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1、|Illlll JllFllllllllllrllllllllllll1lllllllllY321 7028分类号一II DC密毁盐一开暑囊；l产篝硕士研究生学位论文基于甜菜序列信息的SSR分子标记开发与应用研究申请人：学 号：培养单位：学科专业：研究方向：指导教师：完成日期：徐杰2141368农作物研究院作物遗传育种作物生物技术与分子生物学陈丽研究员2017年5月万方数据分类号U D C密级公丹一舅务庐夕擎硕士研究生学位论文基于甜菜序列信息的SSR分子标记开发与应用研究申请人：学 号：培养单位：学科专业：研究方向：指导教师：完成日期：徐杰2141368农作物研究院作物遗传育种作物生物技术与分
2、子生物学陈丽研究员2017年5月万方数据中文摘要甜菜是我国北方主要的糖料作物。甜菜生长周期长、容易发生杂交，因此种质保存鉴定难度较大，性状检测周期长、效率低，传统的甜菜育种方法既耗时又费力。分子标记准确、高效，不受生长环境、发育阶段、实验条件等因素的影响，在甜菜育种及种质资源开发利用中均有重要作用。在众多类型的分子标记中，SSR标记的检测准确性和重复性都比较高，更适合进行性状评价、遗传作图等对准确性要求较高的研究，然而，我国目前已开发的甜菜SSR分子标记还比较少，许多研究还需要使用无物种特异性的标记。SSR分子标记的缺乏严重制约着相关研究的开展。本研究利用课题组前期收集的甜菜序列信息，采用生物
3、信息学手段高通量地挖掘SSR分子标记位点，再通过质量筛选与多态性筛选等实验进行候选标记的开发，获得新的甜菜候选SSR标记作为标记材料；再以课题组已建立的分离群体为材料，将所开发的候选标记应用于BSA分析，筛选出有希望与雄蕊育性连锁的SSR标记。通过本研究，将获得新的甜菜标记材料，并有望通过进一步验证获得与育性连锁的SSR分子标记，为种质资源评价、分子标记辅助育种等相关研究奠定基础。主要研究成果如下：(1)课题组己利用数据库搜索法得到甜菜EST序列29857条，GSS序列89519条，通过高通量RNA测序得到转录组序列55782条，其中未以EST形式报道的转录组序列37447条。对3个数据库中的
4、SSR引物进行开发，共挖掘甜菜的SSR位点约一万个，其中成功设计引物的有效EST-SSR位点1200个，GSSSSR位点2459个，RNASSR位点2344个。(2)随机选取其中800个位点合成引物进行质量筛选，得到272对优质引物；用6份远缘种质对优质引物进行多态性筛选，保留PIC值大于024的引物，一共得到119个候选标记，并经复筛得到68个适用于分离群体的候选标记。(3)将所得候选标记应用于BSA分析，利用课题组所构建的F2分离群体，筛万方数据黑龙江大学硕士学位论文选与雄蕊育性相关的标记，共得到8个有望与育性关联的SSR标记；用60个分离世代个体对标记与性状的关联性进行验证，其中有5个重
5、组率小于50，有望与育性连锁的标记。关键词：甜菜；SSR；候选标记；雄蕊育性；BSA万方数据AbstractAbstractSugar beet(Beta Vulgaris L)is the main sugar crop in northern ChinaSugar beethas long growth cycle(usually two years)and is prone to cross，SO germplasmidentification is difficult，with long trait detection cycle and low efficiencyTherefore
6、，the traditional breeding methods consume a lot of labor and material resourcesMolecular marker technology is accurate and efficient，above all，it isnt affected bygrowth environment，developmental stage and experimental conditionsSo it plays animportant role in both breeding and the development and ut
7、ilization of germplasmresourcesAmong types of molecular markers，simple sequence repeat(SSR)markerhas high accuracy and reproducibility,which is more suitable for the Study of traitevaluation，genetic mapping and SO onHowever,both quality and quantity of molecularmarkers of sugar beet in domestic rema
8、in relatively poor,SSR molecular markers havenot been widely developed，SO that many studies rely on the use of markers that are notspeciesspecificThe lack of SSR molecular marker are severely restricting thedevelopment of related researchIn this study,SSR sites were high-throughput mined with bioinf
9、ormatics tools fromthe sugar beet sequences collected previously by the research groupVia experimentalvalidation and screening，candidate SSR markers were obtainedThese candidate SSRmarkers were screened with bulked segregation analysis(BSA)to find utilizable，stamen fertilityrelated markers，with the
10、segregation population constructed previouslyby the research grou p as plant materialThrough this study,we will obtain the new SSR candidate markers，which haveindependent intellectual property rights；and it is promising to obtain SSR molecularmarkers that linked to fertilityThese results will lay th
11、e foundation for the relatedresearch on both germplasm resoulce evaluation and molecular marker assistedbreedi ngMain research resu lts：(1)29857 EST sequences and 895 1 9 GSS sequences were obtained by databasesealching method55782 transcript sequences(37447 unleported as EST)were obtainedby highthr
12、oughput RNA sequencing with germplasm DP02Ovel1 0，000 SSR sites万方数据黑龙江大学硕士学位论文were developed fiom all the three databases，and the effective sites which succeeded inprimer designing were：EST-SSR 1 200 sites，GSSSSR 2459 sites，RNASSR 2344 sites，respectively(2)A total of 272 pairs of high quality primer
13、s were screened out of 800 randomprimer pairsPolymorphism among six germplasms with distant phylogeneticrelationship were investigated，and 1 1 9 candidate markers were recognized，whichperformed polymorphism information contents(PIC)greater than 024Finally，68candidate markers were found appropriate t
14、o our F2 population and were utilized in thefollowing work(3)These 68 candidate markers were utilized in BSA with F2 populationconstructed previouslyEight SSR markers exhibited association with stamen fertilityWhile genotyping 60 F2 individuals，five SSR markers performed possible linkage withthe fer
15、tility trait，the recombination rates were less than 50Key words：sugar beet；simple sequence repeat(ssR)；candidate marker；stamenfertility；bulked segregation analysis(BSA)IV万方数据目录目 录中文摘要IAbstractIII目 录V第1章绪论一111本研究的背景、目的与意义一1111研究背景1112研究目的与意义一112国内外研究进展2121分子标记概念一2122分子标记的种类及其特点一2-123分子标记在甜菜上的应用一5一124
16、用生物信息学方法挖掘甜菜序列库中分子标记位点8125 BSA在性状关联标记开发中的应用一1013技术路线一1 1第2章材料与方法一1 221试验材料一l 2-211植物材料一1 2212数据与软件一1 2213试剂与仪器一1 222试验方法一1 2-221序列信息的获得一12222序列格式处理与序列库构建一l 3223标记位点挖掘与引物设计一1 3224基因组DNA的制备一14一V万方数据黑龙江大学硕士学位论文225候选标记的筛选-1 5-226性状相关候选标记的筛选o一15-第3章结果与分析1 831序列信息收集与处理-1832位点挖掘与引物设计1 833基因组DNA的制备一2034候选标记
17、的筛选20341标记的质量筛选。20342标记的多态性筛选2l-35候选标记的性状关联。22351候选标记的复筛：一22。352性状相关标记的筛选23353育性相关标记的验证24。第4章讨论一3041序列来源与应用价值一3042高通量位点挖掘与候选标记准确筛选的平衡30。43高通量方案进行标记开发与应用的效果3044甜菜分子标记开发与应用的制约因素一31一第5章结论一32一参考文献33致谢一42一攻读学位期间发表论文43独创性声明一44VI万方数据第1章绪论第1章绪论11本研究的背景、目的与意义111研究背景甜菜是世界两大糖料作物之一，是重要的经济作物，也是我国北方主要的糖料作物。由于我国不是
18、甜菜的起源国，导致育种材料的选择受到了一定限制；传统育种方法效率低，周期长，既费时又费力；继形态学标记、生化免疫遗传标记和细胞遗传标记后，分子标记逐渐发展成为一种新的遗传标记技术，分子标记技术以其不受生长环境、实验条件等因素的影响，分析既准确又高效的优势而倍受育种家们青睐：利用分子标记技术辅助作物遗传育种俨然成为一种新手段，然而甜菜分子标记的研究远远落后于模式植物，我国的甜菜分子标记数量和种类均较少，大多数研究还依赖于无物种间特异性的分子标记，因此开发足够数量的重复性好、结果稳定的分子标记，是通过分子手段分析甜菜种质遗传多样性与亲缘关系的必要前提：获得与众多目标性状紧密连锁的分子标记，是对甜菜
19、性状进行评价、进行分子标记辅助选择的必要前提。在众多类型的分子标记中，简单序列重复(Simple Sequence Repeat，SSR)具有突出优势，但目前可利用的甜菜SSR标记数量很少，开发难度较大，随着甜菜基因组测序工作的完成以及生物信息学的不断发展，使得应用生物信息学手段开发基于序列资源的标记更加便捷。集团分离分析法(Bulked Segregation Analysis，BSA)不但可以克服很多作物难以得到近等基因系的限制，而且适合从多个候选标记中筛选与目标性状相关的标记，可以大大提高前期工作的效率。112研究目的与意义课题组前期己通过RNA测序与数据库检索建立了甜菜序列库，本研究通
20、过生物信息学手段对序列库进行SSR标记位点的挖掘和候选标记的开发，筛选出质量优良、多态性明显的标记，作为甜菜的候选SSR标记，然后利用课题组建立的分离群体，根据BSA分析法的原理找到有望与育性连锁的分子标记，再利用分离世代(F2)个体对标记与育性的关联性进行验证，筛选出可应用于育性检测的分子标记，万方数据黑龙江大学硕士学位论文用于后续的甜菜遗传育种研究。通过本研究，将获得新的甜菜候选SSR标记，且有望获得与育性相关联的SSR分子标记，为种质资源评价、分子标记辅助育种等相关研究奠定基础。12国内外研究进展121分子标记概念分子标记是指能反映生物个体或种群问基因组中某种差异的特异性DNA片段。因为
21、分子标记的本质是DNA序列，所以其突出优势是不受条件、环境等外界因素的干扰，而且其遍布整个基因组，多态性高，许多标记还具有共显性的特点【1】。目前常用的分子标记主要有RFLP、RAPD、SCAR、ALFP、STS、CAPS、SSR等。122分子标记的种类及其特点1221限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，I强LP)RFLP是最早发展起来并具有代表性的分子标记技术，由Grozdieker等人在1974年创立，1980年Botstein利用该技术成功构建了遗传图谱。I强LP是一种用于检测生物个体间差异的分子标记技术，其技术原理是对
22、限制性内切酶酶切后的特定DNA片段的大小进行检测【2】【3】。该技术具有信息完整、稳定性好、重复性好、共显性等优点；但是工作量大，实验过程繁杂，需要的DNA量大，并且十分费力耗时，因此，RFLP技术的广泛应用受到了很大限制。1222随机扩增多态I生DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)1990年Williams等人创立了RAPD，该技术引物通常是一个具有10 bp大小的随机寡核苷酸序列，利用PCR技术对基因组DNA进行随机的扩增，但是由于大量的反向重复序列分布在整个基因组中，因此需要单独对每一对随机引物进行PCR扩增，再经凝胶电泳进行检测，通过EB
23、染色或者放射自显影技术，进行多态性观察。与RFLP相比，此方法简单、迅速、灵敏度高，所需要DNA量较少，对DNA质量要求也不高，不需要接触放射性物质，很安全。但RAPD的不足之处主要是该标记一般表现为显性遗传，不能有效地将纯和显性和杂合基因型区分开来，因而提供的信息量不完整。另外，由于使用的引物较短，该标J,gPCR过程容易受实验条件的影响，万方数据第1章绪论重复性与稳定性均较差，因而很少被使用【4】。1223特异序列扩增区域(Sequence Characterized Amplified Regions，SCAR)该标记通常是由RAPD转化而来，由Paran(1993)等提出。为了使得到的
24、RAPD标记在应用上的稳定性得到提高，可从凝胶上回收该RAPD标记，并进行克隆和测序，然后根据碱基序列，设计一对大小为18-24 bp的特异引物，再以基因组DNA为模板进行PCR扩增，便可得到目的条带，这种经过转化的DNA分子标记称为SCAR标记。1224扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)AFLP是荷兰科学家Zabeau M和Vos P于1992年发明的一种DNA标记技术。得益于PCR的可靠性和RFLP的准确性，使得AFLP技术可以快速检测到大量片段，从而得到带谱信息。AFLP具有准确性高、重复性好、共显性、稳定性好、多
25、态性丰富、操作简便、DNA用量少、覆盖整个基因组及无需预知序列信息等优点。但由于AFLP操作繁杂、难度较大，需要使用同位素或非同位素标记引物，而且相对比较昂贵费时，一般实验室里难以完成；除此之外，AFLP也存在其它缺陷，如对模板反应迟钝，谱带有可能发生错配与缺失，对技术要求高等，这些不足使AFLP的应用受到了很大的p艮带lJts6。1225序列标签位点(Sequence Tagged Sites，STS)STS是根据单拷贝的DNA片段的两端序列设计引物进行PCR扩增而产生的特异序列。STS标记所采用的引物长度与常规PCR所用的引物长度相同，因此，分析结果可靠稳定。STS标记为共显性遗传，容易在
26、不同组合的遗传图谱间发生转移，是联络植物物理图谱和遗传图谱的媒介，具有很大的实用价值。但是，STS标记的开发依赖于序列分析与引物设计，成本较高，现在国际上已经建立起相应的STS信息库，以便于各国同行随时调用。1226酶切扩增多态性序歹U(Cleaved Amplified Polymolphism，CAPS)该技术是特异引物PCR与限制性酶切片段相结合而产生的一种DNA标记，实际上是一些特异引物PCR标记(如SCAR和STS)的一种延伸，当特异引物PCR标记的扩增产物没有表现出多态性时，可以采取的补救办法是用限制性内切酶对万方数据黑龙江大学硕士学位论文扩增产物继续进行酶切，然后再通过电泳进行检
27、测，分析其多态性。该技术的优点是操作简单快捷、自动化程度高：引物与限制性内切酶组合非常多，在一定程度上提高了揭示多态性的机率；在真核生物中，该标记呈共显性；所需DNA量少，结果稳定可靠。在二倍体植物研究中CAPS标记可发挥巨大的作用，是基于PCR标记的有力补充，另外，CAPS标记实验过程中需要使用限制性内切酶，从而大大的增加了研究成本，限制了该技术的广泛应用。1227简单重复序歹lJ(Simple Sequence Repeat，SSR)1991年Moore等创立SSR分子标记技术【7】。根据SSR两端保守序列设计引物，然后利用PCR技术进行扩增，再通过电泳检测其产物长度多态性，即SSR分子标
28、记技术。在真核生物基因组中，微卫星约占真核基因组的5，它们既存在于内含子中又存在于外显子中，也可位于Alu序列(反向重复序列)中。其基本构成单元一般为18 bp，多分布于编码区附近。在不同的真核或是原核生物体间，由于SSR重复单元、数量、次数、大小、序列和拷贝数的不同而形成丰富的SSR位点的多态性，更甚的是由于SSR序列的重复次数变化较大，SSR标记与其它DNA标记相比较具有更高和更丰富的多态性【8】。SSR分子标记优点：(1)SSR标记信息数量丰富，遍布于整个基因组且分布均匀，相对于其他分子标记技术，SSR既有RFLP分子标记的稳定性与共显性，又有比RAPD、SNP等分子标记成本低、技术简单
29、的优点，是目前常用的分子标记技术【9】。然而由于SSR引物能够直接从已经发表文献资料或是查找近缘种SSR引物中来获得，也可以使用经典分子生物学方法一克隆技术来获得，可节约大量的时间与精力。(2)SSR分子标记检测手段简单，迅速而且规模小，可进行非破坏性取样并且可以在无放射性实验室中进行。(3)SSR标记的重现性好，方便进行数据比对。(4)一个SSR等位位点一般包括几个甚至多个等位基因，在品种间具有广泛的位点变异，因此具有高度多态性，适合于分子遗传学方面的研究。(5)呈孟德尔共显性遗传，能够检测出纯合子个体、杂合子个体，这为遗传学相关科学研究提供了更多可以用于个体鉴定的信息。(6)如果SSR分子
30、标记采用以PCR技术为主而进行检测的话，只需取少量的DNA样品，即使样品有部分降解也可以进行分析。简万方数据第1章绪论而言之，通过简单的PCR扩增即可直接将已知的特定的染色体位点检测到，这是微卫星的最大优点101 I】。123分子标记在甜菜上的应用甜菜(Beta Vulgaris L)是三十万高等作物之一，属于藜科甜菜属，是两年生作物，甜菜第一年以营养生长为主，在根部积累大量营养物质，第二年则以生殖生长为主，通过抽薹开花形成种子。甜菜是我国北方主要的糖料作物，全国的蔗糖产量中有35由甜菜提供。甜菜大部分种质自交不亲和，且容易发生杂交，种质资源鉴定与保存难度较大，对育种时亲本的选择也造成障碍；甜
31、菜生长周期较长，因此性状检测周期长、工作量大，且检测结果受环境影响较大。分子标记可在基因组水平上准确、高效地进行分析，不受生长环境、发育阶段、实验条件等因素的干扰，是种质资源鉴定、亲缘关系分析、性状评价、亲本及后代选择等研究的有效辅助手段，在甜菜育种及种质资源开发利用中均有重要作用。MAS就是利用与目的基因紧密连锁的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，进而达到减少连锁累赘，得到期望个体，提高育种效率的目的【12】。Lee等(1995)、Lande等(1990)并1：I Xie(1998)等的研究证明了MAS可以大大提高作物育种效率B3。15】。国外目前已经有将分子标记技术应用于甜菜
32、遗传图谱的构建、QTL定位、目的基因的克隆等报道，如1996年NCBI上公布2条信息：Hallden利用RFLP标记技术构建了甜菜遗传图谱，长620 cM；Micthell Mc Gmth也利用RFLP标记技术构建了长5264 cM的图谱16】；Shen等利用RAPD标记技术对26份野生甜菜种质进行了遗传多样性检测，研究结果表明，RAPD标记能快速有效地鉴定甜菜亲缘关系【17】；Baren E利用RFLP、RAPD标记构建包含50个RAPD位点和248个RFLP位点的甜菜遗传连锁图谱，定位了抗丛根病基因Rrl，控制下胚轴颜色的基因R以及控制单胚性状的基因M【18】；Setiawan等利用QTL
33、作图，将抗褐斑病的位点定位在甜菜3、4、7和9号染色体上【19】；Gidner等于2005年通过AFLP技术利用抗甜菜丛根病的资源WB41制作QTL图，发现了位于甜菜第3条染色体上新的抗丛根病基因Rz3120；G Jimmer M等于2007年利用RAPD、SNP以及AFLP技术找到了另一个也位于甜菜第3条染色体上抗丛根病基因Rz4；2008年GlimrnelM等人万方数据黑龙江大学硕士学位论文从1个新的抗甜菜丛根病材料WB258中发现了新的抗丛根病基因Rz512U221；Janssen等人利用AFLP技术，发现了甜菜的白粉病单基因抗性位点23】；Me Grath JM等第一次以食用甜菜和糖甜
34、菜杂交后代为作图群体，构建甜菜的遗传连锁图谱，共使用F2个体128株，AFLP及SSR标记共331个，图谱共长5263 cM，覆盖甜菜9个连锁群【24】；Gunnar Jacobs等应用RFLP技术将甜菜抽薹基因B定位于第二条染色体的中心区域【25】；Desplanque等将来自法国不同地区的54个种群中300个甜菜种质利用SSR技术进行了遗传多态性分析，研究结果表明野生甜菜的遗传多态性显著高于栽培甜菜261；Marinus等开发了25个新的甜菜SSR标记，筛选出多态性好的12个SSR标记用来区分40个二倍体和三倍体品种，每个品种选30个植株进行基因分型，这些标记被扩增出3-21个不同的等位基
35、因，有的品种一个标记位点多达7个不同等位基因【27】；Honma Y等利用BSA分析法筛选出与甜菜育性恢复基因Rf2连锁的AFLP标记，并将育性恢复基因Rf2定位在连锁图谱上【28】，Adetunji等以233株精品甜菜和91株野生甜菜为材料，分别使用459个和418个SNP标记对其进行了遗传多样性和连锁不平衡分析【29】；Laurent V等在甜菜的19709条EST序列中挖掘出了803个ESTSSRs，对这些位点进行了比较分析，并利用92株F2个体绘制了一个覆盖9个连锁群的高密度遗传图谱，该图谱包含284个SSR标记，长度555 cM，平均每22 cM就有一个标记出现301。我国的甜菜遗传
36、育种事业无论是基础性的研究还是分子标记辅助育种方面都要落后于国外，国内的分子标记在甜菜中的研究主要集中在体系的优化、亲缘关系分析和遗传多样性分析的研究上，如路运才采用RAPD标记技术对供试甜菜品种及其亲本进行RAPD扩增，结果表明，中国甜菜多倍体品种资源遗传多样性丰富，而甜研系列品种骨干亲本的亲缘关系较近；吴旭红利用RAPD、SSR、ISSR标记技术与BSA相结合的方法，分别获得了3个RAPD标记、一个ISSR标记与甜菜的抗丛根病基因紧密连锁32；并于2005年用同样的方法获得与甜菜抗根腐病基因连锁的ISSR标记0PP0760，此标记可用作抗根腐病基因的分子辅助选择的依据33】；2008年王华
37、忠等利用SRAP标记和SSR标记相结合的方法对来自国内外的49份甜菜供试材料进行了遗传多样性分析，研究表明，不同国内外供试材料万方数据第1章绪论的遗传基础差异较大，中国甜菜品种间亲缘关系较近，遗传基础较窄【34】；沙红等于2010年利用RAPD和SSR标记技术，以63个F2单株为作图群体，构建了覆盖7个连锁群，长41 89 cM的甜菜遗传图谱161；2012年李博利用SSR和SRAP技术，对甜菜作图群体进行多态性研究，并构建了包含1 12个标记位点，长度为1 13989cM分子连锁图谱351；腊萍用RAPD标记技术对38个来源不同的甜菜品种进行遗传差异分析，结果表明，来源相同的多数品种间的亲缘
38、关系较近361；王茂芊用SRAP标记技术对来自三大不同甜菜产区的250份材料进行遗传多样性分析，结果表明，在遗传基础或基因来源上，东北与华北、西北产区的材料较远，西北产区与华北产区的材料较近，并在遗传距离020 cM处将材料分为4个类群【37】；杨文柱建立了适用于甜菜种质资源鉴定的PCR反应体系，并对57份甜菜材料进行聚类分析【381；2013年吴则东以黑龙江、新疆、内蒙古及甜菜主产区的14份国产甜菜品种为材料，利用SSR分子标记技术首次构建了国产主要甜菜品种的DNA指纹图谱39】；并利用SSR分子标记技术对来自德国的11个甜菜品种进行了指纹图谱的构建，仅需用4对SSR引物即可区分开这11个品
39、幂Oo40l，并于同年建立了46个栽培甜菜品种的SSR指纹图谱并进行了遗传多样性分析【4l】；牛泽如等通过基因组步移技术，建立了用于分离甜菜基因组微卫星引物的新方法，获得了多态性较高的SSR引物，为甜菜遗传多样性分析及遗传连锁图谱的构建提供了有力工且【a21，王良利用甜菜的种类、农艺性状等与SSR标记相结合的方法进行聚类分析，结果将96份供试甜菜材料分成A、B、C、D 4类【43】。在种质资源鉴定中SRAP标记也有很高的利用价值；例如吴则东等以12份国外甜菜品种为实验材料，从546对SRAP引物中筛选出23对可用于甜菜品种鉴定的SRAP核心引物45】。在众多类型的分子标记中，SSR标记的检测准
40、确性和重复性都比较高，更适合进行性状评价、遗传作图等对准确性要求较高的研究4648】，然而，我国目前已开发的甜菜SSR分子标记还比较少，可利用的核心引物更是有限，许多研究还需要使用无物种特异性的分子标记，SSR分子标记的缺乏严重制约着相关研究的开展。传统的标记开发方法分为2类，一类是直接构建基因组文库或cDNA文库，然后根据待开发标记的序列特征，通过PCR、原位杂交、测序等技术挖掘其中的万方数据黑龙江大学硕士学位论文标记位点；另一类是在无物种特异性分子标记的基础上，通过分子杂交、PCR、酶切等手段分离标记位点附近的基因组片段，获得该片段的序列信息，再设计PCR引物，将该位点转化成物种特异性的分
41、子标记，即SCAR标记491。这些方法虽然可以获得物种特异性的分子标记，但需要进行大量的前期工作，如文库构建、分子杂交、测序等，使标记开发前期的工作量较大，周期较长。SSR分子标记具有明显的序列特征【50-5I】，因此，利用生物信息学手段对已知序列进行分析，可高通量地寻找具有分子标记特征的序列，挖掘潜在的标记位点，从而大大减少标记开发前期的工作量，提高标记开发效率【52】。如今生物信息学已经发展成为一门较成熟的边缘学科，对序列进行高通量分析的工具越来越多，功能也日趋完善，其中用于分子标记位点挖掘的生物信息学工具已有二十余种【5357】。已有多种作物借助生物信息学手段挖掘并成功开发出了分子标记，
42、包括大豆、水稻、甘蔗、小麦、大麦、黑麦【58-64】、及一些经济作物和牧草【6568】。应用生物信息学工具，高通量挖掘分子标记位点，已成为分子标记开发的一种新方法。其中，用于从EST序列中开发SSR位点的MISA工具已在多个物种中得到了比较广泛的应用，包括李属植物、红麻、赤松、硬粒小麦、菊花、青蒿【6977】等。124用生物信息学方法挖掘甜菜序列库中分子标记位点近年来，对于植物遗传育种的研究，分子标记技术的应用起到了很大作用。其应用涉及到定位重要性状基因或QTL、构建遗传图谱、确定种质遗传关系、划分杂种优势群、比对图谱分析、分子标记辅助育种及基因克隆等多个领域。随着表达序列标签的应用发展，以及
43、水稻等相关模式作物中基因组和全长eDNA的克隆，已有很多DNA序列信息储存在公共数据库中。此外，花生、水稻、甜菜等基因组测序工作的完成以及部分生物基因组测序工作的相继展开，为应用生物信息学手段挖掘分子标记提供了大量、方便、快捷、有益的信息。近几年来，随着生物信息学的不断发展，使得基于序列资源的标记开发更加便捷，各种基于生物信息学的分子标记技术的应用为后续分子标记的发展奠定了良好基础【78】。(1)SSR Finder汤继凤等构建的SSR分子标记开发体系包括自行编制的eSSR标记发掘程序SSR Finder，设计引物常用的程序DNA star和Plimet3，图形显示万方数据第1章绪论程序Jge
44、ne Map以及遗传定位程序Map Maker。总结以往SSR分子标记开发的经验教训，编写了程序SSR Finder，该程序的优势在于既可以从大量的EST序列中挖掘出cSSR位点，又能对得到的位点进行精确地统计和分析。应用该体系已从小麦的37270条EST序列中挖掘了875个复合型SSR(compound SSR)和1228个精确SSR(perfect SSR)；根据1228个精确SSR标记序列成功设计了597对引物，其中有效扩增引物478对，并在小麦遗传图谱上定位了66个标记【79】。(2)SSR MINING 10孙佳莹等研制出利用生物信息学方法通过分析EST序列来开发SSR标记的有力工具
45、：SSR MINING 1O：并对当时在NCBI上公布的大豆的22161条EST序列，进行SSR标记检索，共得到2068个SSR标记，随机选取30个标记，应用DNAMAN进行引物设计，并验证，最终获得14个具有多态性的SSR标记【80】。(3)SSR Locator 201 1年Victoria等利用SSR Locator软件从藻类、苔藓、单、双子叶植物等11个模式植物的非冗余EST数据库中，挖掘了13133个SSR标记，结果显示，在较低等植物中，如绿色藻类和苔藓，SSR标记多以二聚体形式出现；在较高等植物中，如单子叶植物和双子叶植物，多以三聚体形式出现；此研究也证明了利用SSR Locatoz开发SSR标记的可行性【8I】。(4)SSR IT孙清明等自行构建了一个荔枝果皮发育关键期的cDNA文库，利用SSR IT