，并能通过提供各信号峰之间变化的相关关系，鉴别和研究分子内和分子间的相互作用【l孓2”。本实验通过基于二维相关拉曼光谱法研究4贮藏期间冷鲜牛肉肌红蛋白相对含量的变化，从蛋白分子角度研究冷鲜牛肉贮藏中色泽变化规律，探明肉色变化特征，为下一步探明高铁肌红蛋白合成和分解的反应原理和富集的原因提供理论依据，合理控制冷鲜牛肉高铁肌红蛋白含量，开发缓解肉色褐变的相应技术，延长冷鲜牛肉货架
10、期，具有重要的指导意义。1 材料与方法11 材料与试剂背最长肌 宁夏回族自治区银川市新百超市宁阳店；乳酸、蔗糖、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸(均为分析纯) 银川听泰生物试剂公司。12 仪器与设备Inspector 300拉曼光谱仪 美国赛普斯公司；HHSY21Ni6C高速组织捣碎机 江苏金坛市亿通电子有限公司；UV-1200紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。13 方法1_31 样品处理本研究选取宁夏本地2岁龄左右的秦川牛作为研究对象。按照伊斯兰的屠宰方式进行屠宰。工艺流程为：肉牛验收一禁食一宰前沐浴一诵经一刺杀放血一去头、蹄一剥皮开膛一四分体一胴体修整一冷却一成熟。将
11、胴体修正后，立即取下背最长肌在O4，真空包装保藏。为避免微生物作用因素干扰，获得肉自身生理生化变化对引起肉色变化的数据，样品每天在洁净工作台拆包装后以蒸馏水清洗，用4乳酸液喷淋杀菌，重新包装后在04条件下保藏。选取清真屠宰牛肉贮藏期中的8个时间点检测，以胴体修整作为0 d，分别选取0、3、6、9、12、15、18、21 d八个时间点检测。132 肌红蛋白含量测定参,照,Krzywickel22的方法，取待测5 g肉样，加入25 mL浓度为004 molL、pH 68的磷酸缓冲液，用超细匀浆器在室温条件下以10 000 rmin均质25 8。置均质液与4冰箱中避光保存1 h，然后与4 500g，
12、4离心20 min。将上清液通过滤纸过滤，滤液用分光光度计分别在波长525、545、565 nnl和572 nln处测其吸光度，并按下式计算：Pl-(O369RI+1140R2一O941R3+0015)100P2=(0882Rl一1267R2+0809R30361)100B=(一2514Rl+O777R2+O800R3+1098)100式中：P，、P2、B分别为脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白与高铁肌红蛋白的相对含量；R。、R：、R，分别为吸光度比值4抛。叫必。、彳565。，ns25帆、4s45。525。133 拉曼光谱测定取贮藏0、3、6、9、12、15、18、21 d八个时间点的肉样5 g置于可
13、升降平台上，使待测肉样中心位置放于拉曼光谱50倍镜头下，进行测定，激光波长为785 mn，功率为10 mW，扫描范围为4001 700 cm，聚焦深度为200瑚咀。134 光谱预处理拉曼光谱实验中，仪器系统噪声会干扰有用的信息，从而影响模型的建立与预测效果。通常，使用基线校准和曲线平滑对拉曼光谱数据进行预处理，尽量减少干扰。实验用SavitzkyGolay平滑滤波方法进行拉曼光谱数据曲线平滑处理，采用8点平滑。14 数据处理首先用2D shige软件对预处理后的验证集样本的拉曼光谱处理，得到其同步二维拉曼相关光谱图。二维拉曼光谱图中包含自动峰与交叉峰，找出随样品浓度变化而变化的多组特征峰。每组
14、特征峰包括一个随样品浓度升高峰强度值(五。)而升高的上升峰和一个随样品浓度升高峰强度值(瓦。)而下降的下降峰，计算不同浓度样品的每组特征峰的峰比(peak ratio，PR)值，PR=Ii。c，(五。+厶。)100。通过PR值与样品校正集中的肌红蛋白、氧合肌红蛋白、高铁肌红蛋白相对含量的回归方程，PR=K。肌红蛋白相对含量+口(K。为斜率，口为截距)。确定拉曼光谱法肌红蛋白、氧合肌红蛋白、高铁肌红蛋白相对含量推导公式。读取检验集样本拉曼光谱(经预处理后)的k与k，确定PR值后代入回归方程，得到相对含量。2 结果与分析21 4贮藏冷鲜牛肉肌红蛋白拉曼光谱图由图l可知，902、996 cm_1处的
15、特征峰带较宽，表明变化相对明显，1 023、1 208、l 347、1 625 cml处的特征峰带相对较窄，表明变化相对不明显。冷鲜牛肉样品的一维拉曼光谱在900 1 700 cm一1范围内重叠严重，且小峰显示不明显，不容易分辨。从图1可知，各特征吸收峰比较相似，由此可认为冷鲜牛肉样品的一维拉曼光谱图直观上没有较明显的差异。万方数据50() I f)(Hj i 500波数cm【剞1 冷鲜1肉托蛏)匕谱图Fig1 Salnan spectra of chilled beef22 二维相关拉曼光谱221 4贮藏冷鲜牛肉肌红蛋白二维拉曼光谱图E 1 400彝餐1 2001 000I 60(g l 4
16、0(彝鲻l 20(1 0)()00 1 200 l 400 1 600波数cml1()oo 2()( 1 41)(1 611f)rI戡几111t J， 【1 II cl，1dpl黹l：b玎jp峭I剖图2 4贮藏冷鲜牛内的二维相关谱图Fig2 2D correlation spectra ofchilled beef如图2所示，对角线上的为自动峰，对角线外的为交叉峰；阴影填充的部分为负峰，未填充的部分为正峰。其中二维相关光谱图有8个自动峰，分别为1 033、1 248、l 385、1 426、l 560、l 582、1 605 cm_1和1 665 CITI；交叉峰分别为1 033 cnl一1与
17、1 248 CITI，l 385 CITI一1与1 426 cm一1，1 560 CITI一1与l 582 cm一1，l 560 cm_1与l 605 CITI。正峰与负峰呈轴对称出现，且l 460 l 650 cm_1间含有较多小峰，出现较多杂带的干扰，说明肌红蛋白在常温放置氧化过程中可能产生一些物质对拉曼光谱产生荧光干扰。不同贮藏时间肌红蛋白的拉曼光谱存在的微小差异可利用二维相关光谱技术显现，而在一维拉曼光谱中不能明确体现。卢明子等【2列发现不同氧化方式下血红蛋白的拉曼光谱存在的微小差异可利用二维相关光谱技术显现。通过加入不同氧化剂，可见较多杂带的干扰，说明血红蛋白在常温放置34 d过程中
18、血红蛋白解聚，球蛋白变性，生成的一些杂质降低了拉曼光谱的信噪比【23也41。1 248 cm1特征峰为蛋白质变性和肌红蛋白聚集的主要标志峰，二维相关拉曼光谱中1 248 om1自动峰的出现，说明虽然肌红蛋白在4避光贮藏条件下放置可发生氧化生成高铁肌红蛋白，但是长期放置会导致肌红蛋白解聚，球蛋白已发生不可逆变性。1 460 l 650 CITI_1间出现了较多自动峰，在一维拉曼光谱中可见较多杂带的干扰，说明肌红蛋白在4放置21 d过程中蛋白发生了变性，生成的一些杂质降低了拉曼光谱的信噪比。222 一元线性回归定量分析表1 冷鲜牛肉肌红蛋白拉曼光谱的特征蜂蜂强度值Table 1 Intensity
19、 of characteristic Samall spectral peaks ofmyoglobin in beef相对含量 峰强度序号脱氧肌氧合肌高铁肌1 033 1 248 1 385 1 426 l 560 1 582 1 605 1 665红蛋白红蛋白红蛋白 cm叫 cm叫 锄 皿叫 cm叫 锄叫 锄叫 锄叫表2 冷鲜牛肉中肌红蛋白拉曼光谱特征峰的PR值Tabie 2 PR values of characteristic Raman spectra peaks ofmyoglobin in beef阳信序鲁-，-，二=圭=-?一l 033l 2档cml 1 3851 426锄1
20、I 560一l 582 cml l 560l 650-。吣删吣963型爱耐牮万方数据成分分析 艮晶科学 2018,V0139,No02 213将表1中肌红蛋白相对含量为横坐标，与表2中相对应的PR值为纵坐标做一元线性回归，见表3。表3 PR值与脱氧肌红蛋白相对含量的一元线性回归方程Table 3 Linear rqg他ssi蚰equation between PR value andI)eoxyMb content注：y为PR值，J为肌红蛋白相对含量。由表3可以看出，1 0 3 31 2 4 8 c m_1与1 5 6 01 5 8 2 c m_1的相关系数，大于09 5，l 385l 426
21、 em-1与1 5601 650 cm1的相关系数rd,于095。因此，通过PR值评估肌红蛋白相对含量，主要考察1 0331 248 cm-1与1 5601 582 cm-1的PR值。表4 PR值与氧合肌红蛋白相对含量的一元线性回归方程Table 4 Linear Feglrll蛐on equation between PR value andOxyMb eontent注：y为PR值，z为氧合肌红蛋白相对含量。由表4可以看出，1 3 8 51 4 2 6 c m-1与l 5 6 01 6 5 0 c m-1的相关系数，大于09 5，1 0331 248 cm-1与l 560l 582 cm_1
22、的相关系数，小于095。因此，通过PR值评估氧合肌红蛋白相对含量，主要考察1 3851 426 cm-1与1 5601 650 cm-1的PR值。表5 PR值与高铁肌红蛋白相对含量的一元线性回归方程Table 5 Linear件掣洳equation between PR value andlVletlMb content注：y为PR值，J为高铁肌红蛋白相对含量。由表5可以看出，l 0331 248、1 3851 426 cml与l 5 6 01 5 8 2 cm-1的相关系数，大于09 5，1 5601 650 cm-1的相关系数r4,于095。因此，通过PR值评估高铁肌红蛋白相对含量，主要考
23、察l 033l 248、l 3851 426 cml与1 560l 582 cm_1的PR值。将表35中相关系数，大于095的方程分别进行转置，分别得到脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白、高铁肌红蛋白的推算公式(蛋白相对含量9特(PRXa+6)100)，如下：脱氧肌红蛋白相对含量计算公式：1 033l 248 cm：脱氧肌红蛋白相对含量，=(-0282 lx+17682)1001 560l 582 cm：脱氧肌红蛋白相对含量=(-0305 5x+19570)100氧合肌红蛋白相对含量计算公式：l 385l 426 cm：氧合肌红蛋白相对含量=(-2933 9x+15417)1001 5601 650
24、cm：氧合肌红蛋白相对含量，=(-2520 0x+15166)100高铁肌红蛋白相对含量计算公式：1 033l 248 cm：高铁肌红蛋白相对含量，=(1574 3工一14369)1001 3851 426 cm：(1904 3工一29292)1001 5601 582 cm：(1680 4菇一23718)100式中：x为PR值。高铁肌红蛋白相对含量=高铁肌红蛋白相对含量=表6 待溯冷鲜牛肉中肌红蛋白拉曼光谱特征峰的PR值Table 6 PR VaIu髂ofch髓ct盯蛔匮c lhumBn spectral吣0fmyoglobin ibeef mples协be砒脚yzed表7 不同特征峰预测肌
25、红蛋白相对含量Table 7 PreSell relative contents of my咄啪hlsed ondif如rent chnncteri鲥c pks由表6、7可得，波数为l 5601 582 cm-1时，脱氧肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为万方数据214 2018,VoL39,No02 目品斛学 成分分析690，波数为l 033 l 248 cm_1时，脱氧肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为103。因此，波数为l 5601 582 cm-1时，脱氧肌红蛋白相对含量的预测效果相对较好。波数为1 3851 426 ClIl-1时，氧合肌红蛋白相对含量预测值
26、与实际值的相对平均误差值为703，波数为l 5601 650 cm_1时，氧合肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为93l。因此，波数为l 385l 426 cm-1时，氧合肌红蛋白相对含量的预测效果相对较好。波数为1 3851 426 Clll-1时，高铁肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为84，波数为1 033 l 248 cm-1时，高铁肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为476，波数为1 5601 582 cm-1时，高铁肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为127。因此，波数为1 033 l 248 cm-1时，高铁肌红蛋白相对含量的预测效
27、果最好。3种肌红蛋白相对含量的预测效果为高铁肌红蛋白脱氧肌红蛋白氧合肌红蛋白。在清真屠宰充分放血的情况下，肌红蛋白约占8090，为肉色的主要呈色物质。肌红蛋白是球状血红素蛋白质，主要贮存在肉类动物的肌肉中心硐。脱氧肌红蛋白与氧气的结合是可逆的，肌细胞内的氧主要通过脱氧肌红蛋白转运和储存，牛肉色泽主要由脱氧肌红蛋白浓度、氧化状态、稳定性以及与其他物质结合情况决定，宰后脱氧肌红蛋白在肉中的3种氧化还原形态之间会随着贮藏时间、温度、pH值等因素发生变化，从而决定肉的色泽【28。o】。3 结论脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白与高铁肌红蛋白含量的最佳推导公式分别为：脱氧肌红蛋白相对含量，=(-0305 5x+
28、19570)100；氧合肌红蛋白相对含量，=(-2933 9x+15417)100；高铁肌红蛋白相对含量，=(1574 3x-14369)X 100；3种肌红蛋白含量的预测效果为：高铁肌红蛋白脱氧肌红蛋白氧合肌红蛋白，其中波数为l 033 1 248 cnl-1时，高铁肌红蛋白相对含量的误差值最小为476。利用二维相关光谱技术可显现在4不同贮藏时间条件下冷鲜牛肉中肌红蛋白拉曼光谱的微小差异，反映冷鲜牛肉贮藏过程中肌红蛋白发生自然氧化还原反应的情况，从分子结构的角度为冷鲜牛肉贮藏过程中色泽变化与拉曼光谱测定肌红蛋白相对含量方法学的建立提供科学数据和理论依据。参考文献：【l】 刘笑笑，华晶忠，李树
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