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1、基因工程（二）基因工程的基本操作程序编稿：闫敏敏 审稿：宋辰霞【学习目标】1、理解获取目的基因的方法。2、（重点、难点）理解基因表达载体的构建原理。3、理解将目的基因到入受体细胞的方法。4、理解目的基因的检测与鉴定可以采用不同的方法。【要点梳理】要点一、目的基因的获取 1、目的基因：编码蛋白质的结构基因。 2、目的基因的获取方法：从供体细胞直接获取；从基因文库中获取；利用mRNA反转录形成；利用PCR扩增技术；人工合成。 3、基因文库、基因组文库、cDNA文库概念及作用：基因组文库含有一种生物的全部基因，而cDNA文库指含有一种生物的部分基因，二者都是基因文库；有了基因文库，就可随时从中提取所
2、需要的目的基因，引入受体细胞使之表达。 4、比较几种目的基因的获取方法方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库如cDNA文库过程供体细胞中的DNA 限制酶许多DNA片段 插入载体 导入受体菌群（基因组文库） 外源DNA扩增，产生特定性状 分离目的基因目的基因mRNA 逆转录单链DNA 合成双链DNA 插入载体 导入受体菌群（cDNA文库） 分离目的基因目的基因DNA 高温解链单链DNA 与引物结合、 DNA聚合酶大量目的基因蛋白质的氨基酸序列 推测mRNA的核苷酸序列 推测结构基因的核苷酸序列 化学合成目的基因优点专性强可在短时间内大量扩增目的基因专一性强，可产生自然界中
3、不存在的新基因缺点工作量大，盲目性大，专一性差操作过程较麻烦，技术要求过高适用范围狭小 5、PCR与生物体内DNA复制的比较生物体内DNA复制PCR解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，DNA双链部分解旋加热至9095时。双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72左右特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增Taq DNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次相同点生物体内的DNA复制和PCR中都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行
4、要点二、基因表达载体的构建 1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并在遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。 启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别结合的部分。 终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。 标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因（目的基因是否导入成功）。 3、基因表达载体的构建方法： 要点三、将目的基因导入受体细胞【高清课堂：基因工程（二）基因工程的基本操作程序 369166目的基因导入受体细胞】
5、1、不同受体的导入方法目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。（1）将目的基因导入微生物细胞（2）将目的基因导入植物细胞土壤农杆菌转化法土壤农杆菌能感染双子叶植物和裸子植物。植物细胞受伤时，细胞分泌大量酚类物质，吸引农杆菌移向受伤细胞。农杆菌Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体的DNA上。80%转基因植物通过此种方法获得。基因枪法 利用压缩气体产生的动力，将包裹在钨粉或金粉等金属颗粒表面的重组DNA打入受体细胞的方法。花粉管通道法 1987年，中国科学家周光宇独创的。植物授粉后，花粉形成的花粉管还未愈
6、合前，剪去柱头，滴加重组DNA，使目的基因借助花粉管进入受体细胞。（3）将目的基因导入动物细胞：常用显微注射法（4）不同受体导入方法的比较受体细胞种类方 法植物细胞农杆菌转化法：目的基因插入Ti质粒的T-DNA农杆菌导入植物细胞稳定维持和表达基因枪法花粉管通道法动物细胞显微注射法：目的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育新性状动物微生物细胞Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子 2、受体生物不同，所用的受体细胞种类也不相同。 植物：可以是卵细胞（受精卵）、体细胞（可经组织培养成为完整个体）。动物：受精卵（因为体细胞的全能性受到严格限制）。要点四、目的
7、基因的检测与鉴定 1、分子水平上进行检测的方法 转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。检测方法是采用DNA分子杂交技术。 目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。检测方法同样是采用分子杂交技术。 检测目的基因是否翻译成蛋白质，检测的方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，若有杂交带出现，表示目的基因已形成蛋白质产品。 2、目的基因检测与鉴定的方法比较类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交技术（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因
8、是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA之间）同上第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原抗体杂交同上个体水平鉴定包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同 3、分子杂交检测示意图 把目的基因片段进行放射性同位素标记或进行生物素荧光标记，用标记好的基因片段做探针，与受体生物的基因组DNA进行杂交，如果有杂交斑点，根据分子杂交的基本原理，说明目的基因与受体细胞基因组DNA具有同源性，也就是说目的基因已经被导入受体细胞内，反之，则说明目的基因没有进入受体细胞中。 4、蛋白质分子（抗原抗体）之间的杂交 这是检测目的基
9、因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法是：第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，进行凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原一抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合。二抗抗体上带有特殊的标记，如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。【典型例题】类型一：目的基因的获取例1、以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人
10、类的生活。请回答下列问题。 （1）获得目的基因的方法通常包括_、_和_。 （2）构建基因文库时需要对DNA分子进行切割和连接，所使用的酶分别是_和_。 （3）PCR扩增目的基因的原理是_，前提条件是_，PCR所使用的酶是_，该酶具有什么特点？ （4）运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或_，后者的形状呈_。 （5）若目的基因是人胰岛素基因，则其获取的可能方法有_，将人胰岛素基因导入大肠杆菌和酵母菌，两者生产的胰岛素在功能和_序列上是相同的。【答案】（1）从基因文库获取 PCR技术扩增 人工合成（2）限制酶 DNA连接酶（3）双链DNA复制 有一段已知目的基因的核苷酸序列 DNA聚合酶 耐
11、高温（4）质粒 小型环状（5）从基因文库中获得、PCR技术扩增、人工合成 氨基酸【解析】（1）获取目的基因的方法有从基因文库中获取、PCR技术扩增目的基因和人工合成，其中基因文库包括基因组文库和部分基因文库。（2）构建基因文库需用限制酶切割某生物的DNA获取DNA片段，并与载体连接，导入受体茵群进行储存，所以还需用到DNA连接酶。（3）PCR技术是在生物体外扩增。DNA片段，原理是DNA双链复制。前提条件是有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据其合成引物。PCR技术用到DNA聚合酶，该酶必须在7075条件下发挥作用，故必须耐高温。（4）运送目的基因的载体常用的是质粒和病毒，质粒为小型环状DN
12、A分子。（5）人胰岛素基因序列已知，所以可用逆（反）转录法构建部分基因文库获得，可直接人工合成，也可用PCR技术扩增获得大量目的基因。【点评】本题考查目的基因的提取，需要同学们理解三种获取目的基因的方法。【举一反三】：【变式一】下列不属于获取目的基因方法的是（ ） A利用DNA连接酶复制目的基因 B利用DNA聚合酶复制目的基因 C从基因文库中获取目的基因 D利用PCR技术扩增目的基因【答案】A【解析】 目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。目的基因主要指编码蛋白质的结构基因，获取目的基因的方法有：（1）从基因文库中获取目的基因，基因文库又分为基因组文库和部分基因文
13、库；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）人工合成。类型二：基因表达载体的构建例2、科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导人棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子（抗虫基因首端），导人棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子（抗虫基因末端），再导人棉花受精卵，结果长成的植株有了抗虫能力。由以上过程推知，作为目的基因的运载体应具备的结构是（ ）。 A目的基因、启动子 B目的基因、终止子 C目的基因、启动子、终止子 D目
14、的基因、启动子、终止子、标记基因【答案】D【解析】本题考查基因表达载体的构建所需要的条件。【点评】本题属于信息材料题，考查同学们从中提取信息的能力。当然有了课上的基础，该题出来应该不成问题。 要点诠释：基因工程载体的构建主要考虑以下几方面的因素。 （1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。 （2）要选择强启
15、动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。（3）要选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。【举一反三】：【变式一】科学家已经能够通过基因工程的方法，能使番茄果肉细胞中含有人奶蛋白。以下有关该基因工程的叙述错误的是A采用反转录的方法得到的目的基因有启动子、终止子B用同种限制酶处理质粒和含目的基因的DNA，可产生相同的黏性末端而形成重组DNA分子C番茄的叶肉细胞可作为受体细胞D启动子对于目的基因在番茄的叶肉细胞中的表达是不可缺少的【答案】A【解析】反
16、转录法获取目的基因时，由于是根据氨基酸的序列推测基因中的碱基序列，因此，合成的基因中并不含有启动子、终止子。在基因工程中，必须用相同的限制酶处理质粒和目的基因的DNA，这样可产生相同的黏性末端以便能而形成重组DNA分子。基因工程中，常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等，因此番茄的叶肉细胞可作为受体细胞。在基因表达的过程中，启动子对于目的基因在番茄的叶肉细胞中的表达也能起一定的作用，是不可缺少的，它位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出信使RNA，最终获得所需的蛋白质，因此，只有A答案错误。启动子、终止子不属于结构基因，不能翻译出
17、蛋白质，因此，采用反转录的方法不能得到，但启动子、终止子是基因表达不可缺少的。类型三：将目的基因导入受体细胞例3、基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是（ ）A结构简单，操作方便B繁殖速度快C遗传物质含量少、简单D性状稳定，变异少【答案】B【解析】目的基因导入受体细胞后，随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌等微生物繁殖速度非常快。在很短的时间内就能获得大量的目的基因的产物。基因工程常用的受体有细菌、真菌、动植物细胞。解答这类题目的方法应结合受体细胞的特点回答。【举一反三】：【变式一】农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞采用最多的方法。下图为农杆菌转化法示意图，请据图回答问
18、题。 （1）Ti质粒多存在于细菌中，它是能自我复制的_。（2）获取外源基因（目的基因）需要限制酶的参与，而目的基因在重组过程中需要_酶的参与，并依据碱基原则进行重组。 （3）Ti质粒原存在于_中，其上的T-DNA具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的_上的特点，因此携带外源基因的DNA片段必须插入到_部位。 （4）首先必须经过组织培养，人工合成的培养基一般包括_、_、_、维生素等。由植物体细胞发育成完整植株的过程说明植物细胞具有_。 （5）农杆菌转化法适于将目的基因导入_和裸子植物，而不易于感染大多数_。 （6）若将相关的目的基因导入动物细胞或微生物细胞则常采用_和_。【答案】（1）小型环状D
19、NA分子 （2）DNA连接 互补配对（3）农杆菌细胞质 染色体DNA T-DNA片段（内部）（4）糖类 无机盐 植物激素 全能性 （5）双子叶植物 单子叶植物（6）显微注射技术 Ca2+处理法【解析】 将目的基因导入受体细胞的方法多种多样，应根据受体细胞的类型和目的基因的特点分别采用相应的方法。农杆菌转化法适于将目的基因导入植物细胞，而显微注射技术和Ca2+处理法分别适于将目的基因导入动物细胞和微生物细胞。类型四：目的基因的检测与鉴定例4、目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是：（ ）检测受体细胞是否有目的基因； 检
20、测受体细胞是否有致病基因 ；检测目的基因是否转录信使RNA ；检测目的基因是否翻译蛋白质A B C D【答案】C【解析】目的基因的检测包括：检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探针，使DNA探针与基因组DNA杂交。检测目的基因是否转录出了信使RNA，方法是用基因探针与信使RNA杂交。最后检测目的基因是否翻译了蛋白质，方法是进行抗原抗体杂交。【举一反三】：【变式一】利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是（ ）。 A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA C山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白【答案】D 【解析】 选项A只能说明抗虫基因已经导入；选项B只能检测目的基因导入并转录；选项C也只能检测到目的基因的导入；只有选项D能说明目的基因在受体细胞中已表达。