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1、食品卫生微生物学指标食品卫生微生物学指标 食品卫生标准食品卫生标准是检验食品卫生状况的依据，包括是检验食品卫生状况的依据，包括感官指标感官指标理化指标理化指标微生物指标微生物指标指通过目视、鼻闻、手摸和口尝检指通过目视、鼻闻、手摸和口尝检查各种食品外观的指标，一般包括查各种食品外观的指标，一般包括色泽、气味、口味和组织状态等。色泽、气味、口味和组织状态等。指食品在原料、生产、加工过程中指食品在原料、生产、加工过程中带入的有害物质以及由于霉变和腐带入的有害物质以及由于霉变和腐败变质而产生的有毒有害物质。败变质而产生的有毒有害物质。目前实际应用的指标菌可以分为以下三种：目前实际应用的指标菌可以分为
2、以下三种：u一、一般卫生状况指标菌，包括菌落总数、一、一般卫生状况指标菌，包括菌落总数、霉菌和酵母菌总数；霉菌和酵母菌总数；u二、粪便污染指标菌，包括大肠菌群、粪大二、粪便污染指标菌，包括大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌、肠菌群、大肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌、霍乱弧菌等；霍乱弧菌等；u三、致病菌，包括金黄色葡萄球菌、链球菌、三、致病菌，包括金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌等。沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌等。 食品卫生标准中的微生物指标食品卫生标准中的微生物指标菌落总数菌落总数菌落总数菌落总数指食品检样经处理，在一定条件下培养后，指食品检样经处理
3、，在一定条件下培养后，所得所得1g食品或食品或1mL食品中或食品中或1cm2食品表面积食品表面积上所含有的细菌菌落总数。上所含有的细菌菌落总数。1.1菌落总数概念和其所指示的卫生意义菌落总数概念和其所指示的卫生意义v一定条件：如需氧情况、营养条件、一定条件：如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间、培养温度和时间等等v不能满足厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中不能满足厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌的生长温的细菌的生长v因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类并不能区分其中细菌的种类
4、 v单位单位菌落形成单位叫做菌落形成单位叫做CFU（colony forming units）菌落总数所指示的食品卫生意义菌落总数所指示的食品卫生意义 ：它可以作为食品被污染程度的标志，一般食它可以作为食品被污染程度的标志，一般食品中菌落总数越多，则表明该食品污染程度越品中菌落总数越多，则表明该食品污染程度越深。深。它可以用来预测食品存放的期限或程度。它可以用来预测食品存放的期限或程度。检测方法与步骤v平板菌落计数法平板菌落计数法v基本操作一般包括：基本操作一般包括： 样品的稀释倾注平皿培养样品的稀释倾注平皿培养48小时小时计数报告。计数报告。 vGB中国国家标准中国国家标准vSN 中国检验检
5、疫行业标准中国检验检疫行业标准vFDA BAM(Bacteriological analytical manual) 美国食品药品管理局细菌学分析手美国食品药品管理局细菌学分析手册册vISO(International Organization for Standardization )国际标准化组织国际标准化组织vAOAC国际分析化学家协会国际分析化学家协会细菌总数的常规检验方法细菌总数的常规检验方法-样品的稀释样品的稀释-倾注平皿倾注平皿-培养培养48（24）小时）小时-计数计数-报告报告稀释平板菌落计数法稀释平板菌落计数法(Plate Counter)操作步骤操作步骤9mL25g或或25
6、mL225mL无菌生无菌生理盐水理盐水1mL10-110-210-310-610-7稀释平板菌落计数法稀释平板菌落计数法稀释液的选择稀释液的选择v样品稀释液主要是样品稀释液主要是灭菌生理盐水灭菌生理盐水，有的采用，有的采用磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（或（或0.1%蛋白胨水蛋白胨水），后者对），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如。如对含盐量较高的食品（如酱油酱油）进行稀）进行稀释，可以采用释，可以采用灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水。 培养温度一般为培养温度一般为37（水产品的培养温度，由于其（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，
7、故多采用生活环境水温较低，故多采用30）培养时间一般为培养时间一般为48h，有些方法只要求，有些方法只要求24h的培养即的培养即可计数可计数培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，后，培养基失重不应超过培养基失重不应超过15 在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（氯化三苯四氮唑（TTC），），培培养后菌落呈红色，易于分别养后菌落呈红色，易于分别 培养条件培养条件平板计数琼脂培养基（PCA）v胰蛋白胨胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉，酵母浸粉2.5g，葡萄，葡
8、萄糖糖1.0g，琼脂，琼脂15.0g，蒸馏水，蒸馏水1000ml，vpH7.00.2,v12115分钟分钟灭菌。灭菌。 若有二个稀释度均在若有二个稀释度均在30300之间时，按国家之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于等于2取平均数，比值大于取平均数，比值大于2则其较小数字（有则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。计数原则计数原则到达规定培养时间，应立即计数。如果不能到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于立即计数，应将平板放置于04，但不得超，但不得
9、超过过24h。中国国家标准中国国家标准GB计数时应选取菌落数在计数时应选取菌落数在30300cfu/g的平板（的平板（SN检验检疫行业标准要检验检疫行业标准要求为求为25250cfu/g）。）。 如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。况计算出的菌落数按估算值报告。若所有稀释度均不在计数区间。如均大于若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。之。如均小于如
10、均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。稀释倍数报告之。如菌落数有的大于如菌落数有的大于300，有的又小于，有的又小于30，但，但均不在均不在30300之间，则应以最接近之间，则应以最接近300或或30的的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。平均菌落数乘以稀释倍数报告之。n不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（数愈低
11、菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。样计数报告的依据。 n当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不计数。
12、如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。代表全平板的菌落数。 n当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于均大于300时），但分布很均匀，可取平板时），但分布很均匀，可取平板的一半或的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。该平板的菌落数。 菌落数的报告菌落数的报告按国家标准方法规定按国家标准方法规定菌落数在菌落数在1100时，按实有数字报告。时，按实有数字报告。如大于
13、如大于100时，则报告前面两位有效数字，第时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。三位数按四舍五入计算。固体检样以克（固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。）报告。 方法优点方法简便，较精确，重复性好。细菌总数的其它检验方法细菌总数的其它检验方法 涂布平板法点滴平板法螺旋平板法：螺旋平板法是由一台机器完成的。 涂布平板法涂布平板法是将营养琼脂制成平板、经是将营养琼脂制成平板、经5012小时或小时或351820小时干燥后，在上面滴加检样稀释液小时干燥后，在上面滴加
14、检样稀释液0.2ml，用，用“L”棒涂布于整个平板的表现，放置约棒涂布于整个平板的表现，放置约10分钟，将平板翻转，放至分钟，将平板翻转，放至36+1温箱内培养温箱内培养242小时，（水产品用小时，（水产品用30C培养培养482小时小时)取出，取出，进行菌落计数，然后乘以进行菌落计数，然后乘以5(由由02ml换算为换算为1ml)，再乘以样品稀释液的倍数，即得每克或每升检样再乘以样品稀释液的倍数，即得每克或每升检样所含菌落数。所含菌落数。涂布法优缺点比常规检验法效果好。因为菌落生长在表比常规检验法效果好。因为菌落生长在表面，便于识别和检查其形态，虽检样中含有面，便于识别和检查其形态，虽检样中含有
15、食品颗粒，也不会发生混淆但是本法取样食品颗粒，也不会发生混淆但是本法取样量比常规检验法少。量比常规检验法少。代表性会受到一定影响。代表性会受到一定影响。点滴平板法 与涂布平板法相似。不同的是点滴平板法只是用标定与涂布平板法相似。不同的是点滴平板法只是用标定好的微量吸管或注射器针头按滴好的微量吸管或注射器针头按滴( (使每滴相当于使每滴相当于0 0025m1)025m1)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域( (预预先在乎板背面用标记笔划成四个区域先在乎板背面用标记笔划成四个区域) )每个区域滴每个区域滴1 1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。滴加后
16、滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。滴加后，将平板放平约，将平板放平约1010分钟，然后翻转平板，如涂布平板分钟，然后翻转平板，如涂布平板法法+ +样移入温箱中，培养样移入温箱中，培养6868小时后进行计数，将所得小时后进行计数，将所得菌落数乘以菌落数乘以40(40(由由0 0025m1025m1换算为换算为1ml)1ml)，再乘以样品的，再乘以样品的稀释倍数，即得每克或每毫升检样所含菌落数。稀释倍数，即得每克或每毫升检样所含菌落数。螺旋平板仪粪便污染指示菌类粪便污染指示菌类理想的指示菌应具备的性能理想的指示菌应具备的性能必须与粪便或病原菌有密切关系。它们正常寄必须与粪便或病原菌有密切关系
17、。它们正常寄居场所应是人或动物的肠道，在正常情况下不应居场所应是人或动物的肠道，在正常情况下不应在一般检样中存在。在一般检样中存在。在普通培养基上易生长，用简单的操作方法即在普通培养基上易生长，用简单的操作方法即能快速和准确地测定出数量。能快速和准确地测定出数量。它们与肠道致病菌应有相同的对外界不良因素它们与肠道致病菌应有相同的对外界不良因素的抵抗力。的抵抗力。大肠菌群大肠菌群粪便污染指示菌之一粪便污染指示菌之一-大肠菌群大肠菌群(coliforms)一、大肠菌群一、大肠菌群(coliforms)的定义的定义二、大肠菌群二、大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示的值（大肠菌群数）所指示的卫生意义
18、卫生意义三、大肠菌群计数方法：国家标准法三、大肠菌群计数方法：国家标准法（一）大肠菌群（一）大肠菌群MPN计数法计数法（二）大肠菌群平板菌落计数法（二）大肠菌群平板菌落计数法大肠菌群大肠菌群大肠菌群大肠菌群(coliforms)的定义的定义具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢的杆菌。氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢的杆菌。包括埃希氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属和克雷包括埃希氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等的一些菌种。伯氏菌属等的一些菌
19、种。分布广泛：土壤、人和动物肠道。分布广泛：土壤、人和动物肠道。大肠菌群大肠菌群MPN值值指每指每1g或或1ml食品检样中大肠菌群最可能数食品检样中大肠菌群最可能数（most probable number）。）。大肠菌群大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示值（大肠菌群数）所指示的卫生意义：的卫生意义：1.它可作为粪便污染食品的指示菌。它可作为粪便污染食品的指示菌。2.它可作为肠道致病菌污染食品可能性的指示菌。它可作为肠道致病菌污染食品可能性的指示菌。样品稀释样品稀释初发酵试验初发酵试验复发酵试验复发酵试验大肠菌群计数方法：国家标准法大肠菌群计数方法：国家标准法方法一方法一-大肠菌群大肠菌群M
20、PN计数法：计数法：不产气不产气产气产气不产气不产气10 倍系列稀释倍系列稀释选择适宜选择适宜3 个连续稀释度的样品匀液，接种个连续稀释度的样品匀液，接种LST 肉汤管肉汤管检检 样样25 g(mL)样品样品+225 mL 稀释液，均质稀释液，均质产气产气BGLB 肉汤肉汤大肠菌群阴性大肠菌群阴性大肠菌群阳性大肠菌群阳性查查MPN 表表报告结果报告结果36 1 48 h 2h36 1 48 h 2h图图 大大肠肠菌菌群群MPN计计数数法法检检验验程程序序样品稀释样品稀释平板计数典型和可疑菌落数平板计数典型和可疑菌落数证实试验证实试验大肠菌群计数方法：国家标准法大肠菌群计数方法：国家标准法方法二
21、方法二-大肠菌群平板计数法：大肠菌群平板计数法：图图 大大肠肠菌菌群群平平板板计计数数法法检检验验程程序序计数典型和可疑菌落计数典型和可疑菌落10 倍系列稀释倍系列稀释选择适宜选择适宜3 个连续稀释度的样品匀液，接种个连续稀释度的样品匀液，接种VRBA 平板平板检检 样样25 g(mL)样品样品+225 mL 稀释液，均质稀释液，均质BGLB肉汤肉汤报告结果报告结果36 1 36 1 18 h 24h24h 48huVRBA结晶紫中性红胆盐琼脂培养基结晶紫中性红胆盐琼脂培养基v成分：蛋白胨成分：蛋白胨7.0g；酵母膏；酵母膏3.0g；乳糖；乳糖10.0g；氯化钠；氯化钠5.0g；胆盐或；胆盐或
22、3号胆盐号胆盐1.5g；中性红；中性红0.03g；结晶紫；结晶紫0.002g；琼；琼脂脂15-18g；蒸馏水；蒸馏水1000mL；pH7.40.1。v制法：将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，制法：将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节调节pH。煮沸。煮沸2min，将培养基冷却至，将培养基冷却至45-50倾注平板。倾注平板。使用前临时制备，不得超过使用前临时制备，不得超过3h。选取菌落数在选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的
23、胆典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。或更大。大肠菌群在大肠菌群在VRBA上的菌落特征上的菌落特征证实试验证实试验从从VRBA 平板上挑取平板上挑取10 个不同类型的典型和个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，肉汤管内，36 1 培养培养24 h48 h，观察产气情况。凡，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。大肠菌群平板计数的报告大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌经最后证实为大肠菌群阳性的试管比
24、例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌）样品中大肠菌群数。例：群数。例：10-4样品稀释液样品稀释液1 mL，在，在VRBA平板上有平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种个接种BGLB肉汤管，证肉汤管，证实有实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。）。乳糖发酵试验乳糖发酵试验分离培养分离培养证实试验证实试验大肠菌群的检测：旧国家标准大肠菌群的检测：旧国家标准-三步法三步法图图 大大肠肠菌菌群群检检验验
25、程程序序被检样品被检样品稀释稀释乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管35 37 ，24 2小时小时不产气不产气产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阴性报告报告伊红美蓝或远藤或麦伊红美蓝或远藤或麦康凯平板任意一种，康凯平板任意一种，35 37 ，18 24小小时时挑可疑菌落挑可疑菌落1-2个同时进行个同时进行革兰氏染色革兰氏染色革兰氏阴性革兰氏阴性无芽孢杆菌无芽孢杆菌革兰氏阳性革兰氏阳性大肠菌群阴性大肠菌群阴性报告报告乳糖发酵管乳糖发酵管35 37 ，24 2小时小时产气产气不产气不产气大肠菌大肠菌群阴性群阴性大肠菌群阳性大肠菌群阳性报告报告报告报告产气实验（伊红美蓝）（伊红美蓝）琼脂培养基原理琼脂培养基原理琼
26、脂培养基中含有的伊红和美蓝染料，琼脂培养基中含有的伊红和美蓝染料，可抑制革兰氏阳性细菌。那些能发酵乳糖的细可抑制革兰氏阳性细菌。那些能发酵乳糖的细菌，能将染料摄入细胞，从而使菌落呈现出紫菌，能将染料摄入细胞，从而使菌落呈现出紫色或边缘无色、中央暗黑色的菌落。色或边缘无色、中央暗黑色的菌落。培养基成分培养基成分肉汤蛋白胨培养基毫升（肉汤蛋白胨培养基毫升（h.），），乳糖溶液毫升，伊红溶液毫升，乳糖溶液毫升，伊红溶液毫升，.美蓝溶液毫升。美蓝溶液毫升。配制方式配制方式将已灭菌的肉汤蛋白胨琼脂培养基熔化将已灭菌的肉汤蛋白胨琼脂培养基熔化以无菌操作加入预先灭菌的乳糖溶液以无菌操作加入预先灭菌的乳糖溶液
27、毫升、伊红溶液毫升及毫升、伊红溶液毫升及.美蓝溶美蓝溶液毫升。液毫升。培养结果观察培养结果观察大肠杆菌的菌落在透射光下呈紫黑色，在反大肠杆菌的菌落在透射光下呈紫黑色，在反射光下常常有一种金属光泽（亮绿色）射光下常常有一种金属光泽（亮绿色）产气杆菌以粘质状菌落丰盛地生长，呈棕色产气杆菌以粘质状菌落丰盛地生长，呈棕色一般肠道致病菌不发酵乳糖，故呈粉红色或一般肠道致病菌不发酵乳糖，故呈粉红色或兰色的菌落兰色的菌落中心黑色或中心黑色或紫红色，有紫红色，有或无绿色金或无绿色金属光泽属光泽粪便污染指示菌之二粪便污染指示菌之二-粪大肠菌群粪大肠菌群（faecal coliforms）或耐热大肠菌群）或耐热大
28、肠菌群首先由首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵乳提出，指的是在高温下发酵乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大耐热大肠菌群肠菌群。大肠菌群包括：粪（便）大肠菌群和非粪（便）大肠菌群包括：粪（便）大肠菌群和非粪（便）大肠菌群。大肠菌群。粪大肠菌群（粪大肠菌群（faecal coliforms）或耐热大肠菌群或耐热大肠菌群粪大肠菌群定义在粪大肠菌群定义在44.5 条件下发酵乳糖产条件下发酵乳糖产酸产气，革兰氏阴性兼性厌氧的小杆菌。包酸产气，革兰氏阴性兼性厌氧的小杆菌。包含绝大部分大肠杆菌，少数肠杆菌和克雷伯含绝大部分大肠杆菌，少数肠杆菌和克雷伯氏菌属
29、的某些品系。氏菌属的某些品系。 粪大肠菌群的检测，除水、贝类、贝类养殖粪大肠菌群的检测，除水、贝类、贝类养殖水在水在44.5进行，其他所有食品都在进行，其他所有食品都在45.5进行。进行。粪便污染指示菌之三粪便污染指示菌之三-大大肠杆菌肠杆菌是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群条件致病菌条件致病菌大肠杆菌，学名为大肠埃希氏菌大肠杆菌，学名为大肠埃希氏菌（ Escherichia coli，E.coli ）大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、酸产气、IMViCIMViC试验（靛基质、试验（靛基质、MR
30、MR、V-PV-P、柠檬酸、柠檬酸盐试验）为盐试验）为+-+-或或-+-+-的细菌。的细菌。与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETECETEC）、致病性）、致病性大肠杆菌（大肠杆菌（EPECEPEC）、出血性大肠杆菌（）、出血性大肠杆菌（EHECEHEC）、）、侵袭性大肠杆菌（侵袭性大肠杆菌（EIECEIEC）、黏附性大肠杆菌）、黏附性大肠杆菌（EAECEAEC）。）。检检 样样 LST肉汤肉汤 LST肉汤管阳性肉汤管阳性 （疑似大肠菌群）（疑似大肠菌群） EC肉汤肉汤 EC肉汤产气管为阳
31、性肉汤产气管为阳性（粪大肠菌群）（粪大肠菌群） 查查MPN表，报告粪大肠表，报告粪大肠菌群菌群MPN/g 阳性管再培养阳性管再培养24hBGLB肉汤管阳性肉汤管阳性 （证实大肠菌群）（证实大肠菌群） 按按BGLB肉汤产气管数，查肉汤产气管数，查MPN表，报告大肠菌群表，报告大肠菌群MPN/g 37，48h37，48h44.5，24h大肠菌群、粪大肠菌大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测群和大肠杆菌的检测黑色菌落移种黑色菌落移种营养琼脂斜面营养琼脂斜面LST肉汤肉汤 IMViC生化试验生化试验 革兰氏染色革兰氏染色 产酸产气产酸产气 +-/-+- 无芽胞无芽胞G-杆菌杆菌大肠杆菌大肠杆菌 按按E
32、C肉汤产气管数，查肉汤产气管数，查MPN表，报告大肠杆菌表，报告大肠杆菌MPN/g EMB平板分离平板分离 37，24h大肠菌群、粪大肠菌大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测群和大肠杆菌的检测菌落总数和大肠菌群菌落总数和大肠菌群MPN的其的其他测定方法他测定方法疏水网膜法（膜过滤法）疏水网膜法（膜过滤法）TTC（2、3、5、氯化三苯四氮唑）氯化三苯四氮唑）显色法显色法DC(去氧胆酸钠去氧胆酸钠)半固体法半固体法纸片法纸片法等等 膜过滤法膜过滤法最适合于检测水样品，也可用于含微量颗最适合于检测水样品，也可用于含微量颗粒少的液体食品。粒少的液体食品。我国饮用水卫生标准：我国饮用水卫生标准： 3 3
33、个大肠菌群个大肠菌群/ /1L饮水饮水 100100个个细菌总数细菌总数/ /1ml饮水饮水水中大肠杆菌的检测方法主要有多管发酵法和水中大肠杆菌的检测方法主要有多管发酵法和滤膜法等。其中，多管发酵法是根据大肠杆菌滤膜法等。其中，多管发酵法是根据大肠杆菌能发酵乳糖并产酸产气，以及革兰氏阴性、无能发酵乳糖并产酸产气，以及革兰氏阴性、无芽孢、在伊红美蓝培养基上菌落呈深紫黑色并芽孢、在伊红美蓝培养基上菌落呈深紫黑色并具有金属光泽等特性，通过初发酵实验、平板具有金属光泽等特性，通过初发酵实验、平板分离和复发酵实验三个步骤进行检测，以求得分离和复发酵实验三个步骤进行检测，以求得水样中的大肠杆菌数。用该法检
34、测大肠杆菌虽水样中的大肠杆菌数。用该法检测大肠杆菌虽费时较久、手续较繁，但准确可靠，是经典的费时较久、手续较繁，但准确可靠，是经典的检测方法。检测方法。膜过滤TTC（2、3、5、氯化三苯四氮唑）氯化三苯四氮唑）显色法显色法v在计数琼脂中加入适量的在计数琼脂中加入适量的TTC(0.5% TTC 1ML加到加到100ML琼脂中琼脂中),细菌菌落长成红细菌菌落长成红颜色颜色,对去除食品本底颗粒物干扰非常有对去除食品本底颗粒物干扰非常有意义意义.酵母菌在TTC上的菌落特征 DC(去氧胆酸钠去氧胆酸钠)半固体法半固体法 （1 1）选择三个稀释度的样品液，每个稀释度分别取）选择三个稀释度的样品液，每个稀释
35、度分别取1ml1ml放入灭菌试管中放入灭菌试管中。 (2) (2)将溶化并冷至将溶化并冷至5050左右的左右的DCDC半固体培养基加入上述试管中，每管半固体培养基加入上述试管中，每管3m13m1。立即混合。立即混合) )，凝固后于，凝固后于3737培养培养18182424小时。小时。(3)(3)判定标准和记录：判定标准和记录：a a培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂。记录为；培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂。记录为；b b培养基为桔红色，或有桔红色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为培养基为桔红色，或有桔红色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为十；十；c c培养基为绿色，有黄色菌落，无气泡和
36、琼脂崩裂现象，记录为培养基为绿色，有黄色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为；d d培养基为绿色，记录为培养基为绿色，记录为。(4)(4)判定为判定为a a、d d反应结果；记录阳性管数，查反应结果；记录阳性管数，查MPNMPN表并报告之。若为表并报告之。若为b b、c c反应结果，可挑大肠菌群可疑菌落接种乳糖复发酵管，根据产酸产气管反应结果，可挑大肠菌群可疑菌落接种乳糖复发酵管，根据产酸产气管数查数查MPNMPN表，并报告之。表，并报告之。菌落为菌落为红色，红色，周围有周围有红色的红色的菌落胆菌落胆盐沉淀盐沉淀环，直环，直径为径为2-3mm或或更大更大粪便污染指示菌之四粪便污染指示菌之四-肠球
37、菌肠球菌（Enterococcus）是链球菌属中的一个血清学群（是链球菌属中的一个血清学群（D型群）型群）（Lancefield应用链球菌细胞壁中多糖类应用链球菌细胞壁中多糖类半抗原，将链球菌分成半抗原，将链球菌分成ABCD-十九个血十九个血清群）清群） 肠球菌分类肠球菌分类1989年，依据年，依据Facklam和和Collins的分类，肠球菌属内的分类，肠球菌属内包括十二个种及一个变异株，它们是：包括十二个种及一个变异株，它们是：粪肠球菌（粪肠球菌（E.faecalis） 屎肠球菌（屎肠球菌（E.faecium) 鸟肠球菌鸟肠球菌(E.avium) 酪黄肠球菌酪黄肠球菌(E.casselif
38、lavus) 坚忍肠球菌坚忍肠球菌(E.durans) 鸡肠球菌鸡肠球菌E.galinarum) 芒地肠球菌芒地肠球菌(E.mundii) 恶臭肠球菌恶臭肠球菌(E.maladoratum) 希拉肠球菌希拉肠球菌(E.hirae) 孤立肠球菌（孤立肠球菌（E.solitarius） 棉子糖肠球菌棉子糖肠球菌(E.raffinosus) 假鸟肠球菌假鸟肠球菌(E.pseudoavium) 粪肠球变异株粪肠球变异株(E.faecalis var)。粪肠球菌为该属中最常见的即为代表种。粪肠球菌为该属中最常见的即为代表种。 自然界分布广，存活力持久自然界分布广，存活力持久肠球菌普遍存在于自然界，一般栖
39、居在各种温血肠球菌普遍存在于自然界，一般栖居在各种温血和冷血动物的腔肠，甚至昆虫体内，也是健康人和冷血动物的腔肠，甚至昆虫体内，也是健康人体的上呼吸道，口腔或肠道的常居菌。本菌可以体的上呼吸道，口腔或肠道的常居菌。本菌可以引起心内膜炎，胆囊炎，脑膜炎，尿路感染及伤引起心内膜炎，胆囊炎，脑膜炎，尿路感染及伤口感染等多种疾病。在人类粪便中的数量仅次于口感染等多种疾病。在人类粪便中的数量仅次于大肠菌群，每克成人的粪便中约含大肠菌群，每克成人的粪便中约含108个。个。 肠球菌分布肠球菌分布肠球菌生物学性状肠球菌生物学性状 肠球菌属的细菌为革兰氏阳性球菌，多数菌种成肠球菌属的细菌为革兰氏阳性球菌，多数菌
40、种成双或呈短链状排列；一般无芽胞，无荚膜，少数双或呈短链状排列；一般无芽胞，无荚膜，少数菌种有鞭毛，陈旧培养物或在厌氧状态下有时呈菌种有鞭毛，陈旧培养物或在厌氧状态下有时呈革兰氏阴性。革兰氏阴性。 最适生长温度最适生长温度37，最适，最适pH为为4.7-7.6，属内各，属内各菌种均能在菌种均能在.5%氯化钠肉汤氯化钠肉汤,pH9.6葡萄糖肉汤葡萄糖肉汤及及生长，个别菌种在生长，个别菌种在50时生长快。时生长快。 抵抗力强及耐受性强抵抗力强及耐受性强 ，生长营养要求不高，生长营养要求不高 目前该菌多作为生活饮用水，管道水和一些水目前该菌多作为生活饮用水，管道水和一些水质的指示菌。卫生学家认为，肠
41、球菌类似于大质的指示菌。卫生学家认为，肠球菌类似于大肠菌群的生态活动，但其对恶劣的外环境和冷肠菌群的生态活动，但其对恶劣的外环境和冷冻条件具有较强的抵抗力，作为监测水质卫生，冻条件具有较强的抵抗力，作为监测水质卫生，环境卫生质量的污染指标更具有卫生学意义。环境卫生质量的污染指标更具有卫生学意义。 肠球菌抵抗性肠球菌抵抗性 致病菌致病菌三、致病菌（病原菌）三、致病菌（病原菌）根据根据不同食品不同食品的特点的特点选定一定的病原菌选定一定的病原菌作为检作为检验的重点对象。例如蛋粉、冷冻禽类、肉类食验的重点对象。例如蛋粉、冷冻禽类、肉类食品等常规定沙门氏菌是必须检验的重要项目；品等常规定沙门氏菌是必须
42、检验的重要项目；酸度不高的罐藏食品，肉毒杆菌是必须检验的酸度不高的罐藏食品，肉毒杆菌是必须检验的对象；酸牛奶则规定肠道致病菌和致病性球菌对象；酸牛奶则规定肠道致病菌和致病性球菌（链球菌和葡萄球菌）是检测重点。（链球菌和葡萄球菌）是检测重点。食品中常见的致病性微生物食品中常见的致病性微生物 能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物：能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物：沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌，沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等口蹄疫病毒等 能产生毒素并引起食物中毒的微生物：能产生毒素并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌和产气荚膜杆菌，也包括一些真肉毒梭
43、菌、葡萄球菌和产气荚膜杆菌，也包括一些真菌，都会产生毒素。菌，都会产生毒素。致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌病原性大肠杆菌（致病性大肠杆菌）分类：病原性大肠杆菌（致病性大肠杆菌）分类：肠产毒性大肠杆菌（肠产毒性大肠杆菌（enterotoxigenic E. coli , ETEC）肠致病性大肠杆菌（肠致病性大肠杆菌（enteropathic E. coli , ETEC）肠侵袭性大肠杆菌（肠侵袭性大肠杆菌（entero invasive E. coli , ETEC）肠出血性大肠杆菌（肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic E. coli , ETEC）大肠杆菌大肠杆菌0 157：H
44、7血清型属肠出血性大肠杆菌血清型属肠出血性大肠杆菌大肠杆菌O157生物学特性生物学特性革兰氏阴性短杆菌，大小革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身微米。周身鞭毛鞭毛，能运动，无，能运动，无芽孢芽孢。能发酵多种糖类产酸、。能发酵多种糖类产酸、产气。产气。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（）和表面抗原（K），）， 4、抗原构造复杂、抗原构造复杂 鞭毛抗原（H）菌体抗原（O）K或Vi抗原致病物质致病物质大肠杆菌的致病物质为定居因子，即大肠杆菌的致病物质为定居因子，即大肠杆菌的菌毛大肠杆菌的菌毛肠毒素肠毒素所
45、致疾病所致疾病 肠道外感染肠道外感染 急性腹泻急性腹泻 月桂基硫酸盐胰蛋白胨月桂基硫酸盐胰蛋白胨 （LST）肉汤）肉汤月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤是月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤是 GB 标准、标准、 SN 标标准、准、 APHA 和和 ISO 推荐的培养基，用于食品和推荐的培养基，用于食品和水中大肠菌群的选择性增菌和近似计数。水中大肠菌群的选择性增菌和近似计数。 配方配方 (g/L) :胰蛋白胨胰蛋白胨 20.0; 氯化钠氯化钠 5.0; 乳糖乳糖 5.0; 磷酸氢二钾磷酸氢二钾 (K2HPO4) 2.75 ;磷酸二氢钾磷酸二氢钾 (KH2PO4) 2.75; 月月桂基硫酸钠桂基硫酸钠 0.1;pH
46、6.8 0.2。此配方可以进行。此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。改良或增加营养成份以获得最佳的结果。 煌绿乳糖胆盐（煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤）肉汤蛋白胨蛋白胨 10.0g乳糖乳糖 10.0g胆盐或胆盐或3号胆盐号胆盐 1.5g煌绿水溶液煌绿水溶液 13.3ml蒸馏水蒸馏水 1000.0mLEC 肉汤肉汤是由是由 Hajna and Perry 改进，改进， GB 标准标准 和和 SN 标标准推荐的培养基，用于食品、水和其它样品中大准推荐的培养基，用于食品、水和其它样品中大肠杆菌肠杆菌 ( 44.5 ) 和大肠菌群和大肠菌群 ( 37 ) 增菌和检增菌和检测。测。 成方成方
47、 (g/L) ：胰蛋白胨胰蛋白胨 20.0 ，乳糖，乳糖 5.0 ，3 号胆盐号胆盐 1.5 ，磷酸，磷酸氢二钾氢二钾 (K2HPO4) 4.0 ，磷酸二氢钾，磷酸二氢钾 (KH2PO4) 1.5 ，氯化钠，氯化钠 5.0 ，pH 6.9 0.1 25 。此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。的结果。 v大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠（月桂基硫酸钠）、洗衣粉、煌烷基硫酸钠（月桂基硫酸钠）、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。长。人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。