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1、初探分子生物技术的研究及应用 【摘 要】近年来分子生物技术与植物学、动物学探讨的结合，是中药品种探讨进入了一个新的高度。中药材所依靠的生物资源的多样性是基于其基因的多态性结果，而基因的多态性可自分子水平上检测，它是比在形态、组织、化学水平上的检测更能代表其变异类型的遗传标记。 【关键词】生物；分子；基因；中医药 一、引言 20世纪后半叶以来，由于分子生物学的崛起，人们进入了合成代谢与代谢调整的探讨。这一阶段，细胞内两类重要的生物大分子蛋白质与核酸，成为探讨焦点。20世纪50年头初期发觉了蛋白质的%Z螺旋的二级结构形式；更具里程碑意义的是1953年提出的DNA双螺旋结构模型，为揭示遗传信息传递规
2、律奠定了基础，是生物化学发展进入分子生物学时期的重要标记。20世纪73年头，重组DNA技术的建立不仅促进了对基因表达调控机制的探讨，使基因操作无所不能，而且使人们主动改造生物体成为可能。基因诊断和基因治疗也是重组DNA技术在医学领域应用的重要方面。 随着对各种疑难疾病的深化探讨，和分子生物学日新月异的发展，传统的诊断治疗手段无法解决的一些重要问题。通过对生物体在分子水平上的探讨，基因诊断与治疗的作用渐渐显露出来，尤其是很多遗传疾病。 二、基因诊断的方法 基因诊断是以核酸分子杂交和聚合酶链反应为核心发展起来的多种方法，同时协作DNA序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方
3、法。DNA诊断常用检测致病基因结构异样的方法有下列几种。 1.斑点杂交：依据待测DNA样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以推断目标基因或相关的DNA片段是否存在，依据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。 2.等位基因特异的寡核苷酸探针杂交：是一种检测基因点突变的方法，依据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不行能形成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。假如受检的DNA样本只能与突变ASO探针
4、，不与正常ASO探针杂交，说明受检二条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；假如既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，说明一条染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子；假如只能与正常ASO探针杂交，不能与突变ASO杂交，说明受检者不存在该种突变基因，若与PCR方法联合应用，即PCR/ASO探针杂交法，是一种检测基因点突变的简便方法，先用PCR方法扩增突变点上下游的序列，扩增产物再与ASO探针杂交，可明确诊断突变的纯合子和杂合子。此法对一些已知突变类型的遗传病，如地中海贫血、苯丙酮尿症等纯合子和杂合子的诊断很便利。也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因
5、如p53的点突变。 3.单链构象多态性分析相同长度的单链DNA因其序列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不尽相同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时速度就不同，若单链DNA用放射性核素标记，显影后即可区分电泳条带。一般先设计引物对突变点所在外显子进行扩增，PCR产物经变性成单链后进行电泳分析。PCR/SSCP方法，能快速、灵敏、有效地检测DNA突变点，此法可用检测点突变的遗传疾病，如苯丙酮尿症、血友病等，以及点突变的癌基因和抑癌基因。 4.限制性内切酶图谱分析，假如DNA突变后变更了某一核酸限制性内切酶的识别位点，使原来某一识别位点消逝，或形成了新的识别位点，那么相应限制性内切酶片段的长度和数目会
6、发生变更。一般基因组DNA经该种限制性内切酶水解，再做Southern印迹，依据杂交片段的图谱，可诊断该点突变。假如用PCR扩增该突变点的外显子，PCR产物经该种酶消化后，进行琼脂糖电泳，溴乙锭染色后可干脆视察片段的大小及数目。此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消逝的遗传疾病，如镰状细胞贫血。或基因缺失的疾病如%Z地中海贫血症，单纯性生长激素缺乏症等。 三、分子生物技术在现代中医药发展中的应用 随着国家中医药现代化战略的实施，运用现代科技技术对重要的作用机理、质量限制和量效关系进行探讨受到了广泛重视。近年来，分子生物学技术在中药质量评价领域的应用逐步扩大，方法也日趋完善，在中药的分子鉴定、
7、中药质量限制、作用机理探讨、新药研发等方面均展示出很好的应用前景。 在中药有效成分的提取方面的应用。中草药有效成分的提取和鉴定是中药探讨的重要工作之一。一种中药材要经过一系列繁琐而艰辛的分别提取过程，鉴定测定后才得知其所含的有效成分及含量，然而有效成分往往是微量的，如长春花碱等。如何获得更多的有效成分始终是中草药探讨的一个奋斗目标。生物技术的快速发展为这一探讨供应了新方法、新思路，如转基因器官培育技术等。 在中药作用机制方面的应用。核酸分子杂交技术，核酸分子杂交技术是分子生物学的基本技术之一，在中药作用机理探讨中较早常用的有印迹杂交、点杂交和原位杂交。廖柏松等采纳Northern？blot？对
8、用中药二仙汤灌胃18月龄雌性大鼠下丘脑内阿片肽的基因表达水平进行探讨，结果显示，二仙汤组%-啡肽前体阿黑皮素原和脑啡肽原的mRNA水平明显上升，达到未苍老前水平；PCR技术，PCR是美国科学家Mullis于11013年独创的一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，是目前中药机理探讨中最常用的分子生物学技术。魏小龙利用PCR衍生技术即RT-PCR和mRNA差异显示技术对小鼠进行探讨，结果提示，小老鼠的中枢学习记忆过程中与海马多种基因表达存在亲密关系。 四、 结语 道地药材与非道地药材物种来源一样或非常相近，在形态、生药性状及化学成分等特征上具有高度相像性，因而道地药材的鉴别往往不简单，近年来，探讨人员从DNA分子水平上来探讨中药材道地性取得了很多进展。如利用RAPD技术探讨了冬虫夏草的不同地理群体间的遗传分化现象，结果表明：来自同一地方的样品遗传差异甚微，同一区域不同地方的样品间遗传差异较大，不同区域的样品间遗传差异最大，这为冬虫夏草的药材道地性探讨供应了分子水平的支持依据。 第5页 共5页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页