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1、我国药用植物原生质体培养的研究进展 摘要：对近年来药用植物原生质体的制备、培育、融合以及植株再生进行了综述，阐明白起始材料、酶解条件、培育方法等对原生质体培育的影响，并对今后药用植物原生质体的重点探讨方向作了探讨。 关键词：药用植物；原生质体；酶解条件；培育；探讨进展 中图分类号：Q942 文献标记码： A 文章编号：1012-130203-0243-03 原生质体是指植物细胞中除去细胞壁后有生命活性的部分，除去细胞壁的原生质体能够干脆摄入外源的细胞器、DNA、病毒、质粒等，是进行遗传转化探讨的志向受体，对其进行细胞融合可获得杂种细胞1。因此，植物原生质体在品种改良和生物学基础理论探讨中有广泛
2、的应用前景，备受国内外探讨学者的关注。1892年，Klercker首次用机械法进行原生质体的分别探讨，但是原生质体获得量很少2。1960年，Cocking采纳酶解法从高等植物细胞中分别获得原生质体3。随着纤维素酶和果胶酶的推行，植物原生质体培育渐渐成为一个热门话题4。11011年，Takebe等首次从烟草叶片中分别出原生质体并获得再生植株，原生质体的培育进入一个新的阶段5。在此基础上，药用植物原生质体的培育也有了肯定的发展。目前，药用植物原生质体的培育已经扩展到夹竹桃科、五加科、紫草科、菊科、龙胆科、葫芦科、茄科、玄参科、天南星科等数十科。本文就近年来药用植物原生质体的制备、培育、融合以及植株
3、再生进行综述，为今后药用植物原生质体培育的探讨寻求切入点和突破点，供应新的探讨方法和有力的论证依据。 1 原生质体的分别 原生质体分别是进行原生质体培育的第1步，干脆影响原生质体培育能否胜利。其中，原始材料的生理状态，原生质体的分别、预处理方法以及游离纯化方法等都是影响原生质体分别的重要因素。原生质体的分别方法主要有机械法和酶解法2种。机械法存在产量低等缺陷，因此多采纳酶解法进行原生质体的分别。 1.1 原始材料的选择 原始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响6。生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活性原生质体的关键，并对原生质体的复壁、愈伤组织的形成以及植株再生有重要的影响
4、。原生质体分别的原始材料有许多，只要选用的酶类型及用量合适，就可以在植物的任何部位获得游离的原生质体2。据有关原生质体培育的报道，叶片是分别原生质体试验中常用的原始材料7。张晓丽等以青天葵簇新叶片为试验材料获得制备青天葵原生质体的志向条件与参数8。愈伤组织和悬浮细胞生长快速稳定，受环境条件影响比较小，更易获得大量高质量的原生质体。但是，长期培育的愈伤组织和悬浮细胞简单引起植株丢失再生实力，这就须要选择胚性状态的细胞团，这是再生植株所必需的9-10。同时，基因型也会影响植物原生质体的培育，不同基因型分别得到的原生质体产量和活力差别很大11，并且对原生质体的植株再生也有肯定的影响12。 1.2 原
5、始材料的预处理 一些探讨表明，材料的预处理对保持原生质体的完整性及提高原生质体产量有主动的作用。张晓丽等用13%甘露醇溶液预处理青天葵叶片1 h，获得大量的原生质体8。王鹏凯等以北美鹅掌楸的悬浮细胞和组培苗叶片为材料，用含有0.1% 2-吗啉乙磺酸和0.6 mol/L甘露醇的Cell Protoplast Wash 溶液25 预处理 1 h，结果显示原生质体产量明显提高13。于相丽等以洛阳红牡丹叶片为材料制备原生质体，在蔗糖浓度为0.3 mol/L的溶液中预处理0.5 h的效果最好14。但是，并不是全部的原生质体分别都须要经过预处理，要依据不同的状况而定。 1.3 原生质体的分别方法 药用植物
6、游离原生质体常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、离析酶等，不同植物材料选用哪种酶较好取决于所用细胞和组织的来源。不同种类酶的混合运用和精确的酶解温度和酶解时间的设置，可以得到较好的酶解效果15-16。近年来，开发一种微生物型的纤维素酶和果胶酶用于原生质体分别渐渐成为探讨的焦点17。 渗透压是影响原生质体游离的一个重要因素。渗透压过低，原生质体缺乏细胞壁的爱护，往往会出现裂开的状况。有探讨表明，微高的渗透压有利于原生质体维持稳定的形态18。渗透压稳定剂是酶液的重要组成部分，应当引起足够的重视。药用植物原生质体分别环境中常用的渗透压稳定剂为甘露醇和山梨醇19-20，甘露醇由于在试验中的降解性小
7、于山梨醇而被认为是目前最适合的渗透压稳定剂。 1.4 原生质体游离基纯化方法 原生质体游离后的提纯方法常用的有漂移法和沉降界面法，其中沉降界面法使原生质体集中在两相界面，操作简洁，但是简单造成原生质体损伤；漂移法在重复漂移洗涤纯化的过程中对原生质体的损伤较小，但是简单混进一些不须要的原液，影响漂移纯化效果，这就须要严格限制离心力21。 2 原生质体的培育 2.1 培育基 在药用植物原生质体的培育中，常用的培育基有改良的MS、B5、KM8P、6，7-V、V-KM等培育基22-25，培育基的pH值一般为5.65.8。无机盐是构成培育基的主要成分，一般Ca2+和NH+4对原生质体培育效果影响较大，且
8、较高浓度的Ca2+有利于原生质体培育26。马锋旺等在原生质体培育中发觉，高浓度的NH+4能抑制原生质体分裂27-28。原生质体洗液中盐离子的浓度和种类对原生质体细胞膜的稳定性也有肯定的影响，试验中应留意29。 肯定水平的渗透压可以保持原生质体的正常形态，使原生质体的正常生理功能得以进行，培育基中的碳源和渗透剂在原生质体培育中有重要的作用。卫志明等探讨发觉，运用葡萄糖可以提高悬铃木叶肉原生质体的植板率30。林顺权等在对枇杷原生质体的探讨中发觉，10%葡萄糖+5%山梨醇是全部试验处理中最合适的碳源兼渗透剂31。 2.2 培育方法 原生质体常用的培育方法包括液体浅层培育、固-液双层培育、琼脂糖包埋及
9、看护培育等方法，目前应用最广泛的是固-液双层培育。范小峰等以南蛇藤胚性愈伤组织为材料分别原生质体，采纳液体浅层静置培育并取得了较好的原生质体培育效果32。秦晓杰等在胚性愈伤组织诱导培育基中进行原生质体的悬滴培育、液体培育等不同培育方式的探讨，结果表明看护培育是最佳培育方法22。这些常用的原生质体培育方法同样适用于药用植物原生质体培育。 不同类型的药用植物应依据实际状况采纳不同的培育方式，一些植物也可采纳多种培育方式联合培育。其中，五加科、天南星科等较适合液体浅层和固-液双层的联合培育方式24，33，菊科、伞形科的植株较适合固体的培育方式2，34，茄科、玄参科植株较适合液体浅层培育方式35-36
10、。 3 原生质体的融合 由于植物原生质体没有细胞壁的限制，它为体细胞遗传探讨和作物改良供应了很多便利37。传统的有性杂交存在远缘杂交不亲和、双亲花期不遇、雌不育等难以克服的障碍，严峻阻碍了杂交技术在植物育种中的应用。由于分别的原生质体无细胞壁，可以用物理或化学方法诱导融合。利用植物原生质体进行细胞融合和体细胞杂交，可以克服有性杂交遇到的障碍。 自 Carlson等在 11012 年获得第1株烟草体细胞杂种植株以来38，原生质体融合技术在药用植物中已广泛应用。早期原生质体融合的方法主要有硝酸钠法、高浓度Ca2+高 pH值法、PEG法、PEG-高浓度Ca2+高pH值法、电融合法及聚集微束激光法等，
11、目前广泛运用的是PEG-高浓度 Ca2+高 pH 值法39-40和电融合法41-42。但是，PEG-高浓度 Ca2+高 pH值法存在融合频率低的弱点。Chen等用该方法进行原生质体融合，融合频率约45%43。近年来一些探讨者发觉，加入二甲基亚砜可以有效提高融合频率44。电融合法操作简洁、快速，融合同步性好，还可以避开化学药剂的毒害作用，被大家普遍接受。 4 原生质体的再生 在药用植物原生质体培育中，因为原生质体培育的稳定性和可重复性差且阅历性很强，所以由原生质体获得愈伤组织的实例许多，但是胜利获得原生质体再生植株的案例很少。目前，我国从药用植物的原生质体培育和花药培育中获得完整植株的物种有前胡
12、、防风、决明子、党参、石刁柏、枸杞、毛叶曼陀罗等45。原生质体再生植株的途径通常有3种：由细胞团形成愈伤组织，然后再分化成植株；干脆形成胚状体，再发育成植株；由细胞团形成的愈伤组织先分化成胚状体，然后发育成植株1。据目前一些探讨结果来看，大多数植物再生植株以诱导器官发生途径较多，而五加科和伞形科植物的最佳途径是诱导体胚的发生2。 5 结论 近年来，国内外广泛地开展了植物原生质体的探讨工作，植物原生质体培育和融合取得了突破性进展，主要表现在通过原生质体获得再生植株的种类不断增加。其中，药用植物已经从原来不能杂交的植物胡萝卜和人参、曼陀罗和颠茄、烟草和龙葵等获得杂种植株。 虽然药用植物原生质体培育
13、和融合取得很大进展，但也存在一些缺陷，如再生植株遗传性状的稳定性差；杂种植株发生变异的规律尚不明确；缺乏完整的药用植物原生质体培育体系，技术体系基本借鉴于其他植物且相对落后。这些都是药用植物原生质体探讨以后须要重点解决的问题。 参考文献： 1刘庆昌，吴国良. 植物细胞组织培育M. 北京：中国农业高校出版社，2003：178. 2林阅兵. 人参加胡萝卜原生质体培育再生植株的探讨D. 长春：吉林农业高校，2022. 3Cocking E C. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuolesJ. Nature，1960，87：
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