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1、生物技术实验心得体会 生物技术试验心得体会 基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深化分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得 、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 可概括为分、切、连、转、选。“分”是指分别制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特别的方法将重组的D
2、NA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中选择出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制实力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 一.目的基因的获得 目的基因是指所要探讨或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分别自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选 PCR方法 PCR 是一种在
3、体外快速扩增特定基因或DNA。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延长等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以快速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分别、克隆和核酸序列分析等基础探讨，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。 化学合成法制备基因片段 采纳DNA合成仪，对目的基因进行分段合成，然后进行连接，可以得到所需的目的基因。 二、重组质粒的构建 DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以便下一步转化之用。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下
4、，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。连接反应的温度在37时 1 有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此实行折中的温度，即1216，连接1216h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 三、重组分子的扩增和鉴定 重组DNA分子导入受体细胞 目的基因和载体在体外连接形成重组DNA分子后，须要被导入受体细胞中才能进行增殖和（或）表达。受体细胞是重组基因增殖的场所，所以对受体细胞也应具有几点要求：简单接纳重组DNA分子；对载体的复制扩增无严格限制；不存在特异的能降解外源DNA的内切酶
5、体；不对外源DNA进行修饰。一般将重组DNA分子导入原核细胞的过程称为转化，而导入真核细胞的过程称为转染。将重组DNA分子和感受态大肠杆菌细胞相混合，使重组DNA分子进入大肠杆菌中，就可以实现重组DNA分子的转化。 重组DNA分子的鉴定 重组DNA分子导入受体细胞后是否得到扩增，扩增后的重组DNA分子是否正确，导入的重组DNA分子是否含有正确的插入片段，重组DNA分子能否表达插入的目的基因，一般可以采纳X-gal筛选的方法对重组DNA分子进行鉴定。 四、试验中的留意事项 1、大肠杆菌液体培育基和固体筛选培育基制备： 1) 接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧灭菌。 2) 培育基、橡胶
6、制品、塑料制品等不能运用干热灭菌。 3) 在加热过程中应不断搅拌，以防琼脂粉沉淀糊底烧焦，并应限制火力，以免培育基起泡而溢出容器。 4) 留意培育基分装时避开其沾污三角瓶口、试管口。 5) 严格根据高压蒸汽灭菌的灭菌指标（温度、压力、时间）对培育基、器皿灭菌，确保灭菌彻底。 2、大肠杆菌工程菌平板培育： 1) 划线分别时，挑菌量要小，严格无菌操作，避开环境中的杂菌污染。 2) 画线时接中环圈内不能有菌膜产生，会造成接种数过多，结果不明显。 3、PCR扩增目的基因片段： 1) PCR体系所加成分的实际用量，应依据试验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液浓度进行核算。 2 2) 加样时要仔细,吸
7、头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避开污染。 3) Taq聚合酶（置于冰盒上）应最终加入，尽量削减室温接触机会。加酶时吸头深化不行过深，酶量不能过多。 4、回收目的基因与载体连接： 1) 留意调转速 2) 放开管盖放置 3) 向吸附膜中间位置悬空滴加30ul洗脱缓冲液TE（洗脱缓冲液TE需运用前60水浴预热） 4) 盖好管盖，静置10min 5、大肠杆菌液体培育: 1) 接种环节应严格进行无菌操作。 2) 试验中要留意细菌的生长状态和密度，尽量运用对数生长期的细胞。密度过高或不足均会使转化率下降。菌体密度与震荡培育的转速亲密相关，依据测定的菌
8、液OD值调整培育时间。 3) 接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明菌种、日期、组别、姓名等。 6、大肠杆菌感受态细胞制备及转化: 1) 全部操作均应在无菌条件和冰上进行。 2) 所运用的器皿必需经过灭菌。并且要防止迹量的去污剂或其它化学物质、杂菌、DNA酶或杂DNA所污染，否则会大大降低细菌的转化效率。 3) 留意转化的质粒 DNA 的质量和浓度。当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。 4) 试验所用的溶液最好用3次蒸馏水配制。 7、筛选重组转化菌落: 1) 在含有X-gal和IPTG的
9、筛选培育基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37培育后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。不是一起先就4，是等菌长出来之后。一般菌长出来就会有蓝色的了，4之后会进一步显色。 3 2) 当出现蓝斑较大，白斑很小附在四周，还有蓝白镶嵌的斑即卫星菌落的时候，可以当心挑取中间的那个菌落，有可能是阳性克隆。 3) 要留意培育时间不宜过长，出现阳性菌落就刚好处理，以12-16小时为宜。 4) 培育基中加抗生素的时候，温度不能高了，不烫手为宜，防止抗生素失效。 8、菌液PCR分析: 留意移液枪正确的运用方法，各种量程的调试，一般以接近最大量
10、程的为准。 9、取大肠杆菌重组质粒DNA和酶切分析 1) 质粒小量提取试剂盒进行质粒的提取的第三步和第四步之间的时间，操作要流畅快速，确定了试验成败 2) 禁止吸出沉淀 五、总结 在分子生物学中，基因克隆是一种常用的技术。其中关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入肯定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，变更生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。 基因工程是把双刃剑。假如不加节制的运用基因工程，让它去为你包治百病，那样你
11、的整体免疫系统也将发生错乱，让你完全可以抵抗的疾病访问造成你的死亡。假如人们想造什么动物就造什么动物，让这些动物急速的泛滥，动物的天敌关系，人类的生态平衡都将被破坏，动物也将超过人类，霸占我们赖以生存的地球。而且，若是谁都想起死回生，我想终有一天我们将因为人口泛滥而灭亡。 基因工程学问一种让科技发展的手段，而不是我们的目的，我们要遵循自然规律，正确的对待基因工程，正确的对待生活。 生物技术试验心得体会 生物技术实习心得体会 生物技术试验心得 现代生物技术导论学习心得体会 生物试验心得体会 生物试验心得体会 生物试验心得体会作文 生物试验培训心得体会 生物试验心得体会2 园艺植物生物技术试验教案 本文来源：网络收集与整理，如有侵权，请联系作者删除，谢谢！第9页 共9页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页