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1、第三章病毒与亚病毒前言1.病毒的最早记载 记载最早的病毒病天花 中国：北宋时期 防止天花：牛痘（英国乡村医生詹纳） 18代埃及王朝时代（公元前1500年），浮雕刻有一条萎缩腿的祭司-脊髓灰质炎病毒。给人类带来严重灾难的流感病毒流感期间 Camp Funston 的紧急军事医院前言2.病毒的发现19世纪末，科学家伊万诺夫斯基在研究烟草花叶病的病因时，推想是由细菌引起的。他将患花叶病的烟草榨出汁液，用细菌过滤器进行过滤，将细菌滤出，再用过滤后的汁液去感染正常的烟叶，结果发现正常的烟叶还能患病。这表明烟草花叶病是由比细菌还小的生物引起的，他把这种生物叫做“滤过性病毒”，就是我们所说的病毒。1971年
2、后，陆续发现了各种亚病毒类病毒、拟病毒和朊病毒。 1935年诺贝尔化学奖得主美国生化学家斯坦利第一次将病毒提纯出来，得到了一些结晶体。这些结晶体表现不出任何的生命特征，但是将这些结晶体移入生物体内，病毒就会大量繁殖，并使生物体致病。 至今美国加州大学原斯坦利实验室里保存的他当时提纯的病毒结晶仍然具有致病力。 由这些资料可知，病毒是一种特殊生物，只有在其他生物的活细胞内才能生活和繁殖，才能表现出生命现象。离开活细胞后，病毒无法进行任何生命活动。 这点也可以用在普通培养基上无法培养病毒来解释。病毒晶体病毒晶体假设病毒有一个篮球那么大，那么细胞就是一座摩天大厦非典（SARS）病毒H5N1禽流感病毒甲
3、型H1N1流感病毒 常见病毒手足口病病毒艾滋病病毒：HIV狂犬病病毒花叶病病毒昆虫病毒豌豆萎黄病毒绿脓杆菌病毒 常见病毒前言3.病毒的分类非细胞生物拟病毒:只含不具独立侵染性的RNA 组分类病毒:只含具有独立侵染性的RNA 组分亚病毒真病毒: 至少含有核酸和蛋白质两种组分朊病毒:只含单一蛋白质组分噬菌体（原核生物如细菌、放线噬菌体（原核生物如细菌、放线菌，噬蓝绿藻体，支原体噬菌体）菌，噬蓝绿藻体，支原体噬菌体）真菌病毒真菌病毒植物病毒植物病毒昆虫病毒昆虫病毒动物病毒动物病毒前言4.病毒的基本特点 个体极小（以nm计），能通过滤菌器，形态多样，有球状、杆状、复杂形态。 无细胞结构，主要由蛋白质、
4、核酸构成，一个病毒体内仅含一种核酸，核酸以单链或双链形式存在。 生活方式为专性活细胞内寄生，病毒酶系不全，离开活体后无生命特征。以毒粒形式存在。 病毒以复制的方式增殖。 对一般抗生素不敏感，对干扰素敏感。 一般来说，特异性比较强。前言5.什么是病毒？病毒：是一类超显微的非细胞生物,每一种病毒只含有一种核酸;它们只能在活细胞内营专性寄生;在离体条件下,它们以无生命的化学大分子状态存在.第二节 病毒的繁殖方式第四节 病毒与实践目录第一节 病毒的形态构造及化学成分第三节 亚病毒第一节 病毒的形态构造及化学成分1.病毒的大小绝大多数的病毒都是能通过细菌滤器的微小颗粒, 它们的直径多数在100 nm(
5、20200 nm)上下。观察病毒的形态和精确测定其大小, 必须借助电镜。2.病毒的形态形态各异的病毒烟草花叶病毒P2噬菌体T2噬菌体脊髓灰质炎病毒疱疹病毒流感病毒腺病毒形态各异的病毒形态各异的病毒（1）典型病毒粒的构造 病毒粒有时也称病毒颗粒或病毒粒子( virus particle ) , 专指成熟的、结构完整的和有感染性的单个病毒。 病毒粒的基本成分是核酸和蛋白质。核酸位于它的中心, 称为核心( core) 或基因组(genome ) , 蛋白质包围在核心周围, 形成了衣壳( capsid)。衣壳是病毒粒的主要支架结构和抗原成分, 有保护核酸等作用。裸病毒包膜病毒（2）病毒的群体形态可以分
6、为两个大类：1）光镜可以观察到：包含体（动植物细胞）2）肉眼可见：噬菌斑（细菌） 空斑 （动物细胞） 枯斑 （植物叶片） 病毒的群体形态包含体包含体（inclusion body）包含体的特殊名称：包含体的特殊名称： 顾氏小体顾氏小体- -天花天花 内基小体狂犬内基小体狂犬 X X小体小体TMVTMV 多角体多角体- -昆虫昆虫包含体的存在位置：包含体的存在位置：多数为多数为 细胞质中如天花病毒细胞质中如天花病毒少数为少数为 细胞核中如疱疹病毒细胞核中如疱疹病毒噬菌斑的形态与病毒、细菌及培养基的情况有关噬菌体所形成的噬菌斑病毒的群体形态噬菌斑病毒的群体形态空斑动物病毒感染形成的空斑空斑：动物病
7、毒在宿主单层细胞培养物上形成。 病毒的群体形态枯斑（3） 病毒粒的对称体制 病毒粒的对称体制有三种, 以螺旋对称和二十面体对称( 等轴对称)为主。另一些结构较复杂的病毒, 实质上是上述两种对称相结合的结果, 称作复合对称。螺旋对称的代表烟草花叶病毒烟草花叶病毒简称TMV。由95% 衣壳蛋白和5% 单链RNA( ssRNA) 组成。衣壳含2 130个皮鞋状的蛋白亚基即衣壳粒。每个亚基含158 个氨基酸, 相对分子质量为17 500。亚基以逆时针方向作螺旋状排列, 每圈为49 个核苷酸。二十面体对称的代表腺病毒 腺病毒( Adenovirus) 是一类动物病毒, 1953 年首次从手术切除的小儿扁
8、桃体中分离到。 腺病毒的外形呈“球状”, 实质上却是一典型的二十面体对称。没有包膜。它有12个角、20 个面和30 条棱。每个五邻体上突出一根末端带有顶球的蛋白纤维, 称为刺突。腺病毒的核心是由36 500 bp的线状双链构成。复合对称的代表T 偶数噬菌体 E .coli 的T 偶数( even type ) 噬菌体共有3 种, 即T2、T4 和T6.它们是病毒学和分子遗传学基础理论研究中的极好材料。 T4 由头部( head )、颈部( neck) 和尾部( tail ) 3 部分构成。由于头部呈二十面体对称而尾部呈螺旋对称, 故是一种复合对称结构。T-偶数噬菌体的头部为一变形的二十面体结构
9、。头部含有双链DNA。其尾部结构复杂,由尾管(tail tube)、尾鞘(tail sheath)、颈部(collar)、基片(base plate)、尾钉(tail pin)和尾丝(tail fiber)5个主要部分组成。3.病毒的核酸 核酸构成了病毒的基因组(genome ) , 它是病毒粒中最重要的成分, 具有遗传信息的载体和传递体的作用。 病毒核酸的种类很多, 是病毒系统分类中最可靠的分子基础, 主要有以下几个指标: 是DNA 还是RNA; 是单链还是双链; 呈线状还是环状; 是闭环还是缺口环; 基因组是单分子、双分子、三分子还是多分子; 核酸的碱基或碱基对数, 以及核苷酸序列等。4、
10、病毒的培养和纯化噬菌体细菌培养物培养液营养琼脂平板细菌培养液变清亮细菌平板成为残迹平板若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，噬菌斑噬菌斑(plague)(plague)如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对噬菌体的数目进行估算。噬菌体的数目进行估算。动物病毒实验动物鸡胚多种细胞培养Egg-Based Vaccine Production Currently commercialized seaso
11、nal influenza vaccines rely upon the supply of embryonated chicken eggs as the substrate for virus propagation. 蛋白质提纯方法蛋白质提纯方法（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）标准纯化的病毒制备物应保持其感染性病毒是有感染性的生物体病毒是有感染性的生物体病毒具有化学大分子的属性病毒具有化学大分子的属性纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性方法主要化学组成为蛋白质具有一定的大小、形状和密度差速离心梯度离心梯度离
12、心（超速离心超速离心）第二节 四类病毒及其繁殖方式以大肠杆菌的病毒T4噬菌体为例 噬菌体即原核生物的病毒, 包括噬细菌体、噬放线菌体噬蓝细菌体等, 凡有原核生物活动之处几乎都发现有相应噬菌体的存在。 噬菌体种类很多, 可归纳成6 种主要形态, 即A 型, dsDNA, 蝌蚪状, 收缩性尾; B 型, dsDNA, 蝌蚪状, 非收缩性长尾; C 型, dsDNA,非收缩性短尾; D 型, ssDNA, 球状, 无尾, 大顶衣壳粒; E 型, ssRNA, 球状, 无尾, 小顶衣壳粒; F 型, ssDNA, 丝状, 无头尾1.噬菌体的繁殖 噬菌体并没有个体的生长过程，而只有其基本成分的合成和装配
13、，即首先将各个部件合成出来，然后装配，所以一般将噬菌体的繁殖称做复制。根据噬菌体与宿主的关系：1.烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体.2.温和噬菌体（或溶源性噬菌体）：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段：即吸附、侵入、增殖、装配和释放烈性噬菌体的繁殖（1） 吸附 吸附是特异性的，病毒吸附蛋白，细胞受体（2）侵入 尾管端携带的少量溶菌酶水解肽聚糖，使细胞壁产生一小孔，注入核酸，而蛋白质外壳则留在细胞的外面。 （3）增殖包括核酸的复制
14、和蛋白质的合成。 早期基因次早期基因晚期基因（4）成熟或装配 主要步骤有： DNA分子的缩合通过衣壳包裹DNA而形成头部尾丝及尾部的其它部件独立装配完成头部与尾部相结合最后装上尾丝，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完成。（5）裂解（释放）两种释放形式： A.裂解性释放： 子代噬菌体成熟后，在脂肪酶和溶菌酶的作用下，细胞裂解，子代噬菌体释放（release）。 B.出芽性释放：有包膜的病毒通过出芽或者分泌的方式从细胞中释放。病毒可以从细胞膜、核膜或内质网膜中获得包膜。 核衣壳附着于膜的内侧，和膜一起挤出。烈性噬菌体复制的过程一步生长 通常情况下，一个噬菌通常情况下，一个噬菌体通过上述五个过
15、程能合体通过上述五个过程能合成成100-300100-300个噬菌体。烈个噬菌体。烈性噬菌体的这种生长繁殖性噬菌体的这种生长繁殖方式也称为一步生长。方式也称为一步生长。 在固体培养基表面可见在固体培养基表面可见噬菌斑。噬菌斑。 在液体培养基中可见培在液体培养基中可见培养物被溶解，培养基变清养物被溶解，培养基变清. . 2.噬菌体效价的测定 噬菌体效价：每毫升试样中所含有的具有侵染性的噬菌体粒子数。 效价的测定方法：双层平板法（Two layer plating method) 电镜直接观察3.一步生长曲线定量描述烈性噬菌体（病定量描述烈性噬菌体（病毒）繁殖规律的实验曲线，毒）繁殖规律的实验曲线
16、，以培养时间为横坐标以培养时间为横坐标, ,以以噬噬菌体（菌体（病毒）效价为纵坐病毒）效价为纵坐标称为标称为一步生长曲线一步生长曲线 . .可可分以下阶段：潜伏期，裂分以下阶段：潜伏期，裂解期，稳定期解期，稳定期 三个指标：三个指标：潜伏期，裂解潜伏期，裂解期，期，裂解量裂解量平稳期的平均效平稳期的平均效价数价数/ /潜伏期平均效价数潜伏期平均效价数裂解量：平均每一宿主细胞裂解后产生的子代噬菌体数4、温和噬菌体与溶源性细菌 （1）温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核基因组上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。（2）原噬菌
17、体（或前噬菌体）： 即整合在宿主核基因组上的噬菌体的核酸。 （3）溶原性细菌：指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。一般可进行正常生长繁殖,而不被裂解。 溶原性细菌的特点：1.可稳定遗传：子代细菌都含有原噬菌体，均具有溶原性。2.可自发裂解：温和噬菌体的核酸也可从宿主DNA上脱落下来，恢复原来的状态，进行大量的复制，变成烈性噬菌体，自发裂解几率10-210-5 。 可诱导裂解：用化学、物理方法诱导3.具有“免疫性”：对同型噬菌体具免疫性，对非同源噬菌体没有免疫性。4.可复愈：自然遗失前噬菌体，不发生自发裂解和诱导裂解.5.溶源转变：由于溶原菌整合了温和噬菌体的核酸而使自己产生一些新的生理特征。噬
18、菌体裂解性循环与溶源性循环的相互关系自发或诱导温和噬菌体向烈解性循环的转变5.植物病毒 叶片黄化 枯斑植株矮化植物病毒大多是含单链RNA的病毒。按粒子形态分为3种类型:杆状、线状或近球形的多面体。有些植物病毒也具有包膜。植物病毒和其它病毒一样是严格寄生生物,但它们的专化性不强 。 动物病毒入侵的三种方式：1. 裸病毒直接侵入2. 包膜病毒以融合方式进入3. 有包膜的病毒以胞吞方式进入6.动物病毒7.昆虫病毒 多角体 昆虫病毒的种类： 核型多角体（NPV) 质型多角体(CPV) 颗粒体病毒(GV) 无包含体病毒 第三节 亚病毒1. 类病毒 1.1 类病毒的发现： 马铃薯纺锤型块茎病（PSTV）
19、病原n n目前已经鉴定的类病毒种类有20多个，均在植物中发现。n 结构特点：为单链闭合环状的RNA分子，棒状结构，通常含有246375个核苷酸。n 类病毒RNA不编码任何蛋白质 PSTV类病毒是一种不含蛋白，能在感染的寄主细胞中自我复制并引起病原的小RNA环状分子，由246399个核苷酸分子组成，目前只在植物细胞中发现。Fig. Symptoms of viroid diseases: A: potato spindle tuber on tomato, B: avocado sun blotch, C: chrysanthemum stunt, D chrysanthemum chlorot
20、ic mottle 1.2 类病毒引起的病害1.3 PSTV的模式结构图PSTV 呈棒形, 是一裸露的闭合环状ssRNA 分子, 其相对分子质量为1.2105 。整个环由两个互补的半体组成, 其一含179 个核苷酸, 另一含180 个核苷酸, 两者间有70%的碱基以氢键方式结合, 共形成122 个碱基对, 整个结构中形成了27 个内环。1.4 类病毒的复制模式类病毒的滚环复制模式2. 拟病毒 宿主核酸：环状RNA1 拟病毒：线状RNA3 及环状RNA2 指一类包裹在真病毒粒中的有缺陷的类病毒，由裸露的指一类包裹在真病毒粒中的有缺陷的类病毒，由裸露的DNADNA或或RANRAN组成组成又称又称
21、类类病毒、壳内类病毒类类病毒、壳内类病毒被拟病毒寄生的真病毒为辅助病毒（helper virus）2.1拟病毒的发现1981年在绒毛烟的斑驳病毒中分离到 单独没有侵染性，必须依赖辅助病毒才能侵染和复制 拟病毒可干扰辅助病毒的复制其RNA不具有编码能力，需要利用辅助病毒的外壳蛋白，并与辅助病毒基因组一起包裹在同一病毒粒子内。 2.2拟病毒的特点3. 卫星病毒1.1.概念：基因组缺损，必须依靠辅助病毒才能复制和概念：基因组缺损，必须依靠辅助病毒才能复制和表达的小型伴生病毒。表达的小型伴生病毒。2. 特点：有较完整结构 无独立感染能力 可改变辅助病毒引起的病害，单独感染的 话，可使寄主溶源化4.卫星
22、RNA1.概念：存在于某一病毒粒（辅助病毒）的衣壳内，并完全依赖后者才能复制自己的小分子RNA病原因子。2.特点：对宿主植物无独立的侵染性；其复制和侵染完全依赖辅助病毒；不具有mRNA活性；与辅助病毒的RNA无同源性；能干扰辅助病毒的复制从而降低其增殖量。3类亚病毒因子的比较特点特点拟病毒拟病毒卫星病毒卫星病毒卫星卫星RNA核酸种类小分子环状或线状ssRNA小分子线状ssRNA或线状dsRNA小分子线状或环状ssRNA衣壳无有无存在状态包装在专一的辅助病毒粒内与专一的植物病毒、动物病毒或噬菌体伴生包装在专一的辅助病毒粒内核酸复制对辅助病毒的依赖依赖不依赖依赖基因组与辅助病毒的整合是否否与辅助病
23、毒基因组的同源性有无无对侵染的必要性必要不必要不必要编码自身衣壳蛋白不能能不能对宿主的影响改变辅助病毒引起的症状，加重或减弱病害改变辅助病毒引起的症状，加重或减弱病害；若单独感染宿主，可使其溶源化改变辅助病毒引起的症状，加重或减弱病害5. 朊病毒 5.1 什么是朊病毒 5.2关于朊病毒的两项荣誉 1.库鲁病：Gajdusek1976年 2.羊搔痒病：1982年prusiner 发现，并因此获得了1997年的诺贝尔生理和医学奖 一种传染性的蛋白侵染因子5.3 朊病毒所引起的疾病 震颤病或称库鲁(Kuru)、 克雅氏病(CJD)或称为老年痴呆 牛海绵脑病(BSE)即疯牛病、猫海绵脑病(FSE)、
24、新型克雅氏病（早老性痴呆） 吉斯特曼斯召斯列综合症(GSS)、 致死性家族失眠症（FFI)、 绵羊搔痒症、山羊搔痒症、 大耳鹿慢性消耗病(CWD)、 传染性雪貂白质脑病(TME) 疾病特点：致死性中枢神经系统的慢性退化性脑病，潜伏期长，临床症状，病理切片疯牛病牛脑切片患病脑组织切片朊蛋白朊蛋白（PrPc）42的的螺旋和少螺旋和少量的量的折叠折叠(3) 朊病毒蛋白朊病毒蛋白（PrPsc）30的的螺旋和螺旋和折叠折叠(45) 朊蛋白（朊蛋白（PrPc）一种分子量为一种分子量为3335kD的正常细胞蛋白的正常细胞蛋白截短形式朊截短形式朊病毒蛋白病毒蛋白（PrP27-30）n21的的螺旋和螺旋和折叠折
25、叠(54) n 蛋白酶抗性蛋白酶抗性n 聚集成淀粉样颗粒聚集成淀粉样颗粒朊蛋白和朊病毒蛋白朊蛋白和朊病毒蛋白！朊蛋白是生物体内正常存在的一种蛋白质！朊蛋白是生物体内正常存在的一种蛋白质5.4 朊病毒病的发病机制第四节 病毒与实践1.1. 噬菌体噬菌体与发酵与发酵工业工业2. 2. 昆虫病毒用于昆虫病毒用于生物防治生物防治3 3. . 病毒在基因工程中的病毒在基因工程中的应用应用4. 4. 病毒与疾病病毒与疾病1.噬菌体与发酵工业查找污染的原因生产菌株本身环境及发酵罐本身空气过滤器操作人员严格会客制度噬菌体的防治：防重于治防治措施：1.物理因素 (一)温度 大多数病毒耐冷不耐热。反复冻融可致许多
26、病毒灭活 不同病毒对热的耐受性有很大不同，一般包膜病毒比无包膜病毒更不耐热，包膜病毒56可迅速灭活。 （二)pH 多数病毒在pH6-9范围内比较稳定，在pH5.0以下或pH9.0以上迅速灭活。 (三)射线 射线、x射线及紫外线都能灭活病毒。 (一)脂溶剂： 包膜病毒 (二）酚类及醛类 酚及其衍生物为蛋白质变性剂，能破坏病毒衣壳蛋白，故可作为病毒消毒剂。 (三)氧化剂、卤素及其化合物 70的甲醇及乙醇均可使多数病毒灭活。过氧乙酸等对肝炎病毒有较好的消毒作用。防治措施：2. 化学因素噬菌体感染大肠杆菌的电镜照片 用噬菌体防治动物的痢疾杆菌、耐药性的绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌感染，取得优于药物的治疗效
27、果。 2.昆虫病毒用于生物防治 生物治虫包括动物治虫、以虫治虫、细菌治虫、真菌治虫和病毒治虫等手段。 其中利用病毒制剂进行生物治虫由于具有资源丰富( 已发现的病毒近2 000 种)、致病力强和专一性强等优点, 故发展势头很旺, 前景诱人。 现阶段，由于其杀虫速度慢，不易大规模生产，保藏期短，在野外易失活和杀虫范围窄等缺点，有待研究解决。3. 病毒在基因工程中的应用 噬菌体作为原核生物基因工程的载体 噬菌体： 科斯质粒（cosmid）: 噬菌体的粘性末 端和质粒构建而成。 特点：感染力强 cos位点连接形成环状，似质粒 可克隆大片段4、病毒与疾病 l 艾滋病（艾滋病（AidsAids）l全称为人
28、类获得性免疫缺陷全称为人类获得性免疫缺陷综合症综合症(Acquired Immune (Acquired Immune DificiencyDificiency Syndrome) Syndrome)l由人体免疫缺损病毒（由人体免疫缺损病毒（HIVHIV）引起，引起，19871987年定名年定名HIVHIV危害人体危害人体1.圆形结构2.有包膜3.遗传物质为ssRNA， 自身携带反转录酶4. 传播途径：体液HIV病毒的结构HIV病毒的感染 从感染艾滋病病毒到发病有一个完整的自然过程，临床上将这个过程分为四期： 急性感染期 潜伏期 艾滋病前期 典型艾滋病期与AIDS有关的条件病原体A:白假丝酵母
29、，b，新型隐球菌 c，荚膜组织胞浆菌，d，卡氏肺囊虫 e，隐孢子虫，f，小肠分支杆菌HIV的治疗(一)阻断病毒吸附和感染建立(二)病毒逆转录酶和蛋白酶活性的抑制 鸡尾酒疗法（三)HIV疫苗的研制 噬菌体载体系统一、噬菌体载体二、单链噬菌体载体三、噬菌粒载体四、柯斯质粒载体一、噬菌体 组成特点： 双链线状DNA分子， 全长50kb， 含65个基因， 在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。噬菌体感染细菌后的溶菌性和溶源性生长 溶菌性生长 噬菌体感染细菌后，借助其2个cos位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释
30、放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长 噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。噬菌体 A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR 结构区 重组区调控区裂解区cos位点 cos 位点ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置换型A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 头部基因 尾部基因 功能不明区 溶源化 重组 早期控制 阻遏 DNA合
31、成 溶菌生长非必须区段cI基因：溶源过程控制基因。噬菌体的基因组结构1、噬菌体载体类型 插入型载体：仅有一个可供外源基因的插入位点。例如：gt10 11，BV2,NM540, NM590, NM607等。替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片断所取代。 例如：EMB14 和 Charon4，Charon10等。 凯伦噬菌体：既有插入型，又有替换型插入型载体 插入失活效应：外源的DNA克隆到插入型的载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失。插入失活有两种类型：(1)免疫功能失活；(2)大肠杆菌半乳糖苷酶失活；v 半乳糖苷酶失活的插入型载体：这种载体感
32、染的大肠杆菌lac+指示菌，涂布在补加有IPTG和Xgal培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑，若外源DNA插入的编码半乳糖苷酶的lacZ基因区，这种重组体感染的lac-指示菌，由于不能合成半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。v 免疫功能失活的插入型载体：外源DAN片断插入这种类型载体的基因组中的一段免疫区，使载体所具有的合成活性阻遏的功能遭受破坏，不能进入溶源周期。因此，凡带有外源DNA插入的重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体会形成混浊的噬菌斑。替换型载体 替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤： 应用适当的核酸内切酶消化载体，除去基因组中可取代的DNA区段； 将上述所得
33、的DNA臂同外源DNA片断连接； 对重组体的DNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的重组噬菌体。Charon（凯伦）噬菌体 3、DNA的体外包装 噬菌体体外包装的基本原理 噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。 重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的分子量大小的75%至105%之间。否则，噬菌体的活性急剧下降。要求DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。 插入式载体可携带的外源DNA片段较替换式小。-DNA的抽提 大肠
34、杆菌培养至对数生长期 加入-噬菌体或重组-噬菌体悬浮液，37培养1h。 用新鲜培养液稀释，继续培养4-12h 高速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放-DNA。 乙醇或异丙醇沉淀DNA。-DNA作为载体的优点 体外包装病毒颗粒，高效感染E.coli 装载外源能力为25kb，大于质粒 筛选方便 重组-DNA容易提取二、单链噬菌体载体 单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：M13、f1、fd噬菌体单链DNA噬菌体载体M13、f1、fd。优越性：1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA；2.不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；3.单链DNA噬
35、菌体颗粒的大小，是受其DNA的制约的，不存在包装限制问题；4.容易测定外源DNA片断的插入取向；5.可产生含外源片断的单链DNA分子。 3. M13噬菌体 噬菌体正链复制复制型DNA经pII蛋白造缺口35经pII蛋白剪切释出单链DNA(正链)进入下一循环5335滚环复制在细菌内的复制模式图M13噬菌体的特点感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA（ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。 成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RF DNA或ss DNA都能转
36、染E.coli的F+或F-细胞。 噬菌体颗粒的大小是受其DNA的大小制约的，这一点正好与噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。 M13M13载体的构建载体的构建（1）克隆区域的选定基因间隔区（intergenic region, IG区）J. Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ（-肽序列)。 利用-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。(2)加入酶切位点 在在IGIG区内加入单一内切酶位点区内加入单一内切酶位点第一个M13载体：M13mp1：M13
37、 RFBsuI不完全消化各种长度的线性片断（其中应有只在（其中应有只在IGIG上切开的线性上切开的线性全长全长M13M13）E.coli lac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ）连接M13mp1JM101宿主只有在IG区插入lacZ才能存活并在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑（三）1 1）便于克隆不同的酶切片段）便于克隆不同的酶切片段2 2）XgalXgal显色反应，可供直接选择显色反应，可供直接选择3 3）无包装限制，克隆能力大）无包装限制，克隆能力大4 4）可以克隆双链）可以克隆双链DNADNA分子中的每一条链分子中的每一条链子代M13噬菌体中包含的是单链+DNA
38、。三、噬菌粒载体 由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。噬菌粒载体（phagemid vectors）由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。MCS噬菌体ori质粒oriAmprlacZ lacI约3000bp（比M13小）克隆能力大能插入10kb的外源DNA。两种复制形式分子量小1、噬菌粒载体的特点既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，
39、又能在噬菌体内进行单链复制。常用的噬菌粒载体pUC118用于体外转录3 PCR产物克隆载体 T 载体pCR系列载体Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。 结构结构pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。MCSMCS的中部已经切开，各有一个的中部已经切开，各有一个3 3端突出的端突出的T T。 特点特点PCR产物往往在3端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAA四、柯斯质粒(cosmid) 一种人工构建的克隆载体，包含了噬菌体的cos基因。柯斯质粒能被包装到噬菌体粒子中，感染大肠杆菌；它携带入宿
40、主细菌的DNA片段（超过45kb）要比质粒载体携带的要大。（一）粘粒(cosmid) 组成：2. 抗性基因；1. 质粒复制的起始位点(ORI)；3. 用于插入目的基因的单个酶切位点；4. 噬菌体的cos位点。 可见，cosmid是由质粒和噬菌体的cos位点构建而成。与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点：具有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制；有像质粒一样的选择标记；cosmid载体比较小，但能插入较大的外源片段，可克隆外源片段的长度在1545 kb之间。由于cosmid载体的大片段克隆能力，多用于基因组文库的构建，而噬菌体载体多用于cDNA文库
41、的构建。 多种单一酶切位点，便于克隆 1、粘粒载体的优点 柯斯粘性质粒特点：1. 可插入长达2741kb的外源基因，方便地用于克隆大片段DNA。2. 加入噬菌体头部和尾部蛋白，可将 粘粒包装成类似于噬菌体的具感染能力的颗粒，方便地进入大肠杆菌。3. 粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体 的功能，而表现质粒的特性。 柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成，全长4.3kb。 设计构建的柯斯质粒一般长46kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。 凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗
42、粒。 因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。DigestionLigationC) Packaging and infectFormation of a cosmid clone采用柯斯质粒作载体的困难载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出3045kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。1.病毒的分类及每一类的特征？2.病毒粒的基本组成？3.噬菌体繁殖的几个步骤？4.病毒粒的三种对称体制5.名词解释：噬菌体效价、原噬菌体、溶原性细菌、柯斯质粒、空斑、枯斑、包含体