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1、一、生物大分子的分离与纯化技术生物大分子的分离与纯化技术二、肝酶提取二、肝酶提取引言 在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。 什么是生物大分子？ 生物体内结构具有一定的规律性，由基本结构单位按一定顺序和方式连接而形成的多聚体称为生物大分子。其分子量一般大于10000。有：蛋白质(包括酶)、多聚糖和核酸类化合物等。生物大分子分
2、离纯化的特殊性 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 设计思路 前期准备生物材料的选择及预处理组织与细胞破碎初级提取分离精细分离纯化纯度鉴定产物处理前期准备一、明确目的和要求二、了解的生物大分子的物学性质 1)在水和各种有机溶剂中的溶解性。 2)在不同温度、pH 值和各
3、种缓冲液中生物大分子的稳定性 3)固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 4)各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数 5)其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 6)对其他生物分子的特殊亲和力。生物材料选择 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。 选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。 动物组织动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，
4、则要先破碎细胞。 植物植物要先去壳、除脂。 微生物材料微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。 生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。 组织细胞的破碎组织细胞的破碎 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。(1)机械法：1) 研磨研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。2) 组织捣碎器组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/mi
5、n20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。(2)物理法：1) 反复冻融法：反复冻融法：将待破碎的细胞冷至15到20，然后放于室温(或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。2) 超声波处理法：超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000105Pa2000105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。4) 冷热交替法冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在
6、90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。(3)化学与生物化学方法：1) 自溶法：自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。2) 溶胀法：溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 3) 酶解法：酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。 4) 有机溶剂处理法：有机溶剂处理法：利用氯仿、甲
7、苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。 “提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。 影响提取的因素主要有： 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； 由固相扩散到液相的难易； 溶剂的pH值和提取时间等。通常：极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂； 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； 温度升高，溶解度加大； 远离等电点的pH值，溶解度增加。提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度
8、的增加和保持其生物活性。生物大分子的提取 水溶液提取：水溶液提取：蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。 有机溶剂提取：有机溶剂提取：一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。分离纯化 刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，必须进一步分离纯化。分离提纯各种生物大分子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异，选用有机溶剂沉淀，等电点沉淀，盐析，层析，电泳，超离心，吸附，结晶等方法分离纯化 刚提取得到的大分子物质，往往
9、是粗制品，含有许多杂质，必须进一步分离纯化。分离提纯各种生物大分子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异，选用有机溶剂沉淀，等电点沉淀，盐析，层析，电泳，超离心，吸附，结晶等方法。离子交换层析法离子交换层析法 电泳法电泳法电荷性质的差异电荷性质的差异分子大小形状差异分子大小形状差异凝胶过滤法凝胶过滤法 超滤法超滤法 透析法透析法 离心法离心法溶解度差异溶解度差异分配层析分配层析萃取萃取结晶结晶盐析盐析有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 选择性沉淀选择性沉淀沉沉淀淀法法产品处理 浓缩、干燥浓缩、干燥 经过分离、纯化得到的提取液有时很稀，体积较大，需要采用蒸馏法、冰冻法、吸收法、超滤
10、法等，去除水分而浓缩、干燥。 保存保存 保存应在低温避光环境下，有时还需加入防腐剂或稳定剂，防止生物大分子变性失活。肝酶分离纯化与鉴定 设计从动物肝组织中分离、提取、纯化、和鉴定一种酶（该酶由不同的亚基组成，为结合酶，pI=6.2）的技术路线，并说明试验各步骤的原理相关问题 亚基亚基：组成蛋白质四级结构最小的共价单位，是指四级结构的蛋白质中具有三级结构的球蛋白 结合酶结合酶：分蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)和辅助因子(cofactor)，辅助因子中含金属离子、小分子化合物 PI：等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液
11、的pH称为该氨基酸的等电点。 取动物肝脏组织制作组织浆液所需蛋白的粗提蛋白的纯化活性的检验凝胶电泳鉴定提取纯度实验主要流程实验主要流程取动物肝脏组织 材料选择。选取新鲜的，饥饿24小时的动物的肝脏，生理盐水多次洗涤，低温保存。制作组织浆液取新鲜动物肝脏剪碎取新鲜动物肝脏剪碎冰放进培养皿中冰放进培养皿中移入匀浆器过滤匀浆液为减低研磨或匀浆过程中发热，所用器皿和溶液需要预冷蛋白质的粗提原 理 中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电层和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。（但沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度不同。例如，50饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33饱和的硫酸铵则使-球蛋白沉淀。）因
12、此，可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。 加磷酸缓冲溶液、再加硫酸铵饱和溶液。要在搅拌下缓慢匀少量多次地加入尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离。匀浆液+药品混匀转移离心粗蛋白 等电点沉淀技术等电点沉淀技术 许多蛋白质在其等电点（许多蛋白质在其等电点（pI）处净电荷为）处净电荷为零，溶解零，溶解 度最低，可以沉淀出来。故选用度最低，可以沉淀出来。故选用适当的缓冲液，调节适当的缓冲液，调节pH，可将目的物以沉，可将目的物以沉淀状态分离，再重新溶于适当的缓冲液，淀状态分离，再重新溶于适当的缓冲液，以供进一步纯以供进一步纯
13、可尝试调配可尝试调配pi=6.2 ，沉淀所需蛋白。，沉淀所需蛋白。蛋白的纯化 层析：层析： 离子交换层析：定相是具有固定电荷的离子交换剂，离子交换层析：定相是具有固定电荷的离子交换剂，动相是具有不同动相是具有不同PH值和离子强度的溶液值和离子强度的溶液 凝胶层析：又称凝胶过滤、分子筛层析、凝胶渗透层凝胶层析：又称凝胶过滤、分子筛层析、凝胶渗透层析等。主要是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效析等。主要是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应不同而进行分离的。应不同而进行分离的。 吸附层析：主要根据物质对活性固体表面吸附亲和力吸附层析：主要根据物质对活性固体表面吸附亲和力的差异来分离。的差异来分离。 分配层析：是根据素质在定相中溶解度的差异或在分配层析：是根据素质在定相中溶解度的差异或在定相和动相中溶解度的差异来进行分离的定相和动相中溶解度的差异来进行分离的 亲和层析：是根据生物大分子的生物特异性吸附来进亲和层析：是根据生物大分子的生物特异性吸附来进行分离的。行分离的。粗蛋白纯化蛋白活性的检验 根据不同的蛋白酶的不同结构，有相对的药品进行检验，造成颜色反应等。 如谷丙转氨酶加丙氨酸和a-酮戊二酸，生成丙酮酸和谷氨酸，再加显色剂2，4-二硝基苯肼生成丙酮酸二硝基苯肼，用比色法，可计算其活性。纯化蛋白标准蛋白SDS凝胶电泳根据与标准蛋白的比对鉴定出蛋白